紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化

方強(qiáng)恩，張勃，李宇泊，師尚禮*

(1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，

甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅 蘭州730070)

?

紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化

方強(qiáng)恩1，張勃1，李宇泊2，師尚禮1*

(1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，

甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅 蘭州730070)

摘要：為了探討紫花苜蓿根頸芽越冬抗寒的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，本研究以WL168為材料，應(yīng)用透射電鏡技術(shù)跟蹤觀察了根頸芽在自然越冬過程中幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，1)在越冬期間，苜蓿根頸芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列積極適應(yīng)低溫的變化，主要表現(xiàn)為：質(zhì)膜內(nèi)陷，中央大液泡分割成多個(gè)小液泡，染色質(zhì)凝集，質(zhì)體變?yōu)樵卵佬位蝰R蹄狀，淀粉粒減少甚至消失，質(zhì)壁分離等，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)經(jīng)過適應(yīng)性調(diào)整，逐漸提高了根頸芽的抗寒能力。2)根頸芽在越冬期間同時(shí)存在白芽與褐芽兩種發(fā)育狀態(tài)，其中白芽幼葉細(xì)胞對(duì)越冬前的降溫反應(yīng)遲緩，直到土壤封凍后才完全形成抗寒結(jié)構(gòu)，但是到了翌年早春，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化快速，很早便解除抗寒狀態(tài)，恢復(fù)生長。在整個(gè)越冬過程中白芽的抗寒性表現(xiàn)出4個(gè)不同的發(fā)育階段：抗寒性增強(qiáng)期(10月下旬至12月中旬)，抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)，抗寒性減退期(1月下旬至2月下旬)和抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。相反，褐芽幼葉細(xì)胞在入冬前對(duì)氣溫下降提前作出了反應(yīng)，但在翌年早春對(duì)氣溫的回升卻反應(yīng)緩慢，到3月中旬，細(xì)胞結(jié)構(gòu)依然保持抗寒特性。越冬期兩種根頸芽的存在以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)響應(yīng)低溫的不同步性，是苜蓿越冬抗寒的一種適應(yīng)策略。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；根頸芽；超微結(jié)構(gòu)；抗寒性

冬季低溫是影響紫花苜蓿(Medicagosativa，文中簡稱苜蓿)生長和地域分布的重要限制因子。近年來由于低溫引起的苜蓿凍害使我國苜蓿生產(chǎn)遭受了巨大損失[1]。隨著我國苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，能否安全越冬已成為制約我國北方苜蓿草地成功建植和可持續(xù)利用的關(guān)鍵問題。目前，關(guān)于苜蓿的越冬抗寒機(jī)理尚未完全揭示，前人對(duì)于該問題的研究主要集中在根部形態(tài)及其生理生化特性等方面[2-8]。但是，Schwab和Barnes[9-10]在苜蓿凍害評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究中指出，一旦根頸與根頸芽全部受凍變黑、腐爛，苜蓿便不會(huì)返青，即使此時(shí)主根可能還是鮮活的。孫啟忠等[11]的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，認(rèn)為根頸和根頸芽在判斷苜蓿越冬中起著決定性作用?？梢姡ＷC根頸與根頸芽的安全越冬才是苜?？购N與栽培的核心。

一般認(rèn)為，細(xì)胞器與膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在抗寒鍛煉過程中的逐步提高是植物抵御冬季低溫脅迫的關(guān)鍵[12]。植物凍害的發(fā)生主要是由于低溫破壞了細(xì)胞的膜系統(tǒng)[13]，而葉器官則是植物最早、最直接感受外界環(huán)境變化的部位[14]。Niki[13]研究指出，在低溫處理中，葉片中前質(zhì)體和葉綠體會(huì)首先表現(xiàn)出明顯的變化。簡令成等[15]研究發(fā)現(xiàn)，小麥(Triticumaestivum)的抗寒品種進(jìn)入冬天寒冷季節(jié)時(shí)，其幼葉細(xì)胞中的前質(zhì)體會(huì)發(fā)生相互嵌合的拉鏈現(xiàn)象，而在同樣條件下春小麥則不會(huì)產(chǎn)生此種現(xiàn)象。Lee等[16]、Ishikawa[17]、Murphy和Wilson[18]、李榮富和王麗雪[19]研究指出，低溫會(huì)使植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，如：質(zhì)體變?yōu)閱♀徯?，?xì)胞質(zhì)基質(zhì)致密度增加，質(zhì)膜內(nèi)陷，液泡吞噬作用增強(qiáng)，淀粉粒消失，線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空洞等。這些資料表明，迄今為止對(duì)于植物凍害發(fā)生與越冬抗寒的細(xì)胞學(xué)機(jī)理已經(jīng)有了較深入的認(rèn)識(shí)，這對(duì)植物凍害預(yù)防管理和抗寒力鑒定與評(píng)價(jià)等具有重要的參考意義。但是，目前有關(guān)苜蓿根頸芽越冬抗寒機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)選取苜?？购贩NWL168為材料，跟蹤觀察了根頸芽自然越冬過程中幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化，旨在從亞細(xì)胞水平闡明苜蓿根頸芽的越冬抗寒機(jī)制，以期為苜?？购N與寒地栽培技術(shù)研究提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為WL168(M.sativa‘WL168’)，種子購自北京正道生態(tài)科技有限公司。WL168是近年來由美國牧草資源公司(Forage Genetics International，F(xiàn)GI)培育出的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗紫花苜蓿品種，秋眠級(jí)為2，抗寒級(jí)為1。該品種適應(yīng)性強(qiáng)，在我國東北、內(nèi)蒙古、新疆、西藏、甘肅和青海等地均可種植，是干旱、寒冷地區(qū)的首選品種。

