擴散加權MRI活體評價外源野生型P53逆轉SW480/5-FU人類結腸癌效果

謝琦，吳敏儀，楊逸銘，張鼎旋，雷正賢，張靜，許進，鐘維德

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擴散加權MRI活體評價外源野生型P53逆轉SW480/5-FU人類結腸癌效果

謝琦1*，吳敏儀1，楊逸銘1，張鼎旋1，雷正賢1，張靜4，許進2，鐘維德3

[摘要]目的 探索擴散加權MRI (DWI)活體評價rAd/p53逆轉耐5-FU結腸癌SW480/5-FU對5-FU耐藥性效果的可能性。材料與方法 100只結腸癌SW480/5-FU荷瘤裸鼠隨機分成4組，對照組、5-FU組、rAd/p53組、rAd/p53+5-FU組。各組在治療后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分別隨機取5只荷瘤鼠行DWI檢查，隨后處死荷瘤鼠，切下腫瘤檢測腫瘤細胞凋亡(TUNNEL法)。結果 rAd/p53組與rAd/p53+5-FU組在觀察時間點腫瘤ADC值均較對照組增加，與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；rAd/p53組與rAd/p53+5-FU組在觀察時間點腫瘤凋亡較對照組增加；rAd/p53+5-FU組在觀察時間點腫瘤腫瘤凋亡和ADC值較rAd/p53組高。ADC值與腫瘤凋亡呈正相關。結論 ADC值能活體評價外源野生型p53逆轉SW480/5-FU耐藥性早期療效。

[關鍵詞]基因，p53；結腸腫瘤；氟尿嘧啶；彌散磁共振成像；動物實驗

廣東省自然科學基金(編號：2015A03 0313732)

作者單位：

1.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院 廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學影像科，廣州 511457

2.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院病理科，廣州 510180

3.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院臨床分子醫(yī)學及分子診斷實驗室，廣州 510180

4.中山大學腫瘤防治中心病理科，廣州 510180

謝琦，E-mail：xieqi8@yeah.net

接受日期：2015-11-07

謝琦, 吳敏儀, 楊逸銘, 等.擴散加權MRI活體評價外源野生型P53逆轉SW480/5-FU人類結腸癌效果.磁共振成像, 2016, 7(1): 56–61.

In vivo detection of the reversal effects using rAd/p53 to human colon cancer in mice with diffusion-weighted magnetic resonance imaging

XIE Qi1*, WU Min-yi1, YANG Yi-ming1, ZHANG Ding-xuan1, LEI Zheng-xian1, ZHANG Jing4, XU Jin2, ZHONG Wei-de3

1Medical Imaging Department, Nan Sha Center Hospital, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511457, China.

2Department of Pathology, Guangzhou Municipal First People's Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

3Clinical molecular medicine and molecular diagnostics laboratories, Guangzhou Municipal First People's Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

4Department of Pathology, Sun yat-Sen University Cancer center, Guangzhou 510080, China

*Correspondence to: Xie Q, E-mail: xieqi8@yeah.net

Received 1 Oct 2015, Accepted 7 Nov 2015

ACKNOWLEDGMENTS Natural Science Foundation of Guangdong Province (No.2015A030313732).

Abstract Objective: To investigate the potential of diffusion-weighted magnetic resonance imaging (DWI) to detect the reversal effects of rAd/p53 for 5-FU resistance of human colon cancer in vivo.Materials and Methods: One hundred nude mice with human colon cancer SW480/5-Fu (5-Fu resistance) were randomly assigned into four groups: control group, 5-FU group, rAd/p53 group, rAd/p53+5-FU.At 24 h, 48 h, 72 h, 120 h and 168 h after treatment, 5 mice were selected randomly from each group and given DWI examinations.Then these mouse models were sacrificed with an overdose of anesthetic.Their tumors were removed and detected apoptosis (TUNNEL).Results: The ADC values at the edge area of the tumor in rAd/p53 and rAd/p53+5-FU groups were significantly higher than that of the control groups at the observed time points (P＜0.05).The area ratios of tumor cell apoptosis in the rAd/p53+5-FU and rAd/p53 group were larger than that of control groups at the observed time point.The area ratios of tumor cell apoptosis and the ADC values in the rAd/p53+5-FU group were larger than that of rAd/p53 group at the observed time point.The ADC values of tumors were positively correlated with the area ratios of tumor cell apoptosis.Conclusions: The ADC value can evaluate the reversal effects of drug resistance with rAd/p53 in early stage of therapy in vivo.

