水稻光氧化突變體812HS的光合和抗氧化特性

徐金剛　呂川根　劉　莉　呂春芳　馬　靜　夏士健　陳國(guó)祥高志萍,*

1南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210023;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,江蘇南京210014

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水稻光氧化突變體812HS的光合和抗氧化特性

徐金剛1呂川根2,*劉莉1呂春芳1馬靜1夏士健2陳國(guó)祥1高志萍1,*

1南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210023;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,江蘇南京210014

摘要:本研究旨在通過(guò)梅雨前后自然光強(qiáng)明顯變化的情況下對(duì)水稻葉片光氧化突變體812HS與野生型812S的PSII光化學(xué)活性、抗氧化酶活性等生理特性的比較研究,探討812HS易受光氧化損傷現(xiàn)象的光合生理原因。結(jié)果表明,大田自然光照出現(xiàn)強(qiáng)光照前,812HS與812S的葉綠素含量、PSII活性、光合磷酸化活性、凈光合速率、抗氧化酶活性和活性氧含量均無(wú)顯著差異。自然強(qiáng)光照開(kāi)始(梅雨結(jié)束)一段時(shí)間后,兩種水稻的上述各項(xiàng)指標(biāo)都發(fā)生了明顯的變化。突變體812HS的葉綠素含量、PSII活性、非循環(huán)式光合磷酸化活性和凈光合速率均明顯低于812S。高光強(qiáng)下812HS葉片中抗氧化酶CAT和POD活性的上升幅度則小于812S,從而使其體內(nèi)富集了更多的O2?、H2O2和MDA。光氧化突變體812HS對(duì)高光照強(qiáng)度較敏感的PSII活性和較低的CAT、POD活性可能是其發(fā)生葉片光氧化現(xiàn)象的生理成因。

關(guān)鍵詞:光氧化;光化學(xué)活性;抗氧化酶活性

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271621),江蘇省普通高校自然科學(xué)研究計(jì)劃(14KJB180011),江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程(PAPD),江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20140916)和江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心共同資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271621),Natural Science Research of Jiangsu Higher Education Institutions (14KJB180011),the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD),Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20140916),and Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production.

第一作者聯(lián)系方式:E-mail:jingang_0317@163.com

光是植物光合作用必需的能量來(lái)源[1]。正常情況下,太陽(yáng)輻射的光能被葉綠素吸收后可以驅(qū)動(dòng)類囊體膜上的電子傳遞系統(tǒng)生成ATP和NADPH[2]。過(guò)剩的光能會(huì)對(duì)植物形成光氧化脅迫,能夠直接降低植物的光合能力,使其發(fā)生明顯的光合作用減弱現(xiàn)象[3-6]。強(qiáng)光甚至中等強(qiáng)光、低CO2環(huán)境下的植物都易遭受光氧化的傷害,寒害和高溫等也會(huì)促進(jìn)光氧化的發(fā)生[7]。了解水稻光氧化的機(jī)制,對(duì)于采取措施緩解傷害以保證水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)有重要意義[8]。

已有的研究大多是在人為創(chuàng)造光氧化脅迫條件下研究水稻的生理生化反應(yīng)。例如,Jin和Choon[9]通過(guò)施加甲基紫精(MV)對(duì)水稻造成光氧化脅迫,研究其機(jī)體活性氧(ROS)對(duì)光系統(tǒng)I (PSI)和光系統(tǒng)II (PSII)的影響;Ji和Jiao[10]通過(guò)設(shè)置溫度梯度和光照強(qiáng)度梯度,比較研究不同溫度和光照條件下粳稻與秈稻光氧化傷害程度的差異。此外,前人還利用一些誘變產(chǎn)生的突變體研究水稻中不同基因或組分在應(yīng)對(duì)光氧化脅迫中發(fā)揮的作用。如Ye等[11]通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)形成的水稻osotp51突變體研究發(fā)現(xiàn),osotp51基因可以間接影響PSI的結(jié)構(gòu)和功能,從而導(dǎo)致植株在較低光強(qiáng)下也會(huì)發(fā)生光抑制現(xiàn)象;Zhou等[12]通過(guò)對(duì)60Co誘變水稻突變體lyl1的研究,推測(cè)該突變基因可能與葉綠素和α-生育酚的生成有關(guān),并認(rèn)為lyl1基因在水稻應(yīng)對(duì)光氧化脅迫和光損傷保護(hù)中起重要作用。上述研究結(jié)果對(duì)于闡明光氧化機(jī)制具有重要意義。