1.2試驗(yàn)地概況及種植管理

試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站進(jìn)行，該地區(qū)屬溫帶半干旱大陸性氣候，四季分明、光照充足。海拔1517.3 m。年平均降雨量320 mm，年日照時(shí)數(shù)2474.4 h。田間試驗(yàn)小區(qū)面積3 m×3 m，4次重復(fù)。2014年4月10日播種。播前結(jié)合整地施磷肥750 kg/hm2、氮磷復(fù)合肥375 kg/hm2。條播，播種行距30 cm，播量為15 kg/hm2。播種深度1.5～2.0 cm。田間管理包括間苗、中耕除草、適時(shí)灌溉。播種當(dāng)年分別于7月6日、8月25日兩次刈割，每次留茬高度均為5 cm。

1.3試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在2014年10月至2015年3月間進(jìn)行。圖1為試驗(yàn)期內(nèi)的日最高溫度與日最低溫度。取樣分4個(gè)時(shí)期，5次取樣：1)秋末低溫訓(xùn)練期(10月25日)；2)初冬期(11月25日)；3)冬季嚴(yán)寒期(12月25日，1月25日)；4)早春返青期(3月15日)。采集時(shí)間均在上午9:30-12:00。每次采集不同類型芽各5～8個(gè)，迅速清洗干凈，以備切塊固定。

圖1　試驗(yàn)期內(nèi)(2014年10月20日至2015年4月1日)日最高溫度與日最低溫度Fig.1　The maximum and minimum temperatures in alfalfa growing period from October 20, 2014 to April 1, 2015　箭頭表示取樣時(shí)間。Arrows indicate the dates of collection.

在本試驗(yàn)中，根據(jù)芽的發(fā)育狀態(tài)不同，將苜蓿根頸芽劃分為褐芽、白芽和綠芽3類。褐芽分布在地下根頸節(jié)區(qū)約1 cm范圍內(nèi)，芽體很小，由數(shù)枚褐色的鱗片包裹；褐芽萌發(fā)后沖破鱗片發(fā)育為白芽，芽端白色或粉色，芽體大，主要分布在地面以下0～3 cm處；返青期白芽繼續(xù)發(fā)育，露出地面后轉(zhuǎn)變?yōu)榫G芽，芽端綠色，有2～3枚即將展開的幼葉(圖2-11)。

透射電鏡樣品制備與觀察：將清洗干凈后的根頸芽立即放在預(yù)冷的載玻片上，滴上數(shù)滴冷的2.5%戊二醛固定液(固定液用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液配制，4℃下保存)，用鋒利刀片從芽端幼葉頂部切取0.1 cm×0.2 cm的小塊(褐芽需先剝?nèi)[葉)，迅速放進(jìn)預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中，真空抽氣使樣品全部沉入底部，然后在4℃下預(yù)固定過夜。室溫下用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)漂洗3次，每次15 min，再用1%四氧化鋨后固定2 h。吸出固定液，加入上述緩沖液漂洗1 h，中間換液4次，之后在50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇(2次)中逐級(jí)進(jìn)行常溫脫水，每次20 min，EPON812環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合，萊卡EMUC6超薄切片機(jī)切片，厚度為70 nm。然后將超薄切片撈于載物網(wǎng)上，經(jīng)醋酸雙氧鈾(30 min)和檸檬酸鉛(10 min)進(jìn)行雙重染色，在JEM-1230(日本)型透射電鏡下進(jìn)行觀察拍照。

2結(jié)果與分析

2.1秋末低溫訓(xùn)練期根頸芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

從10月25日取樣制片中可以看出，苜蓿在秋季低溫訓(xùn)練期其白芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整，核位于細(xì)胞邊緣，核膜清晰，核質(zhì)分布均勻，核仁大，清晰可見；在細(xì)胞周緣圍繞細(xì)胞核和液泡分布著豐富的質(zhì)體和線粒體。質(zhì)體被膜完整，圓形、卵圓形或橢圓形，其中能看到正在分裂增殖的質(zhì)體(圖2-1，白色箭頭)，有些質(zhì)體中晶格狀原片層正在發(fā)育形成類囊體(圖2-3)；胞間連絲為“直型通道”型，明顯可見(圖2-4)。質(zhì)膜光滑，尚未發(fā)生質(zhì)壁分離，質(zhì)膜處有外吐(exocytosis)和內(nèi)吞(endocytisis)現(xiàn)象發(fā)生(圖2-4，白色箭頭)，這表明白芽幼葉細(xì)胞還處在較活躍的生長發(fā)育期。但受秋季低溫的影響，中央液泡隨之發(fā)生了適應(yīng)性變化，具體表現(xiàn)在：液泡表膜不光滑連續(xù)，甚至有些區(qū)域液泡膜將大量的細(xì)胞質(zhì)小球卷入其內(nèi)，增加了液泡內(nèi)濃度(圖2-2，白色箭頭)；同時(shí)在質(zhì)體中可以看到有淀粉積累(圖2-1,2,3,4)。

