日糧中添加微生態(tài)制劑對斷奶仔豬生長性能、腸道健康和由F18+大腸桿菌引起的仔豬腹瀉的影響

摘 要：本研究旨在檢測F18+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）對新生斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響以及飼喂直接飼喂型微生物添加劑DFM（百猛靈，明星實驗室/美國飼料研究公司）對F18+ ETEC引起的斷奶仔豬腹瀉的影響。試驗選擇日齡和體重相近、健康狀況良好的三元雜交斷奶仔豬32頭（公母各半，體重6.99 kg±0.33 kg），隨機分成4組（2×2因子試驗）。試驗期25 d：分0～9 d和10 d～25 d兩個階段。第一影響因子：斷奶后第13天F18+ ETEC攻毒（0或2×109 CFU）；第二影響因子：DFM（第一、二階段添加量分別為0.15 %和0.10 %）。在第5、9、13、19和25天稱量斷奶仔豬體重和采食量。第2、3、5、9、12和13天檢測糞樣得分。第19和24天頸靜脈采血收集血液樣品。在第25天屠宰將所有仔豬處以安樂死并收集空腸、回腸和脾臟，檢測空腸、回腸和結(jié)腸內(nèi)容物的pH。血清和腸道組織用于檢測腫瘤壞死因子（TNFα）和丙二醛（MDA）。腸道組織用于組織學評價。結(jié)果顯示，E. coli口服攻毒后，空腸隱窩深度顯著降低（241 μm～221 μm），回腸隱窩深度顯著增加（255 μm～284 μm），糞樣分數(shù)顯著增加（0.45～1.03）。13 d～25 d的仔豬腹瀉數(shù)明顯增加1頭～6頭。DFM顯著可增加斷奶仔豬體重（11.8 kg～14.7 kg）、平均日增重（193 g/d～308 g/d）和平均日采食量（193 g/d～308 g/d），但對料重比無影響。DFM顯著增加了空腸隱窩深度。絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比值（VCR）的交互作用表明，當豬受E. coli攻毒后，DFM可進一步增加絨毛高度和VCR值。第19天的血清TNFα濃度顯示當豬只E. coli攻毒后DFM可進一步減少TNFα。由此可見，E. coli口服攻毒可增加仔豬腹瀉發(fā)生率，引起腸道形態(tài)的輕微改變。DFM可通過增加平均日增重和平均日采食量來改善生長性能。

中圖分類號：S816.79 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2016）04-0061-06

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本研究旨在研究日糧中添加DFM（百猛靈，明星實驗室/美國飼料研究公司）對斷奶仔豬生長性能、腸道健康和由F18+大腸桿菌引起的仔豬腹瀉的影響。

2 材料與方法

2.1 動物

試驗選用初始重6.99 kg±0.33 kg的32頭新斷奶三元雜交仔豬（公母各半），以2×2因子設(shè)計，隨機分到32欄。試驗仔豬隨機分為4個處理組，每個處理組8個重復(fù)。飼喂周期分為兩個階段：0～9 d飼喂第一階段日糧；10 d～25 d飼喂第二階段日糧。在第13天，16頭仔豬口服灌喂大腸桿菌。分別在0、5 d、9 d、13 d、19 d和25 d檢測體重和采食量。攻毒后每天檢測糞樣變化。

2.2 ETEC攻毒菌株

菌株選擇E. coli F18+ 2144和S1191。從水腫病豬中分離菌株S1191，從腹瀉仔豬中分離菌株2144。菌株培養(yǎng)依照Culter等的方法（濃度1×109 CFU）。我們以前的試驗已證明這種感染模式可以引起超過50 %的仔豬發(fā)生腹瀉，并且F18+ ETEC可在人和動物體內(nèi)通過常規(guī)病理生理機制誘導(dǎo)臨床疾?。–utler等，2007；McLamb等，2013）。

2.3 試驗日糧

本實驗中使用的DFM（百猛靈，明星實驗室/美國飼料研究公司）是含有1×108 CFU/g嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱雙歧桿菌和屎腸球菌的復(fù)合微生態(tài)制劑。日糧中DFM添加量根據(jù)飼喂階段的不同分別添加，第一階段（0.15 %）、第二階段（0.10 %）。試驗日糧根據(jù)2×2析因設(shè)計。第一影響因子：F18+ ETEC攻毒（0或2×109 CFU斷奶后13 d）；第二影響因子：DFM（0或1×108 CFU/g）。DFM與對照組日糧混合。整個試驗過程中，仔豬自由采食及飲水。營養(yǎng)物質(zhì)濃度達到NRC標準，計算結(jié)果見表1。

