生物轉(zhuǎn)化中藥的研究思路淺論

張衛(wèi)紅 彭安堂

(河北省石家莊市中醫(yī)院藥學部，河北 石家莊 050051)

生物轉(zhuǎn)化中藥的研究思路淺論

張衛(wèi)紅 彭安堂1

(河北省石家莊市中醫(yī)院藥學部，河北 石家莊 050051)

中藥；生物轉(zhuǎn)化；研究思路

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥療效的提升成為人們關(guān)注的焦點。在中藥資源不斷減少，療效不斷降低的今天，生物工程技術(shù)應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，將成為未來擴大中藥資源、提高中藥療效的有力手段。但是，目前中藥生物工程技術(shù)研究的重點還是單味藥及其化學成分的變化等方面，復(fù)方的研究還處于探討階段。我們通過總結(jié)整理中醫(yī)藥生物工程技術(shù)的研究現(xiàn)狀，提出以中醫(yī)藥整體觀念研究中藥復(fù)方發(fā)酵的思路及方法，為這項研究提供一些思路。

1 中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究現(xiàn)狀

生物技術(shù)包括細胞工程、發(fā)酵工程、酶和蛋白質(zhì)工程、基因工程共4個方面?，F(xiàn)代中醫(yī)藥生物工程技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了二三十年，取得了很多研究成果，主要包括以下2個方面。

1.1 單味中藥的化學成分變化研究 目前大多數(shù)中醫(yī)藥生物技術(shù)研究都集中到了中藥化學成分變化方面。按化學反應(yīng)類型概括起來主要有[1]：①羥基化反應(yīng)，烯丙位C=C雙鍵的羥基化反應(yīng)區(qū)域選擇性和立體選擇性較強；②糖基化反應(yīng)，主要有2種：一是羧酸和糖片段之間發(fā)生酯化反應(yīng)，一是羥基和糖片段之間發(fā)生糖基化反應(yīng)；③氧化還原反應(yīng)，包括醇與酮之間的轉(zhuǎn)化、羰基的還原、環(huán)氧化作用及C=C雙鍵的還原等。按研究的生物轉(zhuǎn)化化學成分類別主要有：蟾蜍甾烯類的蟾毒；萜類化合物的紫杉醇、斑蝥素、青蒿素、木香烯內(nèi)酯類及雷公藤二萜類等；生物堿類的左旋四氫巴馬汀、吳茱萸堿、麻黃堿及野罌粟堿；苷類的天麻素、人參皂苷、七葉皂苷、熊果苷、甘草酸苷等；醌類的大黃素；黃酮類的柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷及木犀草素等[2-3]。

1.2 菌種選育研究 很多學者從不同的中藥品種角度或從不同的微生物菌種角度做了很多研究。研究紅曲的過程中開發(fā)了新藥洛伐他汀[4]；吳虹麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉、米曲霉、黑曲霉、黑根霉、桔青霉及辣椒炭疽菌6種真菌具有轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的能力。在人參生物轉(zhuǎn)化研究中，很多學者研究了不同的菌種如：Dong等[6]研究了黑曲霉菌(aspergillus niger)和藍色梨頭霉(absidia coeruleavar.saccardoi)；崔宇等[7]研究了鐮刀霉屬霉菌(fusarium spp.)；Chi H等[8]研究了德氏乳桿菌(lactobacillus)和雙歧桿菌(bifidobacteria)；韓穎等[9-10]研究了甘蔗鐮孢(fusarium sacchari)；吳秀麗等[11]研究了疣孢漆斑菌(myrothecium verrucaria)；昆明諾唯金參生物工程有限責任公司[12]研究了弗氏鏈霉菌(streptomyces fradiae)；趙鵬[13]研究了哈茨木霉(trichoderma harzianum)；浙江大學發(fā)表專利研究了芽孢桿菌(bacillu)[14]；云南大學發(fā)表專利研究了米曲霉[15]；趙鵬等[16]研究了木霉屬4株、曲霉屬1株、節(jié)叢孢屬1株；韓穎等[17]研究了鐮刀霉屬霉菌(fusarium spp.)。關(guān)于菌種方面的研究方興未艾，很有研究價值。關(guān)于單味藥的化學成分變化研究成果很多，主要集中在提高提取率、提高有效成分含量、提高利用度、降低毒副作用等方面，在此不再贅述。