圖2　紫花苜蓿根頸芽秋末與初冬期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.2　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the late autumn and early winter　1～4：秋末(10月25日)白芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；1：質(zhì)體豐富，有些質(zhì)體正在分裂增殖(白色箭頭)，核膜清晰，核仁大；2：大液泡正在吞噬細(xì)胞質(zhì)小球(白色箭頭)；3：質(zhì)體中可見晶格狀原片層(白色箭頭)；4：質(zhì)體中有淀粉積累，質(zhì)膜出現(xiàn)小泡(白色箭頭)；5～6：秋末(10月25日)褐芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；5：大液泡分割出多個(gè)小液泡，核仁邊緣模糊；6：核仁消失；7～8：初冬期(11月25日)白芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；7：大液泡正在分割，核向中央靠近，核仁變小；8：質(zhì)體月牙形，淀粉消失，周圍有線粒體聚集；9～10：初冬期(11月25日)褐芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；9：質(zhì)體馬蹄狀，液泡稀少，核仁消失；10：質(zhì)體中積累了大顆粒淀粉，細(xì)胞核中染色質(zhì)發(fā)生凝聚；11：苜蓿根頸芽的3種不同類型：褐芽、白芽、綠芽。V：中央大液泡；sV：小液泡；P：質(zhì)體；Sg：淀粉粒；Cw：細(xì)胞壁；M：線粒體；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；N：細(xì)胞核。下同。1、2、4、9、10圖中，標(biāo)尺=1 μm；7、8圖中，標(biāo)尺=2 μm；3、5、6圖中，標(biāo)尺=0.5 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in late autumn (Oct. 25)；1：The cell with numerous plastids，nucleus membrane is clear and nucleolus is large，some plastids are dividing to proliferate (white arrow)；2：The large central vacuole is swallowing cytoplasm (white arrow)；3：Plastid with a crystal prolamellar body (white arrow)；4：Starch accumulates in plastid, some vesicles begin to form on plasmalemma (white arrow)；5-6：Cell ultrastructure of brown bud in late autumn (Oct. 25)；5：The large central vacuole is segmented into multiple small vacuoles，the edge of nucleolus becomes blur；6：Nucleolus is disappeared；7-8：Cell ultrastructure of white bud in early winter (Nov. 25)；7：The large central vacuole is segmented，nucleus closes to the central, nucleolus becomes smaller；8：Starch grain is disappeared，plastids become crescent-shaped which mitochondria is clustered around；9-10：Cell ultrastructure of brown bud in early winter (Nov. 25)；9：Plastids become horseshoe-shaped，vacuole is rare，nucleolus is disappeared；10：A great amount of starch accumulate in plastid，chromatin is agglutinated；11：Showing three types of crown bud：brown bud，white bud and green bud．V：Large central vacuole；sV：Small vacuole；P：Plastid；Sg：Starch grain；Cw：Cell wall；M：Mitochondrion；ER：Endoplasmic reticulum；N：Nucleus.The same below. Scale bars=1 μm in 1，2，4，9，10；2 μm in 7，8；0.5 μm in 3，5，6.

褐芽與白芽相比，質(zhì)體小，片層結(jié)構(gòu)較少，其中看不到淀粉粒(圖2-5,6)；大液泡已經(jīng)開始分割出很多小液泡；核仁邊緣變得模糊，甚至有些細(xì)胞核仁消失(圖2-5,6)。在質(zhì)膜處亦然有吞吐現(xiàn)象發(fā)生，仍未發(fā)生明顯的質(zhì)壁分離(圖2-6)。

2.2初冬期根頸芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

在初冬期(11月25日)，最低氣溫已經(jīng)降至零度以下(圖1)，地面即將封凍，此時(shí)通過透射電鏡看出，白芽幼葉細(xì)胞中細(xì)胞壁較前期增厚，大液泡已經(jīng)分割出了許多小液泡，并向質(zhì)膜靠近(圖2-7)。在細(xì)胞邊緣分布的液泡周圍整齊地環(huán)繞著數(shù)量豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖2-8)。質(zhì)體變?yōu)樽冃蜗x狀或月牙形，周圍有線粒體分布(圖2-7,8)。核移到了細(xì)胞中央附近，核仁變小，并受低溫影響發(fā)生出芽現(xiàn)象(圖2-7)，甚至有些細(xì)胞已分裂出兩個(gè)核仁(圖2-8)。此期質(zhì)膜依然光滑，未發(fā)生質(zhì)壁分離。質(zhì)體中淀粉消失(圖2-7,8)。

褐芽對(duì)初冬低溫的適應(yīng)性變化較白芽更為強(qiáng)烈，細(xì)胞核中染色質(zhì)發(fā)生不同程度的凝聚(圖2-10)。在核周圍聚集著多個(gè)體積較大的淀粉粒(圖2-10)，有些細(xì)胞核仁依然消失，質(zhì)體變?yōu)轳R蹄形，淀粉水解(圖2-9)。大液泡完全消失，小液泡數(shù)量減少，體積近等大，在細(xì)胞內(nèi)無規(guī)律地分布(圖2-10)。

2.3冬季嚴(yán)寒期根頸芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

12月25日，地面已經(jīng)封凍約20多天，天氣轉(zhuǎn)入冬季嚴(yán)寒期。從透射電鏡看出，白芽幼葉細(xì)胞中大液泡已經(jīng)全部分割為體積近等大的小液泡，液泡總數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)變得濃密(圖3-1,2)；細(xì)胞核膜周緣分布有少量異染色體，有些細(xì)胞中核仁消失(圖3-2)；在細(xì)胞中靠近質(zhì)膜的區(qū)域還能清晰地看到高爾基體及其產(chǎn)生的大量高爾基小泡(圖3-3)，質(zhì)膜內(nèi)陷呈波狀，質(zhì)壁分離現(xiàn)象開始發(fā)生，由此隔斷了胞間連絲(圖3-4)。質(zhì)體中片層結(jié)構(gòu)清晰(圖3-3)。

此時(shí)，褐芽幼葉細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)更加濃密，液泡很少(圖3-6,7,8)，質(zhì)體中含有體積較大的淀粉粒，且電子致密度高(圖3-7)，線粒體數(shù)量增加，質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯(圖3-7,8)。

到1月25日，白芽幼葉細(xì)胞中液泡開始大量吞噬細(xì)胞質(zhì)小泡和細(xì)胞器，體積變大，小液泡正在減少或已消失(圖3-9,10,11,12)；質(zhì)體中淀粉積累量增多，淀粉粒的電子致密度不一(圖3-9,10)，有些細(xì)胞中還產(chǎn)生了復(fù)合造粉體(圖3-10)；線粒體數(shù)量豐富(圖3-11)。此時(shí)褐芽中液泡的吞噬和融合現(xiàn)象更明顯，液泡通過吞噬作用融合吸收了細(xì)胞質(zhì)小泡(圖3-13,14)，增加了膜面積，另外通過質(zhì)膜的內(nèi)吞作用從外界獲得水分和能量。質(zhì)體中淀粉粒的電子致密度增加，復(fù)合造粉體圍繞細(xì)胞核分布，在造粉體周圍及其鄰近區(qū)域有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見(圖3-15,16)。