水稻812S是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院兩系雜交稻課題組育成的秈稻兩用不育系,812HS是一個(gè)來(lái)自812S (野生型)的光氧化突變體,農(nóng)藝性狀與野生型無(wú)實(shí)質(zhì)性差別[13]。梅雨寡照季節(jié)結(jié)束前的秧苗(一般在5月中旬出苗,至7月上旬梅雨結(jié)束),突變體的表型與野生型基本沒(méi)有差異。梅雨季節(jié)過(guò)后,由于田間自然光照強(qiáng)度的明顯增加,半個(gè)月左右后,突變體812HS的葉片尤其是頂部葉片失綠(發(fā)黃),而野生型812S在表型上不發(fā)生這種失綠現(xiàn)象。此外,在弱光或部分遮光處理的情況下(與不遮光對(duì)照的氣溫相同),812HS與812S一樣,并不發(fā)生葉片失綠現(xiàn)象,表明主要是光強(qiáng)起作用。遺傳分析和基因定位表明,該光氧化性狀受第4染色體上分子標(biāo)記RM307與RM401之間1個(gè)顯性基因LPO1控制。通過(guò)Gramene檢索發(fā)現(xiàn),該基因是首次報(bào)道并實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記定位的光氧化性狀相關(guān)基因[13]。通過(guò)基因精細(xì)定位和生物學(xué)信息分析,已經(jīng)預(yù)測(cè)了該基因(尚未發(fā)表)。由于基因新穎,突變體與野生型農(nóng)藝性狀又非常接近,該突變體為進(jìn)一步了解光氧化調(diào)控機(jī)制和相關(guān)基因功能提供了非常新穎的研究材料[14]。

本試驗(yàn)是在大田自然生長(zhǎng)條件和自然光照下進(jìn)行(遮光試驗(yàn)也在室外自然條件下,用黑紗網(wǎng)部分遮光),旨在比較分析光氧化突變體與野生型在光化學(xué)活性、能量利用和抗氧化酶活性等方面的差異,從生理學(xué)上分析812HS光氧化現(xiàn)象的原因,為進(jìn)一步在分子水平上研究光氧化基因LPO1提供生理依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料種植

水稻812HS和812S種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻試驗(yàn)田(南京)和南京師范大學(xué)仙林校區(qū)植物園,按照水稻常規(guī)的種植方法管理。于7月2日(5月15日出苗至7月2日,自然光照強(qiáng)度正?；蜉^低,其中6月中旬至7月2日處于梅雨期,光照強(qiáng)度較低,2個(gè)水稻品種葉色無(wú)差異)和8月2日(7月2日至8月2日為高光照強(qiáng)度,812HS表現(xiàn)出葉片明顯失綠)采樣測(cè)定(倒二或倒三葉),3次重復(fù)。

在室外條件下,用黑紗網(wǎng)部分遮光,使水稻冠層光強(qiáng)降低約2/3 (氣溫相同),觀察葉色變化,測(cè)定葉綠素含量的差異。

1.2測(cè)定方法

1.2.1葉綠素含量將水稻葉片剪碎,放入無(wú)水乙醇與丙酮的混合液(1∶1)中浸泡過(guò)夜提取葉綠素。用紫外分光光度計(jì)(GBC,Australia)分別測(cè)量提取液在663、645和440 nm處的吸光值,根據(jù)Arnon[15]的方法計(jì)算獲得葉綠素a和葉綠素b的含量,并計(jì)算葉綠素a/b值。

1.2.2葉綠素?zé)晒獾目焖贉y(cè)定按照Schansker 等[16]的方法,用便攜式植物效率儀(Hansatech,UK)測(cè)量葉綠素a的熒光。測(cè)量之前,先用葉片夾夾住水稻葉片進(jìn)行30 min的暗處理,然后用光量子為1500 μmol m-2s-1的650 nm波長(zhǎng)照射1 s后測(cè)定熒光值。測(cè)得的參數(shù)主要包括PSII的最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)、單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的光能(TR/RC)、單位反應(yīng)中心傳遞的電子能(ET/RC)和單位反應(yīng)中心的熱耗散能量(DIo/RC)。

