日糧蛋白水平對豬糞惡臭化合物及細菌生態(tài)的影響

中圖分類號：S828 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）06-0051-02

集約化畜牧生產(chǎn)體系具有確切的經(jīng)濟效益，但也產(chǎn)生諸多負面影響，尤其是惡臭和畜禽廢棄物處理。臭味產(chǎn)生受到豬舍類型和糞便處理系統(tǒng)的影響，大多數(shù)豬舍都為開放式通風（占總豬舍的76 %）和漏縫地板系統(tǒng)（占全部糞便處理系統(tǒng)的52 %），豬糞和污染地面不斷釋放出惡臭氣味。

惡臭氣味主要是由豬胃腸道和糞便飼料殘渣、內源生成物及死亡腸道細菌通過厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生。有230多種成分會產(chǎn)生惡臭，主要分為4類：1）含硫化合物，2）酚和吲哚化合物，3）揮發(fā)性脂肪酸，4）氨和胺類，可通過測定惡臭化合物的濃度和氣味活性值（OAV）得出的臭氣強度進行歸類。碳水化合物分解代謝為短鏈脂肪酸（SCFA）、CO2、H2和CH4，蛋白質則可代謝為短鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸（BCFA）、酚、吲哚、硫、氨和胺，因此惡臭化合物主要是通過蛋白質降解過程產(chǎn)生，大量日糧蛋白進入到胃腸道中（大約每天12 g～18 g），腸上皮細胞、酶和死細菌等內源性蛋白源也會導致惡臭化合物形成。攝入的氮大約有70 %排出體外，為細菌發(fā)酵提供營養(yǎng)來源，并導致惡臭化合物生成。

豬的胃腸道和糞便中存在數(shù)千種細菌。其中擬桿菌、梭菌、丙酸菌、梭桿菌、鏈球菌和乳桿菌在蛋白質代謝調節(jié)中發(fā)揮作用，這些細菌及其代謝產(chǎn)物對日糧蛋白的精確影響機制仍不清楚。焦磷酸測序等新型分子技術對確定豬糞微生物菌群特征非常有效。本研究應用這些技術分析不同日糧粗蛋白水平對豬糞惡臭化合物濃度的影響，以及豬糞中惡臭化合物與菌群之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 試驗設計、動物與日糧

動物試驗方案得到了國家動物科學研究所動物關愛和使用委員會的審核和批準。試驗對生長豬飼喂不同水平粗蛋白（20 %、17.5 %、15 %，飼料營養(yǎng)成分見表1）后糞便惡臭化合物組成和菌群情況進行研究。48頭公豬【（長×大）×杜洛克】隨機分為3個粗蛋白水平組，每個處理4窩，每窩4頭，平均初重（BW）為45 kg。每窩均在豬舍漏縫地板下設置獨立的儲糞坑。通過室內溫度和濕度自動控制器調節(jié)豬舍通風速度，豬舍平均溫度和相對濕度分別保持在20 ℃～25 ℃和60 %。飼料喂食量為體重的5 %，每天飼喂2次。試驗前有10 d的適應期，開始集糞前清洗儲糞坑。

1.2 糞便收集與惡臭化合物分析

糞便收集：本研究所有處理組的樣品采集均在相同條件下進行。試驗為期1個月，每周分別采集各窩糞便樣品，并儲存于冰箱中（-20 ℃）。氣相色譜法（GC）測定揮發(fā)性脂肪酸、酚和吲哚等惡臭化合物含量。

揮發(fā)性脂肪酸：5 mL糞便樣品與1 mL 25 %的偏磷酸溶液及0.05 mL飽和氯化汞溶液混合，置于15 mL試管中?；旌先芤涸? 000 rpm、20 ℃下離心20 min，取1 mL上清液轉移至1.5 mL試管。然后將上清液在12 000 rpm下離心10 min，并通過0.2 μm的過濾器。濾液轉移至2.0 mL GC小瓶，氣相色譜法（6890N，HP-INNOWax柱，F(xiàn)ID檢測器）分析揮發(fā)性氣體濃度。溫度設定：80 ℃ 2 min， 20 ℃/ min的速度升溫至120 ℃，10 ℃/min升溫至205 ℃，保持2 min。進樣口和檢測口的溫度保持在250 ℃。進樣量為0.2 μL，分流比10∶1。

酚和吲哚：糞便樣品在20 ℃、4 000 rpm下離心20 min。取4 mL上清液，與4 mL氯仿和60 μL 4 M氫氧化鈉溶液混合，置于20 mL玻璃小瓶中?；旌先芤涸?0 ℃、4 000 rpm下離心20 min，將氯仿層移至2.0 mL GC小瓶中，氣相色譜法（6890N， DB～1柱，F(xiàn)ID檢測器）分析酚類和吲哚類化合物。柱溫溫度設定：40 ℃保持5 min， 20 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持2 min。進樣口和檢測口的溫度保持在250 ℃。進樣量為2.0 μL，分流比5∶1。

1.3 菌群分析

用于bar-coded焦磷酸測序的PCR擴增：按制造商說明使用快速DNA提取試劑盒從糞便樣品中提取總基因組DNA。使用Power-Clean DNA抑制因子去除試劑盒除去腐殖酸等干擾成分。使用引物組擴增含V1～V3可變區(qū)、大約500 bp～700 bp的細菌16S rRNA基因。PCR擴增條件是開始95 ℃ 5 min預變性，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s及72 ℃ 30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃ 7 min循環(huán)1次。

焦磷酸測序和數(shù)據(jù)分析：使用454 FLX高通量測序系統(tǒng)進行焦磷酸測序。使用EzTaxon-e 數(shù)據(jù)庫、強大的全球成對測序比對及BLASTN搜索工具（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/BLASTN）進行細菌高質量reads的分類分配。未能與EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫匹配的序列（>97 %）進行二次處理，使用UCHIME程序檢查嵌合序列。使用CD～HIT程序在97 %相似度水平生成操作分類單元（OTU）。采用Mothur程序包計算香農多樣性指數(shù)、Chao1豐度指數(shù)和Goods庫覆蓋率。

2 統(tǒng)計分析

使用SAS一般線性模型過程對惡臭化合物數(shù)據(jù)進行完全隨機化設計方差分析。使用鄧肯氏多重比較進行差異顯著性分析，Pearson相關系數(shù)進行惡臭化合物濃度和細菌種類豐度關系分析。所有測定變量的顯著性水平為P<0.05。

未完待續(xù)

原題名：Effect of Dietary Protein Levels on Composition of Odorous Compounds and Bacterial Ecology in Pig Manure （英文）

原作者： Sungback Cho（韓國農村發(fā)展局國家動物科學研究所）