Key words Genes, p53; Colonic neoplasms; Fluorouracil; Diffusion magnetic resonance imaging; Animal experimentation

本課題組在前期研究的結果中證實，擴散加權MRI (diffusion-weighted MRI，DWI)活體檢測rAd/p53治療人類結腸癌荷瘤裸鼠24 h即可以出現具有統(tǒng)計學意義的改變[1]。同時也發(fā)現，rAd/p53+5-FU治療非耐藥SW480結腸癌荷瘤裸鼠，可以加速腫瘤細胞的凋亡及提高p53蛋白的表達[2-3]。筆者進一步運用DWI觀察rAd/p53逆轉耐5-FU人類結腸癌耐藥性效果早期改變，探索D W I活體評價rAd/p53逆轉耐5-FU人類結腸癌效果早期療效的標記物。

1　 材料與方法

1.1對5-Fu耐藥的結腸癌細胞株制作

人類結腸癌SW480細胞系(購自中山大學動物中心細胞庫)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清(杭州四季青公司)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基)、37oC，5%CO2孵箱中。采用逐步提高培養(yǎng)基中5-氟尿嘧啶 (5-FU)濃度間歇誘導腫瘤細胞耐藥，5-FU藥物濃度從0.5 μg/ml開始，1～2 d換液一次，待細胞重新從此濃度生長至對數生長期時再次提高藥物濃度(依次為1 μg/ml、1.5 μg/ml、2 μg/ml、2.5 μg/ml、3 μg/ml、3.5 μg/ml、4 μg/ml、4.5 μg/ml、6 μg/ml)，連續(xù)培養(yǎng)5個月，獲得能夠在6 μg/ml 5-FU濃度中穩(wěn)定生長的人類結腸癌SW480耐藥細胞株(SW480/5-FU)。

1.2動物模型制作

本項目經中山大學實驗動物中心倫理委員會審查通過。選取鼠齡4周的健康BALB/c 裸小鼠(購自中山大學實驗動物中心)，體重約16～18 g，前期研究所采用組織塊移植方法[1-3]制作耐5-FU結腸癌SW480/5-FU荷瘤鼠，100只。

荷瘤鼠腫瘤1.5 cm左右，活體測量腫瘤體積(V=π/6×長×寬×高)，將上述荷瘤鼠分隨機成三組：對照組(給予生理鹽水)、rAd/p53組(深圳賽百諾生物科技公司)、5-FU組、rAd/p53+5-FU組。rAd/p53用量為1×107VP (virus particle)/mm3腫瘤，5-FU(武漢遠城科技發(fā)展有限公司)用量為0.5～0.9 cm的腫瘤用25 mg，1.0～1.4 cm的腫瘤為50 mg，1.5 cm以上的腫瘤為75 mg[2-3]。給藥途徑為直接瘤內注射。

1.3MRI及實驗室檢查

1.3.1MRI檢查

治療后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h每組隨機抽5只荷瘤鼠，水合氯醛麻醉(4.5%水合氯醛2 ml/100 ml，腹腔注射)，采用SIEMENS MAGNETOM Verio-3.0 T超導型磁共振成像系統(tǒng)及配套腕關節(jié)正交線圈進行檢查。

(1) T2WI快速自旋回波(TSE)：TR 4500 ms，TE 82 ms，層厚2 mm，間隔0，FOV 128mm× 128mm，NAS為4，SENSE加速因子為2，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸面、冠狀面、矢狀面成像，成像時間3 min 45 s (圖1A)。(2) DWI：采用單次激發(fā)平面回波成像序列(single shot echo planar imaging, EPI)，橫軸面成像，TR 5900 ms, TE 100 ms，按各向同性施加擴散敏感梯度場，取b值=800 mm2/s，成像時間9 min 26 s。FOV 220 mm×220 mm，NAS為3，層厚2 mm，采集矩陣220×220，重建矩陣308×308。采集的起止范圍與T2WI軸面絕對一致(圖1B)。

1.3.2標本檢測

BALB/c裸小鼠于磁共振檢查完畢后，腹腔注射5倍于麻醉量的10%水合氯醛處死，在無菌狀態(tài)下掏出腫瘤，以最大徑線處一分為二，放入緩沖福爾馬林溶液中，以便進行石蠟包埋切片及細胞凋亡檢測。

1.3.3數據收集

DWI數據的采集使用西門子磁共振成像儀工作站輸出ADC圖，在腫瘤最大橫切面利用感興趣區(qū)(ROI)自動測量并計算出ADC值，ROI放置在腫瘤邊緣非壞死區(qū)最大區(qū)域，ROI面積為8～75 mm2(圖1B)。

HE染色與TUNNEL結果分析：病理切片由2名病理科醫(yī)師分別按同一標準在顯微鏡下閱片分析，取2名醫(yī)師所采集的均值為病理的檢測最終結果數值。TUNNEL檢測陽性細胞為細胞核呈棕黃色，在×100視野下觀察并估算切片內TUNNEL染色陽性細胞與形態(tài)為死亡細胞的腫瘤細胞面積的百分比為腫瘤凋亡范圍。

圖1　 荷瘤鼠腫瘤T2WI成像(A)與ADC圖(B)Fig.1 The T2 weighted image (A) and ADC map (B) of tumor in nude mice.