1.2.3凈光合速率根據(jù)Jérémie等[17]的方法,用Li-6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(Li-Cor,USA)在自然生長(zhǎng)條件下測(cè)定水稻葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration)。測(cè)量時(shí),保持500 μmol s-1的空氣流速,360 μmol s-1的CO2濃度,樣品室內(nèi)光合光子通量密度(photosynthetic photon flux density,PPFD)為1000 μmol m-2s-1。

1.2.4光合磷酸化活性根據(jù)Ketcham等[18]的方法略加修改后制備葉綠體溶液懸浮液,測(cè)定光合磷酸化活性。取1 g去中脈的葉片剪碎,用10 mL冰浴的提取液[50 mmol L-1Tris-HCl (pH 7.6),5 mmol L-1MgCl2,10 mmol L-1NaCl,0.4 mol L-1蔗糖,0.1％牛血清蛋白(BSA)]將其勻漿,經(jīng)4層紗布過(guò)濾后,以200×g冷凍離心2 min,保留上清液,再經(jīng)2000×g冷凍離心5 min,即得葉綠體沉淀。用提取液重懸葉綠體沉淀即得葉綠體懸浮液。

利用Fluoroskan Ascent FL發(fā)光光度計(jì)(Thermo Scientific,America)測(cè)定光合磷酸化活性。0.1 mL葉綠體懸浮液與0.9 mL反應(yīng)緩沖液[10 mmol L-1K3Fe(CN)6,0.2 mol L-1Tricine (pH 8.0),20 mmol L-1MgCl2,20 mmol L-1Na2HPO4和20 mmol L-1(ADP)]混勻之后光照(50 μmol m-2s-1) 1 min,加入20％的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)。然后,1000×g離心5 min,得上清液。用9.9 mL 0.02 mmol L-1Tris-HCl (pH 7.5) 與0.1 mL的上清液混勻得反應(yīng)液。最后,用0.2 mL的反應(yīng)液與0.8 mL的熒光素酶液混合,在Fluoroskan Ascent FL發(fā)光光度計(jì)(Thermo Scientific,America)中測(cè)定光合磷酸化活性。

1.2.5抗氧化酶的提取及其活性測(cè)定根據(jù)García等[19]的方法并略加修改后制備粗酶液。1 g去脈的水稻葉片加入10 mL預(yù)冷的50 mmol L-1的磷酸鈉緩沖液(PBS)研磨至勻漿狀。在4℃條件下,將勻漿12 000×g離心10 min,上清液即為粗酶提取液。

參照Mandhania等[20]的方法,通過(guò)分析對(duì)氮藍(lán)四唑(NBT)化學(xué)還原的抑制狀況測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性。粗酶提取液與反應(yīng)液[0.13 mol L-1甲硫氨酸,0.75 mmol L-1NBT,0.1 mmol L-1EDTA,50 mmol L-1PBS (pH 7.8),0.02 mmol L-1核黃素]按照1∶59的比例混勻后,于50 μmol s-1光照下反應(yīng)15 min。兩個(gè)對(duì)照組以等體積的蒸餾水代替粗酶提取液,并且把其中一個(gè)置暗處作為空白對(duì)照。最后,分別測(cè)定各管在560 nm的吸光值。SOD活性以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位。

根據(jù)Beers和Sizer[21]的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。3 mL的反應(yīng)體系包括1 mL 0.3％ H2O2[0.1 mol L-1PBS (pH 7.0),30％ H2O2],1.9 mL H2O和0.1 mL酶液。測(cè)定反應(yīng)液在240 nm波長(zhǎng)處吸光值的降低速度。將每分鐘吸光值降低0.01定義為CAT的一個(gè)酶活性單位(U)。

參照Ou等[22]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性。反應(yīng)體系含0.1 mL PBS,28 μL愈創(chuàng)木酚,19 μL H2O2和0.05 mL酶液。加入酶液后啟動(dòng)反應(yīng),記錄紫外分光光度計(jì)470 nm波長(zhǎng)處吸光值的增加速度。將每分鐘吸光值升高0.01定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.6O2?和H2O2含量按照王愛(ài)國(guó)和羅廣華[23]的方法加以修改后進(jìn)行O2?含量的測(cè)定。1 g去中脈葉片在0.5 mmol L-1的磷酸緩沖液(pH 7.8)中研磨后經(jīng)12 000×g離心10 min。取1 mL上清液加入0.9 mL 的0.05 mol L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)和0.1 mL的氯化羥胺,25°C下混合培養(yǎng)20 min。取1 mL上述培養(yǎng)液依次加入17 mmol L-1對(duì)氨基苯磺酸和17 mmol L-1α-苯胺各1 mL,25℃反應(yīng)20 min。測(cè)定反應(yīng)液在530 nm處的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算O2?的含量。