2.4早春返青期根頸芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

在早春返青期(3月15日)，天氣回暖，土壤解凍，大量白芽萌發(fā)出土發(fā)育為綠芽。此時(shí)綠芽幼葉細(xì)胞質(zhì)膜已恢復(fù)至光滑狀態(tài)，質(zhì)壁分離現(xiàn)象消失(圖4)。液泡通過自體吞噬和質(zhì)膜內(nèi)吞作用(圖4-4)，使之不斷擴(kuò)大，形成中央大液泡。細(xì)胞核從中央移至質(zhì)膜附近；質(zhì)體發(fā)育為葉綠體，類囊體排列整齊，片層結(jié)構(gòu)清晰，其內(nèi)很少再有淀粉積累。有些葉綠體正通過橫縊分裂進(jìn)行增殖，周圍分布有豐富的線粒體(圖4-1)；在原維管組織細(xì)胞中，裝載有細(xì)胞壁材料的高爾基小泡被輸送到質(zhì)膜，通過外吐作用將其內(nèi)部物質(zhì)釋放到質(zhì)膜外的細(xì)胞壁中(圖4-3)。由于質(zhì)壁分離現(xiàn)象的消失，胞間連絲也恢復(fù)功能，為細(xì)胞間的物質(zhì)交換提供通道(圖4-6，白色箭頭)。幼葉維管束中的伴胞被修飾成傳遞細(xì)胞(transfer cell)，通過增加質(zhì)膜表面積增強(qiáng)細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸功能(圖4-5)。

與綠芽相比，此期褐芽發(fā)育變化比較緩慢，液胞仍然進(jìn)行著吞噬和水合(圖4-7,8,9)，部分細(xì)胞核仁尚未出現(xiàn)(圖4-9)，質(zhì)體幼小，數(shù)量少，零星分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖4-7,8)；質(zhì)膜光滑，質(zhì)壁分離現(xiàn)象消失；細(xì)胞中淀粉粒完全水解，造粉體消失。在質(zhì)膜周圍分布有數(shù)量豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4-9)。

圖3　紫花苜蓿根頸芽嚴(yán)冬期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.3　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the deep winter　1～4：嚴(yán)冬期(12月25日)白芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；1：大液泡消失，核膜周緣分布少量異染色體(白色箭頭)；2：核仁消失；3：質(zhì)體中片層結(jié)構(gòu)清晰，質(zhì)體周圍有高爾基體分布；4：質(zhì)膜內(nèi)陷呈波狀；5～8：嚴(yán)冬期(12月25日)褐芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；5：淀粉粒電子致密度高；6：核仁消失，液泡稀少；7：線粒體數(shù)量增加；8：發(fā)生質(zhì)壁分離；9～12：嚴(yán)冬期(1月25日)白芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；9：淀粉數(shù)量豐富；10：出現(xiàn)造粉體(白色箭頭)；11：線粒體數(shù)量增加；12：液泡吞噬了大量細(xì)胞質(zhì)小泡和細(xì)胞器(白色箭頭)；13～16：嚴(yán)冬期(1月25日)褐芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；13～14：液泡開始吞噬、融合，體積增大(白色箭頭)；15：淀粉粒體積大，電子致密度高，周圍分布大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；16：很多造粉體圍繞在細(xì)胞核周圍。Pm：質(zhì)膜；Ga：高爾基體。1、2、6、9、11、14、15圖中標(biāo)尺=1 μm；5、12、16圖中標(biāo)尺=2 μm；4、7、8、10、13圖中標(biāo)尺=0.5 μm；3圖中標(biāo)尺=0.2 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Dec. 25);1：The large vacuole is disappeared，a small amount of heterochromosome is distributed at the edge of the nuclear membrane (white arrow)；2：Nucleolus is disappeared；3：Plastid lammelar is clear, Golgi apparatus occurs around plastid；4：Plasmalemma is invaginated, looked like a wavy；5-8：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Dec. 25)；5：The starch grains with great electronic density；6：Nucleolus is disappeared，vacuole is rare；7：The number of mitochondria is increased；8：Plasmolysis occurs in this period；9-12．Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；9：Numerous starch grain accumulates in the plastid；10：Amyloplast emerges (white arrow)；11：The number of mitochondria is increased；12：Vacuoles have swallowed up a large number of vesicles and organelles (white arrow)；13-16：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；13-14：Vacuoles begin to devour each other and amalgamate (white arrow)；15：Starch grains with larger volume and greater electronic density，numerous endoplasmic reticulum occurs around the starch grain；16：Many amyloplasts appear close to nucleus．Pm：Plasmalemma；Ga：Golgi apparatus．Scale bars=1 μm in 1，2，6，9，11，14，15；2 μm in 5，12，16；0.5 μm in 4，7，8，10，13；0.2 μm in 3．