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，數據用?x-± s表示，數據符合正態(tài)分布兩組之間比較用t檢驗，數據符合正態(tài)分布相關性分析采用Pearson相關檢驗，數據不符合正態(tài)分布相關性分析采用Spearman相關檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　 結果

2.1DWI檢測結果

5-FU組24 h、48 h時ADC值較對照組減少，72 h、120 h、168 h時ADC值較對照組增加，兩者之間的差別無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.223、0.151、0.135、0.748、0.369；表1)。

r Ad/p53組及r Ad/p53+5-FU腫瘤邊緣(24 h、48 h、72 h、120 h、168 h) ADC值均較對照組增大，兩者之間的差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05；表1)。

表1　不同組各時間點腫瘤ADC定量結果(?-x± s，× 10–4mm2/s)Tab.1 ADC values of different groups at observed time point (?x-± s, × 10–4mm2/s)

表 2 不同治療組腫瘤凋亡(TUNNEL)情況比較(x-± s)Tab.2 The area ratios of tumor cell apoptosis of different groups at observed time point (-x± s)

對照組與各治療組不同時間點荷瘤鼠腫瘤組織均見癌細胞凋亡(表2)。5-FU組癌細胞凋亡范圍較對照組有增大，兩者差別沒有統(tǒng)計意義(P值分別為0.069、0.160、0.174、0.127、0.083)；rAd/p53與rAd/p53+5-FU治療組癌細胞凋亡較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；rAd/p53+5-FU組癌細胞凋亡較rAd/p53組增加，24 h兩者差別無顯著性(P=0.055)，在48 h、72 h、120 h、168 h差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3ADC值與腫瘤凋亡的相關性分析

5-FU治療組，腫瘤ADC值與腫瘤細胞凋亡范圍無相關性(r=0.090，P=0.805)；rAd/p53治療組，腫瘤ADC值與腫瘤細胞凋亡范圍呈正相關性(r=0.427，P=0.001)；rAd/p53+5-FU治療組腫瘤ADC值與腫瘤細胞凋亡范圍呈顯著正相關(r=0.571，P=0.000)。

3　 討論

大多數結腸癌患者診斷時已是中晚期，治療主要以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為主的化療性姑息治療，但腫瘤細胞本身或在化療過程中出現對5-FU的耐受使患者無進展生存期僅8.7～12.3個月[4]，也成為結腸癌臨床化療的主要問題。有研究結果提示腫瘤抑制基因p53的突變或丟失可促進耐藥性產生[5-8]。

rAd/p53抗癌機制之一就是逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性或增加腫瘤細胞對化療的敏感性[9-12]。實驗研究證實，腺病毒介導的野生型p53可逆轉對5-FU耐藥的人類結腸癌LoVo/5-FU的MDR[ 9 ]與對阿霉素耐藥的人類乳腺癌MCF-7/ADM的MDR[10]，或增加胃癌對奧沙利鉑的敏感性[11]、膀胱癌細胞對長春新堿的敏感性[12]。臨床試驗研究發(fā)現，放療與化療無效的結腸癌肝臟轉移瘤的患者經肝動脈插管注入腺病毒包裝的p53基因，隨后給予5-FU或放射治療，可見腫瘤縮小，并生存期較無反應的患者明顯提高[13]。本課題組前期研究首次顯示rAd/p53與5-FU對結腸癌荷瘤鼠有相互協(xié)同抗癌作用[2-3]。本研究針對耐藥結腸癌進行研究，通過構建表達突變型p53 的耐5-FU人類結腸癌SW480/5-FU裸鼠耐藥模型，對模型分別給予5-FU、rAd/p53、rAd/p53+5-FU治療，與對照組對比，5-FU組腫瘤細胞凋亡范圍無明顯增加，rAd/p53組凋亡范圍有意義增大，rAd/p53+5-FU凋亡范圍進一步增加，提示rAd/p53本身對耐藥腫瘤具有促進凋亡作用，同時與5-FU有協(xié)同抗癌作用，進一步說明具有逆轉SW480/5-FU對5-FU的耐藥性。