取上述離心得到的上清液1 mL,借助H2O2含量測(cè)定試劑盒(建成生物公司,中國(guó)南京),按照說(shuō)明書(shū)的要求測(cè)定H2O2含量,并同時(shí)以蒸餾水為空白對(duì)照,測(cè)定各樣品在405 nm處的吸光值。根據(jù)公式計(jì)算H2O2含量。

1.2.7丙二醛含量按照華春和王仁雷[24]的方法測(cè)定。取上述粗酶提取液1.5 mL,與2.5 mL含有0.5％硫代巴比妥酸(TBA)的20％三氯乙酸(TCA)溶液混勻,沸水浴10 min,迅速冷卻,1800×g離心10 min,分別在532、600和450 nm處測(cè)定上清液的吸光值。

2　結(jié)果與分析

2.1葉色表型

圖1展現(xiàn)的是強(qiáng)光照前后突變體812HS和野生型812S的表型變化。7月2日(之前一段時(shí)間為梅雨季,寡照),突變體的表型與野生型沒(méi)有明顯差異。8 月2日,由于7月中下旬至8月初光照強(qiáng)度明顯較強(qiáng),突變體812HS的葉片出現(xiàn)明顯的失綠現(xiàn)象,尤其是頂部更甚,而野生型812S無(wú)此現(xiàn)象(圖1)。

2.2葉色表型對(duì)光強(qiáng)的反應(yīng)

在部分遮光試驗(yàn)中,根據(jù)實(shí)際測(cè)定,黑紗網(wǎng)遮去光強(qiáng)約65％ (晴天測(cè)定,自然光強(qiáng)平均值1308 μmol m-2s-1,遮光后水稻冠層頂部光強(qiáng)平均值為468 μmol m-2s-1)。從出苗后直至8月2日,部分遮光處理的812HS與812S葉色一直沒(méi)有明顯差別。而在同時(shí)進(jìn)行的黑紗網(wǎng)外的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中(正常自然光,氣溫相同),812HS與812S葉色差異明顯,812HS明顯失綠,812S葉色正常(圖2),葉綠素的測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了目測(cè)對(duì)葉色的判斷(表1),表明是光強(qiáng)的差別導(dǎo)致了葉色失綠。8月2日揭去黑紗網(wǎng),1周后,812HS逐漸失綠,15 d后,葉色明顯失綠,而812S葉色變化仍然不大,再次驗(yàn)證了光強(qiáng)導(dǎo)致的葉色變化。表2的葉綠素測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了以上的結(jié)論。實(shí)驗(yàn)表明,是光強(qiáng)的不同造成了葉色的差異,而非品種本身的遺傳性早衰。如果是遺傳性早衰,失綠特性是由遺傳基因決定的,將不受光強(qiáng)條件的限制,在正常光或稍弱光下也能表達(dá)早衰失綠特性。

圖1　水稻光氧化突變體812HS與野生型812S的葉色比較Fig.1　Leaf color of rice mutant 812HS and its wild type 812SA:7月2日;B:8月2日;其中左為812S,右為812HS。C:強(qiáng)光后812S葉片(左)與812HS葉片(右)的比較。A:at 2nd,July.B:at 2nd,August.812S (left),812HS (right).C:leaves of 812S (left) and 812HS (right) after a period of high sunshine.

圖2　812HS和812S部分遮光處理及對(duì)照的葉色Fig.2　Leaf color of rice mutant 812HS and its wild type 812S in partial shading sunlight從左至右依次為:自然光下生長(zhǎng)的812HS、812S,部分遮光處理的812HS、812S。Plant in the pots from left to right:812HS,812S under naturalsunlight,and 812HS,812S under partial shading sunlight.

