關(guān)于通過監(jiān)測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來評價口蹄疫疫苗純度的研究進(jìn)展

摘 要：口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄動物間傳播的A類烈性傳染病。大多數(shù)發(fā)展中國家一直都通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行，如何評價和控制口蹄疫疫苗質(zhì)量成為關(guān)鍵。OIE建議，通過監(jiān)測接種至少兩次口蹄疫疫苗的動物血清是否產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，來評價口蹄疫疫苗純度，從而為獸用生物制品廠家提供一種可供參考的質(zhì)控方法。總之，使用高效的新型疫苗并結(jié)合不同檢測方法，給預(yù)防和消滅FMD帶來希望。

關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白；口蹄疫疫苗；純度

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）04-0067-03

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄動物間傳播的烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）列為A類動物傳染病之首[6]?？谔阋卟≡强谔阋卟《?，屬微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthavirus），有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia 1型7個血清型，每個血清型又包含若干個亞型。該病毒不僅在各型間沒有交叉免疫性，同血清型的各亞型之間也僅有部分交叉免疫性[13]。該病傳播快、宿主范圍廣、發(fā)病率高，對畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成極大威脅。大多數(shù)亞洲、非洲、南美洲國家一直都通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行[7]。因此，使用高質(zhì)量安全有效的疫苗，是成功預(yù)防控制直至最終消滅FMD的先決條件。

1 口蹄疫滅活疫苗

從FMD疫苗的整個研究和應(yīng)用情況看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已經(jīng)被世界上許多國家摒棄；新型疫苗雖然取得一些非常有前途的結(jié)果，但在免疫效力和經(jīng)濟(jì)上目前難與常規(guī)疫苗競爭。常規(guī)滅活疫苗仍然是當(dāng)前FMD免疫控制采用的主要疫苗。

FMD滅活疫苗誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答，通常需要較大量的抗原，即疫苗的抗原含量直接決定了疫苗的質(zhì)量和免疫效果。低抗原含量意味著疫苗效力低和免疫持續(xù)期短，高抗原含量意味著疫苗效力高和免疫持續(xù)期長。

因此，在滅活疫苗特別是多價苗生產(chǎn)中，為了獲得高效的疫苗保證免疫效果，降低疫苗使用劑量，同時降低疫苗中非病毒蛋白引起的變態(tài)反應(yīng)，減少接種引起的有害反應(yīng)，利于病毒抗原和成品苗的貯存，便于免疫和感染的鑒別，就必須對病毒抗原進(jìn)行濃縮純化。

現(xiàn)在常用于大規(guī)模生產(chǎn)的純化濃縮方法是超濾和聚乙二醇（PEG）或聚乙烯氧化物（PEO）沉淀法和色譜柱過濾法等，不僅可以達(dá)到理想的濃縮倍數(shù)，還可大大降低抗原收獲物中非病毒蛋白成分及含量。用超濾法濃縮FMDV制備品的開拓者是Stro-hmaier。目前，在生產(chǎn)中用切向流超濾裝置或中空纖維過濾系統(tǒng)或震動篩進(jìn)行濃縮[14]。選擇質(zhì)量優(yōu)良的超濾系統(tǒng)是重要的，必須嚴(yán)格保證超濾系統(tǒng)的無菌，同時定期檢查和更換濾芯確保純化濃縮的效果。使用分子質(zhì)量為6 000（PEG 6M）的PEG（聚乙二醇）純化時，能夠充分去除來源于BHK疫苗中引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)。沉淀的抗原用低速離心法獲得，也可用助濾劑進(jìn)行沉淀抗原的過濾，如鈣化的硅藻土，比離心法方便的多[15]。滅活抗原也能用PEO沉淀法有效的沉淀。PEG沉淀可充分除去變應(yīng)原成分，PEO可使FMDV濃縮達(dá)1 000倍，從病毒收獲物中最少除去95 %的雜蛋白質(zhì)。

現(xiàn)代FMD滅活疫苗與其他動物衛(wèi)生方法合用，不但可以根除地方性FMD，還可以抵抗和清除發(fā)生在無FMD國家和地區(qū)的FMD，研究表明，疫苗可以迅速的減少接觸傳染，豬、牛、羊在接種3 d～5 d內(nèi)可產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答[16，17]。