而如何及時、準確的判斷結腸癌的耐藥性及p53干預后耐藥性的逆轉效果，以決定是否行單獨化療或聯合p53基因治療或其它治療以及治療的時間間隔等，尋找一種較客觀、準確、能在活體狀態(tài)下及時檢測腫瘤耐藥性及評價p53逆轉耐藥性效果的影像技術十分必要，對指導臨床治療中晚期結腸癌、提高結腸癌療效有重要意義。

DWI通過影像量化反應活體組織內水分子擴散運動，顯示活體組織在分子和細胞水平上的生物學過程，已作為內源性分子影像技術用于活體結構改變前功能變化的探索[14-18]，以及治療前腫瘤對治療的敏感性預測研究[17-19]。擴散成像信號改變的水分子運動源自三個腔隙：細胞內間隙擴散、細胞外間隙擴散、血管內間隙擴散，表觀擴散系數值(apparent diffusion coefficient，ADC)反映組織擴散特征的量化值，與細胞內外成分的比例有關，并隨著組織或細胞密度的增加而降低[14-16]；而細胞密度可以作為腫瘤侵襲性的指征，隨著細胞密度的增加，腫瘤的轉移性增加；除了細胞膜，細胞骨架、有機質、基質纖維和可溶性大分子對腫瘤的擴散受限起到了作用[2, 15-16]。腫瘤治療常引起腫瘤血管與細胞發(fā)生變化，導致三腔隙水分子擴散運動改變，成為DWI定量評估腫瘤治療效果的分子基礎[14]。因此，DWI提供了與組織生物物理特性、細胞和細胞膜結構有關的獨特信息，如細胞的組織結構、微結構和微循環(huán)。

文獻報道，DWI對晚期結腸癌輔助放化療或抗腫瘤血管生成的治療效果的預測研究結果有沖突[17, 19-26]。大多數的研究結果顯示對治療有較好療效或有效的腫瘤組織治療前ADC值低于療效差或無效的腫瘤組織[17, 19-20, 22-24],也有研究者的結果提示治療有效與治療無效的腫瘤組織治療前的ADC值沒有差別[21, 25-26]。對結腸癌肝轉移患者行一線化療研究結果提示治療前腫瘤組織的ADC值偏低者的無進展生存期與總生存期較短[19]。盡管如此，在對晚期結腸癌放化療、抗血管生成治療的研究均提示DWI在治療早期即可顯示ADC值升高，對療效的評價早于解剖影像的評價[1, 17-24]。

本研究基于DWI觀察腫瘤對放化療的敏感性預測的啟發(fā)，將DWI用于結腸癌耐藥性逆轉評價。對耐5-FU的結腸癌SW480/5-FU荷瘤鼠，單獨5-FU治療，腫瘤的凋亡范圍和ADC值與對照組對比無顯著性變化；經rAd/p53或rAd/p53+5-FU治療后24 h，腫瘤的凋亡范圍和ADC值出現有意義增高，并聯合治療組凋亡范圍和ADC值較單獨rAd/p53組增加值高，治療后ADC值與腫瘤凋亡范圍呈正相關。野生型p53蛋白通過阻止腫瘤G1期細胞進入S期，通過多種途徑引起p53觸發(fā)凋亡機制清除腫瘤細胞[5-8]。本研究的結果提示外源野生型p53增加了5-FU引起的癌細胞凋亡，可逆轉結腸癌對5-FU的耐藥性，使5-FU對耐藥癌細胞發(fā)揮抗癌效果。筆者推測耐藥腫瘤組織經rAd/p53或rAd/p53+5-FU干預后，促發(fā)腫瘤細胞凋亡，細胞體積縮小，細胞之間連接消亡，與周圍的細胞分開，細胞濃縮，腫瘤細胞內細胞器碎裂、溶解，導致細胞數目減少，細胞間隙增寬，細胞膜完整性受到破壞，使水分子擴散能力增強，ADC值升高。

綜上所述，rAd/p53可逆轉耐藥結腸癌組織對5-FU的耐藥性，DWI通過無創(chuàng)檢測腫瘤內水分子擴散的改變，通過量化的實時ADC值，反映活體腫瘤內病理生理改變信息，可提供p53逆轉耐藥結腸癌早期療效活體評價的生物標記物。本實驗結果對臨床研究的指導作用有待進一步探討。

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DOI:10.12015/issn.1674-8034.2016.01.011

文獻標識碼：A

中圖分類號：R445.2；R735.3+5

收稿日期：2015-10-01

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