表1　自然光照條件和部分遮光下812HS和812S的葉綠素含量Table 1　Changes of chlorophyll contents in rice leaves of mutant 812HS and 812S under natural sunlight and partial shading sunlight (mg g-1FW)

2.3光合色素含量

由表2可知,田間生長(zhǎng)條件下,在7月2日,2個(gè)品種的葉綠素a、葉綠素b含量及葉綠素a/b值之間均沒(méi)有顯著差異(P >0.05)。8月2日,2個(gè)品種的光合色素均相應(yīng)減少。812HS的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a/b的降幅分別為16.9％、11.2％和11.1％,明顯高于812S的6.5％、5.2％和5.7％。其中,812HS的葉綠素a含量下降尤其明顯,與812S差異顯著(P <0.05)。說(shuō)明812HS的反應(yīng)中心色素對(duì)光照強(qiáng)度的敏感度高于野生型,更容易受到高光強(qiáng)的傷害。

2.4快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線參數(shù)

如表3所示,7月2日,812HS的ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC值都顯著低于野生型(P <0.05),而DIO/RC和Fv/Fm值均與野生型之間沒(méi)有顯著差異。8 月2日,兩個(gè)品種的ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC和DIO/RC的值都明顯升高,只有Fv/Fm明顯降低。812HS的Fv/Fm值顯著低于野生型(P <0.05),而其ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC和DIO/RC值均明顯高于812S,其中TRO/RC差異顯著,從812S顯著高于812HS變?yōu)?12HS顯著高于812S。

表2　812HS和812S的光合色素含量Table 2　Pigment contents in leaves of rice mutant 812HS and its wild type 812S

表3　812HS和812S的熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3　Fluorescence kinetics parameters of rice mutant 812HS and its wild type 812S

2.5凈光合速率

812HS和812S葉片的凈光合速率(Pn)如圖3-A所示。在相同光合條件下,7月2日測(cè)定Pn,812HS 與812S差異不顯著。到8月2日,2個(gè)品種的Pn均有所降低,但812HS的降幅是812S的1.7倍,顯著低于812S。圖3-B表明,812HS和812S的Ci(胞間CO2濃度)的變化呈現(xiàn)出與Pn相反的趨勢(shì)。有研究表明,Pn與Ci具有一定的負(fù)相關(guān)性,Ci值是CO2羧化能力的體現(xiàn)[24]。在高光照強(qiáng)度造成傷害后,812HS的Ci值明顯升高,意味著其CO2羧化能力降低,進(jìn)而影響光合作用的強(qiáng)度。

圖3　812HS、812S的光合速率和胞間CO2濃度Fig.3　Net photosynthetic rate and intercellular CO2concentration in mutant 812HS and its wild type 812S*代表t檢驗(yàn)在0.05水平有顯著差異。* Represents significant difference at the 0.05 probability level according to t-test.

2.6光合磷酸化活性

如圖4所示,在7月2日,NCPS活性和CPS活性812HS與812S基本相同(P >0.05)。8月2日,812HS和812S的非循環(huán)式光合磷酸化(NCPS)及循環(huán)式光合磷酸化(CPS)活性都隨著光強(qiáng)的變化而改變。812HS的NCPS活性顯著低于812S,而CPS活性則顯著高于812S。通過(guò)分析上述變化可以發(fā)現(xiàn),在高光強(qiáng)刺激下,與野生型812S相比,突變體812HS的NCPS活性的穩(wěn)定性較差,因而較易激發(fā)循環(huán)式光合磷酸化的活性。激活的循環(huán)式光合磷酸化活性可以消耗過(guò)剩的能量[25]。

圖4　812HS、812S非循環(huán)式光合磷酸化(A)和循環(huán)式光合磷酸化(B)活性Fig.4　Activities of non-cyclic photophosphorylation and cyclic photophosphorylation in leaves of rice mutant 812HS and its wild type 812S*代表t檢驗(yàn)在0.05水平上有顯著差異。* Represents significant difference at the 0.05 probability level according to t-test.

2.7抗氧化酶活性

圖5表明,在7月2日,812HS與812S相比,SOD、CAT和POD活性均無(wú)顯著差異。8月2日,兩者的各種抗氧化酶活性都明顯增加,但812HS的 SOD活性顯著高于野生型,而POD和CAT活性卻顯著低于野生型?？梢酝茰y(cè),突變體較低的POD和CAT活性可能是其在高光強(qiáng)下表現(xiàn)光氧化現(xiàn)象的原因之一。

圖5　812HS和812S抗氧化酶活性Fig.5　Enzyme activity of antioxidation in leaves of rice mutant 812HS and its wild type 812S*代表t檢驗(yàn)在0.05水平有顯著差異。* Represents significant difference at the 0.05 probability level according to t-test.