FMD在亞洲、非洲、中東和南美洲的許多國家都有發(fā)生。絕大多數(shù)歐洲國家及部分南美洲國家或地區(qū)通過大量疫苗接種戰(zhàn)役，在20世紀(jì)后半葉完成了對FMD的控制，收到了顯著成效。疫苗接種被作為有效預(yù)防FMD的可靠手段，目前仍在廣泛應(yīng)用。例如，在有FMD流行的國家每年都要有計劃地免疫預(yù)防接種；受FMD威脅國家除進(jìn)行嚴(yán)格的進(jìn)口檢疫外，對邊境地區(qū)亦進(jìn)行定期的疫苗預(yù)防接種；無FMD流行或已消滅了FMD的國家在疫苗庫中也儲備了一定數(shù)量的戰(zhàn)備疫苗。構(gòu)建FMD疫苗庫的意義主要有兩個方面，一是已經(jīng)消滅FMD的發(fā)達(dá)國家以此生產(chǎn)應(yīng)急疫苗作為戰(zhàn)略儲備，應(yīng)對FMD突發(fā)事件；二是對有可能傳入的FMDV新的血清型儲備免疫防控用作戰(zhàn)略疫苗。因此，研制高質(zhì)量安全有效的疫苗并不斷改進(jìn)，不但是決定疫苗免疫效果的關(guān)鍵，也是成功預(yù)防控制直至最終消滅FMD的先決條件。

傳統(tǒng)滅活疫苗有良好的功效，但其也有如免疫期短、抗原譜窄、滅活不徹底或操作散毒的危險等不足之處?，F(xiàn)在，許多研究人員正在改進(jìn)和研究新的滅活疫苗生產(chǎn)工藝，使抗原更純，佐劑更有效，滅活更加可靠，通過篩選新的保護(hù)劑使疫苗的保存期更長。因此，純化濃縮的口蹄疫滅活疫苗在免疫動物后，動物主要產(chǎn)生抗病毒結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，不產(chǎn)生或少量產(chǎn)生病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。

2 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（Non Structural Protein，NSP）

口蹄疫滅活疫苗成分主要是口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白，也含有微量的非結(jié)構(gòu)蛋白（Non Structural Protein，NSP）?？谔阋卟《镜姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白——FMDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白是指除了衣殼蛋白1A、1B、1C、1D 和它們的前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白，包括成熟蛋白 L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及它們的前體[1]。FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC多聚蛋白是 NSP的組成部分，其合成后被快速裂解為3A、3B和3C。3A和3AB蛋白有疏水基團(tuán)，能把病毒錨定在生物膜上，便于 RNA合成。3B即VPg尿苷酸化后，作為RNA的合成引物。3C是蛋白酶，催化聚合蛋白的裂解。NSP 參與病毒的復(fù)制、多聚蛋白的裂解和病毒顆粒的組裝過程。其中L和3C能抑制宿主細(xì)胞的蛋白合成，在病毒蛋白的成熟裂解過程中作為蛋白酶裂解聚蛋白；2A為P1/2A間裂解提供識別序列；2BC、2C、3AB 和3CD形成復(fù)制復(fù)合物，為病毒RNA的合成創(chuàng)造條件，而且與裝配有關(guān)。與結(jié)構(gòu)蛋白相比，非結(jié)構(gòu)蛋白的變異較少，相對保守[2]?？谔阋邷缁钜呙缰械姆遣《镜鞍卓梢鹱儜B(tài)反應(yīng)，另外伴隨病毒增殖而產(chǎn)生的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對于動物感染源的鑒別亦帶來困難。

3 評價口蹄疫疫苗純度——監(jiān)測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體

OIE動物衛(wèi)生法典規(guī)定：在暴發(fā)后恢復(fù)無FMD狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)是，如果使用疫苗的話，應(yīng)檢驗接種疫苗動物的NSP抗體。同樣，無FMD和接種疫苗的國家，必須通過證明接種疫苗動物沒有由于感染產(chǎn)生的NSPs抗體。因此，應(yīng)當(dāng)純化可以在這些環(huán)境中使用的配方疫苗所使用的FMD抗原，以減少NSP含量。用現(xiàn)在的制造技術(shù)能夠去除大部分NSPs，為的是它們?nèi)绻械脑?，誘導(dǎo)一點點NSPs特異性抗體。在這些情況下，NSP抗體的檢測能夠提供接種疫苗動物已經(jīng)暴露于FMDV的證據(jù)?？傊兓瘽饪sFMD抗原，以減少NSP含量，同時降低疫苗中非病毒蛋白引起的變態(tài)反應(yīng)，是控制疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵步驟之一。