圖4　紫花苜蓿根頸芽早春期幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.4　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the early spring　1～6：早春期(3月15日)綠芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；1：中央大液泡形成，細(xì)胞核被擠到邊緣，葉綠體正在分裂增殖(白色箭頭)；2：由質(zhì)體發(fā)育而來的葉綠體中類囊體排列整齊，周圍分布有豐富的線粒體；3：高爾基小泡(白色箭頭)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞壁中；4：液泡正在吞噬；5：幼葉維管束中伴胞被修飾成傳遞細(xì)胞；6：胞間連絲清晰可見(白色箭頭)；7～9：早春期(3月15日)褐芽幼葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；7：質(zhì)體數(shù)量稀少，造粉體消失；8：大液泡尚未完全形成，液泡仍進(jìn)行著吞噬與融合；9：質(zhì)膜周圍有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Ch：葉綠體。1、2、4、5、6、7、9圖中標(biāo)尺為1 μm；3和8圖中標(biāo)尺為0.5 μm。1-6：Cell ultrastructure of green bud in early spring (Mar.15 )；1：The large central vacuole has been formed，nucleus is pushed to the edge of cell，chloroplasts are proliferating (white arrow)；2：Thylakoids orderly arrange in chloroplast，numerous mitochondrions is distributed around the thylakoid；3：Golgi vesicles (white arrow) are transported to the cell wall；4：Vacuoles are swallowing up each other；5：Transfer cell occurs in the vascular bundles of young leaf；6：Plasmodesmata is clearly visible (white arrow)；7-9：Cell ultrastructure of brown bud in early spring (Mar.15 )；7：Plastid is disappeared，amyloplast becomes rare；8：The large central vacuole is not yet fully formed，vacuoles are still swallowing each other；9：Numerous endoplasmic reticulum is distributed close to the plasmalemma．Ch：Chloroplast．Scale bars=1 μm in 1，2，4，5，6，7，9；0.5 μm in 3 and 8．

3討論

3.1根頸芽幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對(duì)秋冬低溫的適應(yīng)

從上述研究結(jié)果可以看出，苜蓿根頸芽在越冬期間，幼葉細(xì)胞中質(zhì)膜、質(zhì)體、液泡、細(xì)胞核等超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。一般認(rèn)為，質(zhì)膜是寒害或凍害損傷的最初部位，為了抵抗低溫凍害，質(zhì)膜在抗寒鍛煉或低溫脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生抗寒性的適應(yīng)性變化[20]。在本文中，根頸芽幼葉細(xì)胞在秋末低溫訓(xùn)練期，質(zhì)膜通過內(nèi)陷或外凸(圖2-4,6)形成小泡，這些小泡不但能將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外排到質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間，防止質(zhì)壁分離處產(chǎn)生冰凍[20]，還能克服質(zhì)膜對(duì)大分子物質(zhì)通透性的限制，增加細(xì)胞質(zhì)的濃度，降低冰點(diǎn)，最終提高植物抗寒性[21]?？梢?，秋冬低溫條件下苜蓿根頸芽細(xì)胞中質(zhì)膜內(nèi)陷是一種積極的適應(yīng)行為。

本研究發(fā)現(xiàn)，在初冬期(11月25日)苜蓿根頸芽細(xì)胞壁較前一時(shí)期顯著增厚(圖2-7,8,9,10)。簡令成和王紅[22]分析指出，低溫鍛煉下植物細(xì)胞壁之所以會(huì)發(fā)生次生加厚和木質(zhì)化，是因?yàn)榈蜏劐憻捚谫|(zhì)膜會(huì)頻頻出現(xiàn)外吐現(xiàn)象，細(xì)胞通過質(zhì)膜的外吐作用將細(xì)胞質(zhì)小泡(包括小液泡)中包含的大分子物質(zhì)釋放到質(zhì)膜外，參與細(xì)胞壁的構(gòu)建，以增加細(xì)胞壁的堅(jiān)固性。這一適應(yīng)性變化可以防止植物細(xì)胞因冰凍失水而造成機(jī)械性損害。在初冬低溫鍛煉過程中，冬油菜(Brassicanapus)[23]、冬小麥[24]、桑樹(Morusbombciz)[25]、云杉(Piceaasperata)[26]等植物細(xì)胞壁都表現(xiàn)出了相同的適應(yīng)性變化。Rajashekar和Lafta[27]研究指出，抗寒鍛煉加富了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分胼胝質(zhì)、纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)的積累，尤其是木質(zhì)素和伸展蛋白(extensin)在細(xì)胞壁中的沉積，后二者能大大增強(qiáng)細(xì)胞壁的堅(jiān)硬度，而且，細(xì)胞壁中伸展蛋白的沉積可以提高細(xì)胞的抗凍性[28]。

液泡是一種水相體系，因而也是發(fā)生冷害的最危險(xiǎn)部位，對(duì)低溫冰凍敏感，極易受低溫脅迫。本研究結(jié)果顯示，苜蓿根頸芽幼葉細(xì)胞中液泡是所有膜系統(tǒng)中對(duì)秋季低溫最敏感的。從10月25日采樣中看出(圖2-2)，此時(shí)線粒體、質(zhì)體、質(zhì)膜等均結(jié)構(gòu)完整清晰，唯有液泡表膜出現(xiàn)較大變化，形狀變得不規(guī)則，膜發(fā)生反卷和內(nèi)陷，形成吞噬泡，把部分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器吞噬到液泡中，在液泡中出現(xiàn)了多層膜結(jié)構(gòu)或小泡(圖2-6)。液泡的內(nèi)吞作用被認(rèn)為與植物的抗寒性和抗凍鍛煉密切相關(guān)[29-30]。Sangwan等[31]認(rèn)為，由液泡膜內(nèi)吞而進(jìn)入液泡的細(xì)胞質(zhì)和膜狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)有關(guān)酶降解后可變?yōu)榈鞍踪|(zhì)及RNA等大分子物質(zhì)。韓善華等[32]通過組化分析發(fā)現(xiàn)，在冬季沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)葉肉細(xì)胞中，液泡內(nèi)含物含有大量的脂類物質(zhì)。由此分析，苜蓿根頸芽液泡膜大量內(nèi)吞，有助于提高液泡中的液體濃度，這樣可以減慢水分向細(xì)胞質(zhì)滲透的速度，降低冰點(diǎn)。此外，被內(nèi)吞的膜狀物質(zhì)降解后還可作為合成膜的原料貯存在液泡中，一旦液泡膜受到損傷和破壞，它就能使液泡膜迅速修復(fù)和很快合成[32]。因此，苜蓿根頸芽幼葉細(xì)胞中出現(xiàn)液泡膜的大量內(nèi)吞，并非偶然現(xiàn)象，很可能與其抗寒性的形成有關(guān)。