2 目前生物轉(zhuǎn)化研究存在的問題

目前，生物轉(zhuǎn)化還存在很多值得探討的問題。首先是菌種選育成功率較低，生物轉(zhuǎn)化可選用菌種雖然很多，酶系廣，但從中選出合適的菌種并不容易。菌種選育、誘變育種及基因工程育種是一項非常龐大的工程，選育菌株帶有很大的偶然性，想選育出一株選擇性強的適合特定反應(yīng)的菌株，工作量很大，成功率很低。即使選出了特定菌株，其產(chǎn)率往往也很低，雖然優(yōu)化培養(yǎng)條件可使產(chǎn)率提高，但是顯著提高產(chǎn)率并不容易。非常典型的例子是青霉素的發(fā)酵，經(jīng)過幾代人的努力，不斷地選育菌種、優(yōu)化發(fā)酵工藝，才達到現(xiàn)在的生產(chǎn)水平。其次是中藥生物轉(zhuǎn)化大部分還停留在實驗室研究階段，雖然個別品種進入了臨床階段，但生物轉(zhuǎn)化中藥對臨床的影響力較小，進一步開發(fā)及臨床應(yīng)用還有很長的路要走。第三是從事中醫(yī)藥生物轉(zhuǎn)化工作的大多數(shù)是藥學人員，缺少中醫(yī)臨床醫(yī)師的參與，目前的研究基本上都停留在單味藥的研究上，中醫(yī)藥在應(yīng)用的時候大部分都是復(fù)方，目前對復(fù)方的研究很少，距離臨床應(yīng)用就更遠了。因此，中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究目前最大的問題是其與中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用的脫節(jié)。

3 中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究的思路探討

3.1 以療效為準繩評價生物轉(zhuǎn)化中藥 中醫(yī)藥概念的核心在于以“中醫(yī)藥理論體系”為指導(dǎo)，以整體觀念為主體的中醫(yī)理、法、方、藥學術(shù)理論體系與中醫(yī)臨床實踐的統(tǒng)一。以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，研究經(jīng)過生物工程技術(shù)加工后的單味中藥或復(fù)方的功效、藥性、歸經(jīng)、配伍、炮制、毒性、體內(nèi)過程，以觀其藥效并研究其作用機制。這一從實踐到理論的分析方法貫穿了中醫(yī)的發(fā)展過程。中醫(yī)藥理論是綱，臨床應(yīng)用是目的，生物工程技術(shù)是方法和手段，不能脫離了中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)而孤立地搞中醫(yī)藥生物工程技術(shù)。在機制短時期內(nèi)無法搞清的情況下，還應(yīng)以療效為準繩評價生物轉(zhuǎn)化中藥。

3.2 基于中醫(yī)整體觀念提出的生物轉(zhuǎn)化中藥的研究思路 我們建議以全成分復(fù)方研究及藥理模型作為主要研究思路。研究流程如下：第1階段以中醫(yī)藥理論及臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)確定研究品種；第2階段中醫(yī)藥生物工程技術(shù)處理；第3階段藥理模型篩選、急毒長毒等動物實驗；第4階段轉(zhuǎn)化物或其提取物應(yīng)用于醫(yī)藥實踐研究及中醫(yī)藥理論評價；第5階段轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、化學成分變化研究及轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)研究。

3.2.1 確定哪些中藥或復(fù)方適合應(yīng)用生物工程技術(shù)需要結(jié)合中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用。臨床應(yīng)用是出發(fā)點也是歸宿，臨床上應(yīng)用的多是復(fù)方，藥物療效是多成分多靶點共同作用的結(jié)果。以中醫(yī)整體觀念看待中藥復(fù)方，選擇療效確切的復(fù)方進行生物轉(zhuǎn)化研究，以療效為標準來考究生物技術(shù)應(yīng)用的最終結(jié)果。故提出中醫(yī)藥生物工程技術(shù)的研究應(yīng)該以復(fù)方為主，單味藥為基礎(chǔ)。