盡管現(xiàn)代疫苗生產(chǎn)的工藝已經(jīng)很高，但FMD疫苗仍含有痕跡量的NSP，免疫特別是多次重復(fù)免疫之后，痕跡量的NSP蛋白可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但除3D外，其他NSP抗體水平很低[3]。OIE建議，通過檢測接種至少兩次口蹄疫疫苗的動物血清，是否產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，來評價疫苗的純度[5]。OIE推薦的能夠使用的檢驗方法是：用含有最大數(shù)目的毒株和主管當(dāng)局允許的抗原量試驗疫苗的混合物接種不低于8頭幼稚牛。牛應(yīng)當(dāng)接種疫苗至少3次，間隔21 d～30 d，然后，在每次重復(fù)接種疫苗前檢驗，在最后一次接種疫苗后30 d～60 d，檢驗NSPs抗體。

非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）抗體檢驗，重組FMDV NSPs（如23A，3B，2B，2C，3ABC）表達(dá)的抗體用各種能夠通過不同的ELISA形式或免疫印跡來測量，即間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗（EITB）。這些ELISAs或用提純的抗原直接地吸附在微量板上，或用來自半-純化制品PAbs或MAbs來捕獲特異的抗原[8，10，11，12]。Panaftosa使用的篩選指數(shù)的方法已經(jīng)證明：其他的間接和競爭ELISA檢測牛3ABC抗體有相等的診斷性能的特性[9]。這個同樣的研究進(jìn)一步確證了來自Panaftosa初步的資料，這個資料表明：這些試驗的診斷性能的特性在牛、綿羊和豬上都是有相似的。EITB試驗在南美已經(jīng)廣泛地用作對在前文描述的標(biāo)準(zhǔn)篩選方法的確證試驗。更詳細(xì)的資料可以從泛美衛(wèi)生組織/世界衛(wèi)生組織（PAHO/WHO）Panaftosa OIE 參考實驗室獲得。美國率先推出了FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA診斷試劑盒，在許多國家和地區(qū)進(jìn)行區(qū)域性試驗，并在美國、阿根廷和中國臺灣省申請了專利。Bergmann用OIE參考方法3ABC-I-ELISA檢測臨床持續(xù)性感染牛和亞臨床感染牛的敏感性低于97 %，他分析這種現(xiàn)象與奶牛處于高免疫抗體水平的壓力、暴露于病毒的時間太短等因素有關(guān)[19]。因此，單一的NSP-ELISA在免疫牛群中檢測不到NSP抗體，并不能完全代表此牛群無攜帶者[21]。針對這種情況，各國學(xué)者提出了如下解決辦法：（1）配合使用3ABC-ELISA和EITB，前者用于篩查，后者用于確診[18，19]。（2）采用2種或2種以上ELISA方法以獲得臨床檢測上的高度敏感性和特異性[20]。（3）采取咽/食道分泌物（O/P液）進(jìn)行病毒分離和PCR檢測及檢測唾液IgA抗體綜合確診持續(xù)性感染動物[22]。（4）采用新型診斷技術(shù)如液相微陣列技術(shù)檢測多種NSP抗體[21]。

眾所周知，感染口蹄疫病毒動物的NSPs抗體為陽性[5]，免疫非純化疫苗也會產(chǎn)生NSPs抗體陽性，這種情況對區(qū)分感染與免疫造成干擾，同時影響免疫效果。國內(nèi)有研究通過實驗可以證明高度純化口蹄疫疫苗免疫動物后NSPs抗體為陰性[23]。因此，提高疫苗純化效果和相應(yīng)的NSPs抗體檢測方法結(jié)合使用，可以為將來區(qū)分感染與免疫群組提供數(shù)據(jù)支持，為口蹄疫防控及凈化起到積極作用。

綜上所述，疫苗生產(chǎn)廠家將“疫苗不誘導(dǎo)一個或一個以上NSPs的抗體，和能與相應(yīng)的診斷方法結(jié)合使用”成為研究目標(biāo)。高效滅活疫苗免疫動物體內(nèi)應(yīng)該沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，在現(xiàn)代疫苗加工過程中，2C、3A、3B和3C等非結(jié)構(gòu)蛋白應(yīng)被去除，因此免疫動物體內(nèi)不會產(chǎn)生針對NSP的抗體，只會誘導(dǎo)產(chǎn)生針對病毒衣殼蛋白的抗體?？傊?，不同檢測方法相結(jié)合并使用高效的新型疫苗，給預(yù)防和消滅FMD帶來希望[4]。

參考文獻(xiàn)：（23篇，略）