2.4 樣品收集

在第19天和24天通過采集頸靜脈放血，用不含抗凝劑的真空采血管采集血液樣品℃。血液通過離心（3 000 g×15 min，4 ℃）后獲得血清，并將其保存于-80 ℃，以用于后期MDA和TNFα的檢測。在第25天，所有豬通過電擊安樂死，取其胃腸道并分割小腸，然后取空腸和回腸中段，用蒸餾水沖洗，一半用于10 %甲醛-磷酸溶液固定，保存用于觀察黏膜形態(tài)；一半切開用于刮腸道黏膜層，保存至離心管液氮冰凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃，用于MDA和TNFα濃度的檢測。同時收集一管空腸、回腸和結(jié)腸的消化物（50 mL），立即使用酸度計檢測消化物pH。將消化物直接放于冰上然后存儲在-20 ℃。脾臟重量也是反映促炎性細胞因子（例如：TNFα和白介素）表達情況的指標（Touchette等，2002）。

2.5 糞樣評分和腹瀉率

糞樣評分在第2、3、5、9、12和13天檢測并在13 d后每日檢測。糞樣評分采用一致性評價：0 正常；1 輕度；2 中度；3 嚴重。糞便得分≤1認為沒有腹瀉（Ronald等，1999）。連續(xù)兩天保持糞樣得分大于1認為是腹瀉發(fā)生（Liu等，2008）。試驗中記錄了13 d～19 d、19 d～25 d、13 d～25 d發(fā)生腹瀉的豬只數(shù)。

2.6 小腸形態(tài)

兩段小腸片段被送至北卡羅萊納州立大學組織病理學實驗室進行檢測用蘇木精和伊虹染色成多聚賴氨酸載玻片，并用搭載Olympus Van-ox S纖維鏡頭的SONY CD彩色攝像機進行檢測。計算絨毛高度（從絨毛頂端到絨毛隱窩連接處），絨毛寬度（絨毛高度中間處的寬度）和隱窩深度（絨毛隱窩連接處到隱窩根部）。檢測每個載玻片上10個完整絨毛長度和相應(yīng)的隱窩深度。另一工作人員完成所有的小腸形態(tài)學分析。

2.7 細胞因子檢測

血清和黏膜TNFα的濃度的檢測?？漳c和回腸黏膜在含蛋白酶抑制劑的PBS溶液中混合均勻，其上清液通過BCA檢測（Peace等，2011）蛋白質(zhì)含量。上清液和血清TNFα用豬TNFα ELISA試劑盒檢測來顯示炎癥和急性反應(yīng)。簡單來說，就是將50 μL的檢測稀釋液和 50 μL的標準液或樣品加入到含有包被抗體和生物素抗體反應(yīng)劑的微板孔中，用辣根過氧化物酶、三甲基苯底物和0.18 M的H2SO4終止液進行檢測。用酶標儀檢測450 nm和540 nm的吸光值，并用KC4數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。TNFα的檢測限制為5 pg/mL。

2.8 氧化損傷檢測

TBARS試劑盒檢測血清和黏膜MDA含量，指示脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。所有試驗流程根據(jù)試劑盒廠商說明書進行操作。血清和黏膜中的MDA含量分別用μmol/L和μmol/g表示。

2.9 數(shù)據(jù)分析

本研究采用2×2析因隨機完全區(qū)組設(shè)計實驗方法。出生重和性別為區(qū)組，第一影響因子：F18+ ETEC；第二影響因子：DFM。一頭豬代表一個試驗單位，不腹瀉豬的數(shù)據(jù)采用SAS軟件的混合程序進行分析處理，腹瀉豬數(shù)據(jù)采用SAS軟件的卡方檢驗進行分析處理。P≤0.05差異顯著，P在0.05～0.10之間具有明顯趨勢。

3 試驗結(jié)果

3.1 生長性能

從表2可以看出，仔豬初始重無明顯差異。整個飼養(yǎng)期，仔豬體重未受E. coli影響。添加DFM，無E. coli組和E. coli組9 d～ 13 d仔豬體重分別增加了13.7 %（P<0.05）和8.4 %（P<0.05）；第13～19天分別增加了20.1 %（P<0.05）和17.6 %（P<0.05）；第19～25天分別增加了28.8 %（P<0.05）和20.1 %（P<0.05）。