3.2.2 建立中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下融合現(xiàn)代藥理學、生理學方法的快速、高效、廉價的藥物篩選模型是中醫(yī)藥生物工程技術(shù)能否成功的重要因素。中醫(yī)的“病”和“證”是與現(xiàn)代醫(yī)學的“疾病”和“癥狀”不同的概念。中藥所用藥理模型主要有3類：中藥藥理疾病動物模型、中藥藥理證候動物模型、中藥藥理病證動物模型。疾病動物模型借鑒西方醫(yī)學中的方法比較成熟，可用模型多，造模方法穩(wěn)定，實驗結(jié)果可靠，重復(fù)性好，與現(xiàn)代醫(yī)學研究結(jié)果有可比性。同時也必須提到高通量篩選，現(xiàn)在已經(jīng)進入后基因組時代，基于靶點的高通量篩選已經(jīng)成為藥物開發(fā)計劃中重要的一個部分。隨著組合化學、基因組學及蛋白組學的飛速發(fā)展，一方面功能基因組計劃有助于快速地確定一些特定路徑中的蛋白—蛋白相互作用，另一方面各種高通量的篩選系統(tǒng)能夠針對特定靶點進行高效快速的化合物分子庫篩選。中藥的篩選模型也可以借助高通量篩選的途徑。中藥復(fù)方的生物工程技術(shù)目前報道研究得非常少，以下是幾例比較系統(tǒng)的報道：陳冰等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)桂枝湯及其生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物對白細胞介素(IL)-1β刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3)合成細胞前列腺素的代謝酶系統(tǒng)有不同程度的抑制作用，從而降低了前炎癥介質(zhì)和中樞發(fā)熱介質(zhì)PGE2的釋放和分泌。王月飛等[20]、王玉閣等[21]研究了米曲霉(AS3.951)對玉屏風散的生物轉(zhuǎn)化，并研究了其轉(zhuǎn)化液一系列的生理作用，如提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能；對正常小鼠抗氧化功能及免疫抑制小鼠T細胞亞群、細胞因子IL-4和細胞因子γ-干擾素(IFN-γ)的影響；對免疫抑制小鼠細胞免疫的干預(yù)作用；對免疫抑制小鼠血清IL-2的影響等。發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的玉屏風散生物轉(zhuǎn)化液比玉屏風散煎劑更能提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能。在中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用的指導(dǎo)下選擇臨床上需要、理論上可行、技術(shù)上可操作的品種進行生物轉(zhuǎn)化的研究，楊秀偉等[22]建立了人腸內(nèi)細菌轉(zhuǎn)化中藥化學成分的模型和標準操作規(guī)程，用于研究和評價中藥化學成分在腸內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化。將原形化合物與其建立的中藥化學成分腸吸收細胞模型人結(jié)腸腺癌細胞系(human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2)串聯(lián)，能夠探討真正吸收進入體循環(huán)的化學實體和它們在腸吸收過程中的相互作用，并串聯(lián)肝臟藥物代謝酶細胞色素P450模型，使中藥化學成分體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化和(或)代謝研究一體化。

以上各項研究通俗地講就是應(yīng)用中藥藥理疾病模型，以藥理作用、動物實驗療效觀察為主線的研究。有藥理作用的生物轉(zhuǎn)化中藥就需要用中醫(yī)藥理論進一步解釋這種作用。轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、化學成分變化研究及轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)研究，都是希望進一步揭示其作用機制。這就是實踐到理論的研究方法，同時是在中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)上的創(chuàng)新，尊古不泥古，創(chuàng)新不唯新，醫(yī)學可以分中醫(yī)、西醫(yī)，可以分不同的學術(shù)流派，可以有大相徑庭的治療方法和理論解釋，但是所有醫(yī)藥學的宗旨都是一致的，為了人類身心健康，所有醫(yī)藥學的對象都是相通的，以疾病為主體，所有醫(yī)藥學的評價標準都是一致的，即治療效果好。目前歐美西方醫(yī)學大行其道，不但在西方而且在全球都處于絕對領(lǐng)先的地位，因為其理論和療效清晰、準確。而中醫(yī)、印度傳統(tǒng)醫(yī)學、泰國醫(yī)學等國家本土醫(yī)學在本國也處于非主流地位，原因比較復(fù)雜，其深層次原因是理論和實踐創(chuàng)新不夠，沒能跟上時代科學技術(shù)的步伐，沒能將現(xiàn)代科技的發(fā)展成果吸收進來。中醫(yī)藥理論也應(yīng)該深入到分子水平，細微化到微米、納米級別，也可以將循證醫(yī)學的思路、方法吸收到中醫(yī)藥理論中來，哈佛大學醫(yī)學院前院長Charles Sidney Burwell曾說過：在10年內(nèi)，作為醫(yī)學生你們學到的一半知識都會被證明是錯誤的，而且麻煩的是沒有老師能夠告訴你們哪一半是錯誤的。西方醫(yī)學能發(fā)展得如此之快，與其開放的學風，兼收并蓄的理念不無關(guān)系。