2.8O2?和H2O2含量

如圖6所示,在7月2日,812HS細(xì)胞內(nèi)O2?和H2O2的含量與812S基本相同。8月2日,兩者植株內(nèi)O2?和H2O2的含量都升高,在812HS中富集得更多,顯著高于812S。這可能是812HS的PSII對(duì)高強(qiáng)光照較敏感,其較低的POD、CAT抗氧化酶活性打破了O2?和H2O2產(chǎn)生與消除之間的動(dòng)態(tài)平衡,從而植株體內(nèi)活性氧含量顯著增加,使葉片更易受到傷害。

圖6　812HS和812S活性氧含量Fig.6　Content of reactive oxygen species in leaves of rice mutant 812HS and its wild type 812S*代表t檢驗(yàn)在0.05水平有顯著差異。* Represents significant difference at the 0.05 probability level according to t-test.

2.9MDA含量

由圖7可知,在7月2日,812HS和812S的MDA含量均維持在相對(duì)較低的水平,兩者間無(wú)顯著差異。至8月2日,812HS和812S的MDA含量都明顯增加。但是,812HS的增幅明顯高于812S,差異顯著。MDA含量的變化與上述活性氧的變化趨勢(shì)一致,這可能是812HS葉片內(nèi)積累的較高含量的活性氧對(duì)其膜脂過(guò)量氧化造成的。

圖7　812HS和812S中MDA含量Fig.7　Content of MDA in leaves of rice mutant 812HS and its wild type 812S*代表t檢驗(yàn)在0.05水平有顯著差異。* Represents significant difference at the 0.05 probability level according to t-test.

3　討論

葉綠體是植物的光合器官,也是對(duì)光氧化最敏感的細(xì)胞器。正常情況下,葉綠體吸收的光能通過(guò)光合電子傳遞、熱耗散和葉綠素?zé)晒庑问较牡?。這3個(gè)途徑相互競(jìng)爭(zhēng),熒光的變化可以反映光合作用的水平[22]。本研究發(fā)現(xiàn),一段時(shí)間的強(qiáng)光照之后,812HS的葉綠素a嚴(yán)重降解,反應(yīng)中心失活程度較高,導(dǎo)致單位反應(yīng)中心吸收和捕獲的光能高于野生型。同時(shí),812HS葉片中PSII的最大光化學(xué)效率Fv/Fm顯著低于812S。由此可見(jiàn),812HS的PSII活性穩(wěn)定性比野生型差,對(duì)強(qiáng)光照比較敏感,其PSII的光能轉(zhuǎn)化效率和潛在活性受到了抑制,這將會(huì)進(jìn)一步影響光合電子傳遞和CO2的同化作用。

NCPS的活性依賴于PSII、中間電子載體和PSI[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),812HS和812S的NCPS活性變化趨勢(shì)與PSII一致,推測(cè)812HS的NCPS活性降低可能是其PSII活性的改變?cè)斐?。之前已有研究發(fā)現(xiàn),正常情況下,CPS在植物體內(nèi)光合磷酸化中所占的比例很小,高光照強(qiáng)度下植物可以通過(guò)提高其活性來(lái)保護(hù)葉片,從而使植物免受光氧化脅迫的損害[27]。本研究與前人的結(jié)果一致,2種水稻的CPS活性在強(qiáng)光照后都增加,但812HS的增幅顯著高于野生型,說(shuō)明CPS作為NCPS的一個(gè)輔助途徑,其活性與NCPS活性之間具有一定的負(fù)相關(guān)性。當(dāng)NCPS受到損傷后,812HS可以通過(guò)提高CPS活性起到一定的彌補(bǔ)作用。