細(xì)胞核是DNA復(fù)制和DNA轉(zhuǎn)錄的特區(qū)，是有機(jī)體生長和發(fā)育的控制中心，因而它必然也是植物對(duì)逆境反應(yīng)和適應(yīng)的控制中心。低溫下保證細(xì)胞核的存活對(duì)于維持植株的存亡至關(guān)重要。Ritali和Ashworth[33]認(rèn)為，木本植物木射線薄壁細(xì)胞在冷脅迫中，染色質(zhì)會(huì)發(fā)生凝聚。但Jian等[34]指出，冬小麥在越冬過程中染色質(zhì)的分布沒有發(fā)生聚集現(xiàn)象。本研究中，在初冬期和冬季嚴(yán)寒期，褐芽和白芽細(xì)胞核中染色質(zhì)分別發(fā)生了不同程度的凝聚(圖2-10，圖3-1)。一般認(rèn)為，染色質(zhì)在冬季發(fā)生暫時(shí)性凝集是遏制DNA轉(zhuǎn)錄和mRNA新合成、誘導(dǎo)生理休眠的一種內(nèi)在機(jī)制[22]。

質(zhì)體是和糖類合成與貯藏密切相關(guān)的細(xì)胞器。當(dāng)受外界環(huán)境影響時(shí)，質(zhì)體常發(fā)生變形，多變?yōu)閱♀徯?、變形蟲狀、馬蹄形或環(huán)形等[35]。目前關(guān)于質(zhì)體變形的原因，存在多種解釋。有研究認(rèn)為，質(zhì)體變形是質(zhì)體發(fā)育過程中的正常現(xiàn)象[36]，它只是一種不同形態(tài)類型的造粉體[35]。楊濤等[37]認(rèn)為，啞鈴形質(zhì)體的出現(xiàn)表明質(zhì)體正以分裂的方式來增加數(shù)目。還有報(bào)道指出，變形的質(zhì)體可能承擔(dān)著分泌功能[38]。據(jù)本研究觀察，在秋末低溫訓(xùn)練期(10月25日)，苜蓿根頸芽幼葉細(xì)胞中質(zhì)體被膜完整，卵圓形或橢圓形，有淀粉粒積累其中(圖2-2,3,4)。但到初冬期(11月25日)，質(zhì)體變?yōu)樵卵罓罨蝰R蹄形(圖2-7,8)，此時(shí)其中積累的淀粉粒明顯減少甚至消失，并且質(zhì)體周圍有線粒體聚集，由此推測(cè)，質(zhì)體變形可能是細(xì)胞分解淀粉粒的一種表現(xiàn)，聚集的線粒體可為其提供能量。低溫下質(zhì)體通過分解淀粉粒來增加細(xì)胞質(zhì)中的可溶性糖濃度[22]，從而提高植株的抗寒性。在許多試驗(yàn)中均觀察到，逆境脅迫可導(dǎo)致線粒體數(shù)量增加[39-40]。低溫雖然一定程度上降低了線粒體和質(zhì)體的活性，但它們通過增加數(shù)量來保證能量供給，因此，線粒體數(shù)量的增加可以認(rèn)為是對(duì)低溫等逆境作出的一種積極的、補(bǔ)償性的反應(yīng)。

3.2苜蓿根頸芽自然越冬過程中抗寒性的變化

上述分析表明，根頸芽在秋冬低溫鍛煉中(10月至11月)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜、液泡、細(xì)胞核與質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與功能經(jīng)過積極的適應(yīng)性變化，逐步增強(qiáng)了苜蓿的越冬抗寒力。到12月25日，時(shí)值嚴(yán)冬，從該期取樣中可以看到(圖3-4)，此時(shí)苜蓿根頸芽幼葉細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離。大量研究結(jié)果表明，多年生植物在低溫脅迫下所發(fā)生的質(zhì)壁分離，是保證自身安全越冬的一種適應(yīng)機(jī)制[22]。質(zhì)壁分離發(fā)生時(shí)，質(zhì)膜通過內(nèi)陷形成波浪狀結(jié)構(gòu)，以此增加質(zhì)膜量，這樣可以防治冰凍脫水后細(xì)胞收縮對(duì)質(zhì)膜產(chǎn)生損傷，從而有效避免在嚴(yán)冬季節(jié)發(fā)生凍害。有報(bào)道指出[20]，細(xì)胞質(zhì)壁分離還能使胞間連絲中斷，共質(zhì)體連續(xù)性被破壞，植株停止生長或生長減弱，進(jìn)入暫時(shí)休眠。

據(jù)此分析，通過前期的自然低溫鍛煉，到嚴(yán)冬時(shí)期苜蓿根頸芽細(xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)已經(jīng)減弱至極低點(diǎn)，以休眠狀態(tài)抵御凍害。但是，從試驗(yàn)結(jié)果看，芽休眠維持時(shí)間并不長，到1月下旬，細(xì)胞又開始變得活躍起來，主要表現(xiàn)在：小液泡之間開始融合、變大；有些質(zhì)體幾乎完全被淀粉粒所充滿，轉(zhuǎn)變?yōu)樵旆垠w(圖3-10,15,16)，在造粉體周圍可看到環(huán)繞著較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖3-15)。簡令成和王紅[22]認(rèn)為，發(fā)育中的造粉體會(huì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成一種復(fù)合體(amyloplast-ER complex)，這是碳水化合物代謝和淀粉粒合成的聯(lián)合體系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能為造粉體起著物質(zhì)運(yùn)輸通道的作用。由此表明，在1月下旬苜蓿根頸芽細(xì)胞的抗寒結(jié)構(gòu)特征已開始發(fā)生變化，造粉體開始形成，為返青期根頸芽出土生長作能量供給上的準(zhǔn)備。