3.2.3 最后一個階段為研究化學成分變化，酶的性質(zhì)及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。為了更加準確地從藥學的角度研究其作用機制及上升到理論高度。這也是目前生物轉(zhuǎn)化研究較多的方面?；瘜W成分變化的研究隨著分離技術(shù)的日益成熟，人們已經(jīng)從中藥中分離純化出數(shù)以萬計的活性化合物，其中許多化合物被成功地開發(fā)成為藥物，諸如利血平、地高辛、青蒿素、麻黃堿、紫杉醇等。研究方法采用天然藥物化學的研究方法如：層析技術(shù)、吸附技術(shù)、離子交換技術(shù)、溶媒萃取技術(shù)、色譜分析制備、紅外線、紫外線等光譜分析、X-衍射、質(zhì)譜、核磁等技術(shù)，尤其是核磁中的氫譜、碳譜、二維譜的應(yīng)用使結(jié)構(gòu)分析越來越清晰。生物轉(zhuǎn)化方法主要包括：分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法；靜止細胞轉(zhuǎn)化法；應(yīng)用微生物孢子進行生物轉(zhuǎn)化法，此方法空白背景干擾小，生物轉(zhuǎn)化活力較高；應(yīng)用固定化細胞進行生物轉(zhuǎn)化法，此方法可以反復(fù)使用，具有產(chǎn)物提取簡單，便于自動化和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢；應(yīng)用滲透細胞進行生物轉(zhuǎn)化法，此方法適合于胞內(nèi)酶作用的生物轉(zhuǎn)化；利用酶進行生物轉(zhuǎn)化法，此方法具有專一性強的特點。生物轉(zhuǎn)化本質(zhì)上是一個酶促反應(yīng)，它受到諸多因素的制約，如轉(zhuǎn)化時間、溫度、底物添加方式、酶的誘導(dǎo)劑、抑制劑以及生長調(diào)節(jié)劑的加入都對轉(zhuǎn)化有一定的影響[2]。這就需要采用正交實驗等方法優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件。對生物酶的研究多采用生物基因技術(shù)的方法如：透析、超濾、柱層析、電泳、克隆、表達等，并發(fā)現(xiàn)了許多優(yōu)良的新酶，這些酶大多具有可以催化一系列的底物，并且擁有區(qū)域選擇性或立體選擇性的催化特性。在酶催化的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中如酯酶、蛋白酶、脂肪酶等水解酶[23]。硫酸酯酶可以立體選擇性和對映體選擇性地催化水解仲烷基硫酸酯，并通過改變其構(gòu)象從而產(chǎn)生純手性的化合物[24]。鹵代醇脫鹵酶可以催化多種非天然親核性底物[25]。在水介質(zhì)中，裂解酶可以催化偶姻或苯偶姻反應(yīng)從而產(chǎn)生非對稱的碳-碳鍵[26]。還有可用酶催化手性化合物的方法，消旋體的方法等。

小結(jié)以中醫(yī)整體觀念的思想研究生物轉(zhuǎn)化的中藥，使之更加緊密地與臨床相結(jié)合，利于有的放矢地開展研究。采用從臨床到實驗室，與現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合，進一步觀察新產(chǎn)品的療效，從而回到臨床，根據(jù)療效探究其生物轉(zhuǎn)化中藥的機制。提倡將現(xiàn)代醫(yī)藥學發(fā)展的新思路、新技術(shù)引入中醫(yī)藥發(fā)展領(lǐng)域，提倡對實驗事實的尊重與對傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的傳承與創(chuàng)新。

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(本文編輯：李珊珊)

張衛(wèi)紅(1963—)，女，副主任中藥師，學士。研究方向：中藥鑒別、中藥房的管理。

R28；R9-13

A

1002-2619(2014)11-1745-03

2013-11-14)

1 河北省石家莊市中醫(yī)院制劑室，河北 石家莊 050051