對(duì)于水稻來(lái)說(shuō),7月份之前的光照強(qiáng)度屬于正?；蚱头秶?突變體812HS的PSII活性與野生型812S間并沒(méi)有明顯差別。在7月中下旬至8月初較高的光照強(qiáng)度下,812HS的PSII活性發(fā)生了非常明顯的下降,其中葉綠素a的降低幅度顯著大于野生型812S。812HS顯著降低的PSII活性會(huì)影響后續(xù)的NCPS活性,最終導(dǎo)致Pn明顯下降。同時(shí),這也造成了其體內(nèi)過(guò)剩能量的大量積累。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,體內(nèi)同時(shí)形成兩種主要的抗氧化系統(tǒng),分別是包括SOD、POD、CAT在內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)和小分子抗氧化物質(zhì),它們能夠在一定范圍內(nèi)及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的活性氧,維持自由基代謝的動(dòng)態(tài)平衡[28]。SOD、CAT和POD能夠清除植物體內(nèi)的活性氧,從而使光合作用膜免受過(guò)氧化的損傷,對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用[29]。SOD將O2?歧化成H2O2,抑制Haber-Weiss反應(yīng),再由CAT和POD將H2O2分解成H2O,從而阻止O2?和H2O2的積累[30]。只有三者協(xié)調(diào)一致,才能使活性氧自由基維持在較低的水平[31]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,在自然高光強(qiáng)下,812HS和812S的SOD活性均明顯增加,而且,812HS比812S增加得顯著,但是,可能由于光氧化812HS產(chǎn)生的O2?比812S多得多,所以,812HS的SOD活性的增加并不足以抵消光氧化產(chǎn)生的O2?增量,從而導(dǎo)致實(shí)際測(cè)定中O2?的積累量812HS仍顯著高于812S。此外,在812HS中,高活性SOD酶也導(dǎo)致更多H2O2的積累,而CAT和POD的活性增幅明顯低于812S,導(dǎo)致H2O2在植物體內(nèi)大量積累,引起細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷和生理代謝紊亂,使得812HS在高光照強(qiáng)度下保護(hù)葉綠體的能力相對(duì)較弱,因而葉綠體的光氧化損傷程度比812S明顯嚴(yán)重。MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物,MDA含量的增加是植物膜系統(tǒng)受脅迫的重要標(biāo)志之一。本研究中發(fā)現(xiàn),高光強(qiáng)條件下812HS的MDA含量明顯增加,與活性氧的變化趨勢(shì)一致,表明活性氧加速了膜脂過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng),自由基增多,過(guò)氧化產(chǎn)物在812HS中積累[32]。

4　結(jié)論

812HS的光氧化特性是由其不穩(wěn)定的PSII活性和較弱的CAT、POD活性造成。這種特性使得812HS細(xì)胞內(nèi)大量富集ROS,并對(duì)葉綠體機(jī)構(gòu)和光合磷酸化造成損傷,形成了明顯的葉片光氧化失綠表型。

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Characteristics of Photosynthesis and Antioxidation in Rice Photo-oxidation Mutant 812HS

XU Jin-Gang1,Lü Chuan-Gen2,*,LIU Li1,Lü Chun-Fang1,MA Jing1,XIA Shi-Jian2,CHEN Guo-Xiang1,and GAO Zhi-Ping1,*1College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China;2Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China

Abstract:To reveal the physiological mechanism of leaf photo-oxidation in a rice mutant 812HS,we compared and analyzed differences of photochemical activity,antioxidative enzyme activities between 812HS and its wild type 812S grown in the field.Results showed that chlorophyll content,PSII activity,photophosphorylation activity,net photosynthetic rate (Pn) and antioxidative enzymes activities as well as active oxygen contents in 812HS were similar to those in 812S before exposed to high intensity of sunlight.However,all above indexes were affected by a period of high intensity of sunlight.The decreased degree of chlorophyll content,PSII activity,non-cyclic photophosphorylation (NCPS) activity and Pnin 812HS were significantly higher than those in 812S.Besides,high intensity of sunlight led to a lower increase rate of POD and CAT activities in 812HS.Therefore,the contents of O2?,H2O2,and MDA in 812HS became higher than those in 812S.The result implied that the leaf photo-oxidation of mutant 812HS mainly results from higher sensitivity of PSII activities and lower CAT,POD activities under high intensity of sunlight.

Keywords:Photo-oxidation;Photochemical activity;Antioxidative enzyme activity

收稿日期Received():2015-08-21;Accepted(接受日期):2016-01-11;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2016-01-27.

*通訊作者(

Corresponding authors):呂川根,E-mail:lvchuangen@sina.com;高志萍,E-mail:08295@njnu.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00574