整個飼養(yǎng)期，仔豬平均日增重未受E. coli影響。DFM對0～9 d和0～13 d 的平均日增重無影響，但添加DFM組中，無E. coli組和E. coli組9 d～13 d的平均日增重分別增加了104.1 %和131.4 %；13 d～25 d的平均日增重分別增加了58.5 %和44.7 %。整個飼養(yǎng)期，添加DFM組中，無E. coli組和 E. coli組分別增加了71.4 %和47.9 %。

整個飼養(yǎng)期，仔豬平均日采食量未受E. coli影響。DFM對0～13 d平均日采食量無影響，但提高了后期平均日采食量，在添加DFM組中，無E. coli組和E. coli組13 d～19 d的平均日采食量分別增加了54.3 %和41.3 %；19 d～25 d的平均日采食量分別增加了43.4 %和39.7 %；13 d～25 d的平均日采食量分別增加了47.7 %和40.5 %；整個飼養(yǎng)期，添加DFM后平均日采食量分別增加了49.0 %和29.0 %。整個飼養(yǎng)期，E. coli和DFM對料肉比無影響。

3.2 糞樣得分和腹瀉發(fā)生率

從表3可以看出，E. coli攻毒后顯著提高了糞便平均評分。無DFM組和DFM組 13 d～19 d的糞便平均評分別顯著提高了358.1 %（P<0.05）和159.1 %（P<0.05）； 19 d～25 d的糞便平均評分分別顯著增加了40.8 %（P<0.05）和232.1 %（P<0.05）。整個攻毒期，無DFM組和DFM組糞便平均數(shù)分別顯著增加了166.0 %（P<0.05）和178.9 %（P<0.05）。整個飼養(yǎng)期，無DFM組和DFM組糞便平均評分分別顯著增加了174.4 %（P<0.05）和92.2 %（P<0.05）。攻毒前，DFM組顯著降低了0～9 d糞便平均評分（分別為0.88和0.86對比0.25和0.63）；但是，DFM組顯著提高了 9 d～13 d糞便平均評分（分別為0.38和0.14對比0.83和0.50）。

口服攻毒E. coli顯著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d仔豬腹瀉數(shù)，此外，也使19 d～25 d仔豬腹瀉只數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢。

從表4可以看出，13 d～19 d和13 d～ 25 d，E. coli口服攻毒后顯著（P<0.05）增加了13 d～19 d和13 d～25 d腹瀉仔豬數(shù)，19 d～25 d仔豬腹瀉只數(shù)有增加的趨勢。

3.3 組織學評價

從表5可以看出，E. coli顯著降低了空腸隱窩深度，無DFM組和DFM組分別降低了8.4 %和8.0 %，且有降低絨毛高度的趨勢（P=0.052）；E. coli顯著降低了回腸隱窩深度，無DFM組和DFM組分別降低了3.7 %和19.6 %（P<0.05）。DFM顯著增加了空腸隱窩深度，無 E. coli組和E. coli組分別增加6.6 %和7.3 %（P<0.05）。E. coli和DFM交互作用顯著影響空腸絨毛高度和VCR，當豬用E. coli攻毒后，DFM可進一步增加其水平； E. coli和DFM交互作用存在影響回腸隱窩深度的趨勢，當豬用E. coli攻毒后，DFM可進一步增加其水平。

3.4 炎癥因子和氧化損傷

從表6可以看出，在攻毒6 d后， E. coli和DFM交互作用可顯著影響血清TNFα的水平，當豬用E. coli攻毒后，DFM可進一步降低其水平。

3.5 內(nèi)容物pH和器官重量

從表7可以看出，E. coli和DFM交互作用有改善空腸內(nèi)容物pH的趨勢，當豬只 E. coli攻毒后，DFM可進一步增加空腸內(nèi)容物pH水平。

4 結(jié)論

基于本研究結(jié)果，口服攻毒F18+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌會提高仔豬腹瀉的發(fā)生率，但不會影響其生長性能。添加DFM能夠改善豬的平均日增重和平均日采食量，同時能增加空腸的隱窩深度。但是，本試驗沒有研究添加DFM提高平均日采食量的原因，這有待于進一步的深入研究。

原題名：Efficacy of Dietary Inclusion of Direct-fed Microbial Sin Preventing Post-weaning Diarrhea Caused by F18-positive E. coli in Pigs（英文）

原作者：Sung Woo Kim博士和Yawang Sun碩士研究生助理（北卡羅來納州立大學動物科學系）