3月中旬，氣溫回升，此時(shí)大量白芽萌發(fā)出土發(fā)育為綠芽，綠芽幼葉細(xì)胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象消失；液泡通過自體吞噬作用形成中央大液泡；質(zhì)體發(fā)育為葉綠體；胞間連絲恢復(fù)功能；幼葉維管束中出現(xiàn)傳遞細(xì)胞(圖4)。以上特征均表明，在3月中旬，白芽已完全恢復(fù)生長，幼葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)已不再表現(xiàn)抗寒特征。但此期褐芽發(fā)育比較緩慢，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)仍然保持抗寒性，如：液胞間仍進(jìn)行著吞噬和水合，細(xì)胞內(nèi)還未完全形成中央大液泡；核仁缺失，質(zhì)體幼小等。

由以上分析可以看出，苜蓿自然越冬過程中白芽的抗寒性明顯表現(xiàn)出了4個(gè)不同的發(fā)育階段：抗寒性增強(qiáng)期(10月下旬至12月中旬)；抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)；抗寒性減退期(1月下旬至2月下旬)；抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。但是，褐芽在本試驗(yàn)開始時(shí)(10月25日)就已表現(xiàn)出了抗寒性，而且到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(3月15日)抗寒性還未完全解除，因此關(guān)于褐芽抗寒性的完整發(fā)育過程還需進(jìn)一步研究。

3.3褐芽和白芽對(duì)冬季低溫的適應(yīng)性差異

在西北地區(qū)，霜降之后，即10月底至11月中旬，苜蓿地上部分因凍害而逐漸枯死，其越冬主要依靠地下根頸芽[41]。因此，根頸芽能否安全越冬，直接決定苜蓿的越冬率和翌年草產(chǎn)量。前人一直僅把苜蓿地下白色或粉紅色的芽視為根頸芽[42-43]。但根據(jù)本研究觀察，發(fā)現(xiàn)苜蓿越冬前根頸芽存在著兩種發(fā)育狀態(tài)：一類芽在土壤封凍前已經(jīng)在地下萌發(fā)，鱗葉枯落，芽體較長，白色或粉紅色(文中記為白芽，圖2-11)；另一類芽則始終被褐色鱗葉包裹，處于潛伏狀態(tài)(文中記為褐芽，圖2-11)。褐芽雖然芽體小，萌發(fā)遲，但其數(shù)量龐大。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，褐芽不會(huì)出土生長，當(dāng)?shù)厣锨o葉和正在發(fā)育的白芽遭到損傷而失去發(fā)育能力時(shí)，褐芽會(huì)發(fā)育為白芽，萌發(fā)出土形成地上枝。本試驗(yàn)通過觀察比較白芽和褐芽在越冬期間幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)兩種芽在越冬過程中具有不同的適應(yīng)特點(diǎn)：在秋末低溫鍛煉期，白芽細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整，核仁大，核膜清晰，質(zhì)體和線粒體豐富，質(zhì)體正在分裂增殖，表明此時(shí)期細(xì)胞生長代謝仍較活躍，但褐芽此時(shí)已經(jīng)對(duì)低溫變化作出了反應(yīng)，表現(xiàn)在：核仁邊緣模糊或者核仁消失，大液泡分割出很多小液泡。在初冬期，白芽細(xì)胞中液泡開始分割，質(zhì)體變形，核仁變小，淀粉消失，此時(shí)褐芽反應(yīng)更為強(qiáng)烈，細(xì)胞核中染色質(zhì)出現(xiàn)輕微凝聚，大液泡完全消失；到嚴(yán)冬期，白芽和褐芽均出現(xiàn)質(zhì)壁分離。在早春返青期，天氣回暖，白芽萌發(fā)出土發(fā)育為綠芽，幼葉細(xì)胞內(nèi)中央大液泡已形成，質(zhì)體發(fā)育為葉綠體，質(zhì)壁分離消失，出現(xiàn)傳遞細(xì)胞，細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸功能增強(qiáng)。相比之下，此時(shí)褐芽細(xì)胞中，小液泡間仍進(jìn)行著吞噬和水合，中央大液泡尚未形成，但淀粉粒已完全水解，核仁缺失，質(zhì)體數(shù)量少，表明細(xì)胞生長緩慢，仍然保持抗寒特性。

綜上所述，苜蓿根頸芽是以白芽和褐芽兩種不同的發(fā)育狀態(tài)越冬的，而且，兩種芽在越冬期間表現(xiàn)出不同的適應(yīng)特性：白芽對(duì)越冬前氣溫下降反應(yīng)遲緩，直到土地封凍后芽生長才結(jié)束，但它對(duì)返青期的氣溫回升反應(yīng)敏感，很早便開始萌發(fā)生長。相比之下，褐芽入冬前能夠?qū)Φ蜏靥崆白龀龇磻?yīng)，以適應(yīng)隨后到來的冬季嚴(yán)寒；但在早春返青時(shí)，對(duì)氣溫的回暖變化反應(yīng)緩慢。一般認(rèn)為，北方地區(qū)早春氣溫先暖后冷的“倒春寒”是導(dǎo)致苜蓿凍害發(fā)生的主要原因[1]，褐芽對(duì)早春氣溫變化不敏感的這一特點(diǎn)，正好可以避免倒春寒的危害?？梢姡俎Ｔ蕉趦深惛i芽的存在，既保證了返青期的高產(chǎn)，又可以預(yù)防冬季嚴(yán)寒和倒春寒的危害，保存生長點(diǎn)，這正是苜蓿越冬抗寒的一種適應(yīng)策略。

References：

[1]Sun Q Z, Wang Y Q, Hou X Y. Alfalfa winter survival research summary. Pratacultural Science, 2004, 21(3): 21-25.

[2]Safaa A, Glenn W T. Carbohydrate reserves in alfalfa roots during fall, winter and spring. Oklahoma Academy of Science Proceedings, 1989, 69: 11-14.

[3]Pederson G A, Hill R R, Kendall W A. Genetic variability for root characters in alfalfa populations differing in winter hardiness. Crop Science, 1984, 24(3): 465-468.

[4]Cunningham S M, Gana J A, Volenec J J. Winter hardiness, root physiology, and gene expression in successive fall dormancy selections from ‘Mesilla’ and ‘CUF101’ alfalfa. Crop Science, 2001, 41(4): 1091-1098.

[5]Haagenson D M, Cunningham S M, Volenec J J. Root physiology of less fall dormant, winter hardy alfalfa selections. Crop Science, 2003, 43(4): 1441-1447.

[6]Castonguay Y, Laberge S, Brummer E C,etal. Alfalfa winter hardiness: a research retrospective and integrated perspective. Advances in Agronomy, 2006, 90: 203-265.

[7]Catherine D, Castonguay Y, Avice J. VSP accumulation and cold-inducible gene expression during autumn hardening and overwintering of alfalfa. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(10): 2325-2337.

[8]Liu Z Y, Li X L, Qi X,etal. Alfalfa science research by Chinese scholars since 1950: history and main topics. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(10): 58-69.

[9]Schwab P M, Barnes D K. Factor affecting a laboratory evaluation of alfalfa cold tolerance. Crop Science, 1996, 36(2): 318-324.

[10]Schwab P M, Barnes D K, Sheaffer C C. The relationship between field winter injury and fall growth score for 251 alfalfa cultivars. Crop Science, 1996, 36(2): 418-426.

[11]Sun Q Z, Gui R, Han J G. Research on winter injury and prevent technique of alfalfa (Medicagosativacv. ‘Aohan’) in Chifeng region. Acta Agrestia Sinica, 2001, 9(1): 50-57.

[12]Ge X X, Fang K F, Hao Q,etal. The mesophyll cell ultrastructural variations of four species inEuonymuswith evergreen broad-leaf planted in northern China in winter. Journal of Chinese Electron Microscopy Society, 2010, 29(2): 167-172.

二氧化碳綜合利用存在潛在收益。二氧化碳化工產(chǎn)業(yè)、二氧化碳生物利用技術(shù)已成為國內(nèi)外二氧化碳利用的研究熱點(diǎn)，部分化工利用技術(shù)已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化，預(yù)示著良好的發(fā)展前景。

[13]Niki T. Studies on chilling injury in plant cellsⅠ. Ultrastructural changes associated with chilling injury in callus tissues ofCornusstolonifera. Plant and Cell Physiology, 1978, 19(1): 139-148.

[14]Zheng L M, Si L T, Han G C. Effects of low temperature treatment on the ultrastructure of seedling leaf of different cold resistance cucumber. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2009, 18(4): 276-279.

[15]Jian L C, Jing Y X, Zhang B T. Cytological studies on the cold resistance of plants——ultrastructural changes of the wheat cells in the winter period. Journal of Integrative Plant Biology, 1973, 15(1): 22-37.

[16]Lee S H, Singh A P, Chung G C,etal. Chilling root temperature causes rapid ultrastructural changes in cortical cells of cucumber (CucumissativusL.) root tips. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 2225-2237.

[17]Ishikawa H A. Ultrastructural features of chilling injury: injured cells and the early events during chilling of suspension-cultured mung bean cells. American Journal of Botany, 1996, 83(7): 825-835

[18]Murphy C, Wilson J M. Ultrastructural features of chilling injury in Episcia-reptans. Plant Cell and Environment, 1981, 4(3): 261-265.

[19]Li R F, Wang L X. Effect of chilling stress on ultrastructure of root and leaf cells in grape. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 1996, 11(4): 111-115.

[20]Zhou Y W. Adapted changes in mesophyll cell ultrastructure ofPrimulasieboldiiduring cold-acclimation and cold stress. Plant Physiology Communications, 2007, 43(2): 255-258.

[21]Li L, Deng J M, Guo L R. Ultrastructure of the plasmalemma invaginations in callus ofHibiscusrosa-sinensiscuttings. Acta Botanica Yunnanica, 1998, 20(3): 312-314.

[23]Stefanowska M, Kuras M, Kacperska A. Low temperature-induced modifications in cell ultrastructure and localization of phenolics in winter oilseed rape (BrassicanapusL. var.oleiferaL.) leaves. Annals of Botany, 2002, 90(5): 637-645.

[24]Jian L C, Wu S X. Cytological studies on the cold resistance of plants-morphological changes of the intracellular structures of wheat in the overwintering period. Journal of Integrative Plant Biology, 1965, 13(1): 1-16.

[25]Jian L C, Li J H, Li P H. Seasonal alteration in amount of Ca2+in apical bud cells of mulberry (Morusbombciz): an electron microscopy-cytochemical study. Tree Physiology, 2000, 20(9): 623-628.

[26]Jian L C, Sun D L, Deng G M,etal. Alterations of intracellular Ca2+concentration and ultrastructure in spruce apical bud cells during seasonal transition. Forest Science and Practice, 2004, 6(1): 1-9.

[27]Rajashekar C B, Lafta A. Cell-wall changes and cell tension in response to cold acclimation and exogenous abscisic acid in leaves and cell cultures. Plant Physiology, 1996, 111(2): 605-612.

[28]Akashi T, Kawasaki S, Shibaoka H. Stabilization of cortical microtubules by the cell-wall in cultured tobacco cells - effects of extensin on the cold-stability of cortical microtubules. Planta, 1990, 182(3): 363-369.

[29]Dong L, Jia G X, Su X H. Change of the leaf tissue structure of evergreen broad-leaf plants during overwintering. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30(1): 59-64.

[30]Yang F X, Dong J M, Yang X X. Variations of the ultrastructure of the leaf cell of cotton under low temperature. Journal of Shanxi Agricultural University (Nature Science edition), 2001, 21(2): 116-117.

[31]Sangwan R S, Mathivet V, Vasseur G. Ultrastructural localization of acid phosphatase during male meiosis and sporogenesis in Datura: Evidence for digestion of cytoplasmic structures in the vacuoles. Protoplasma, 1989, 149(1): 38-46.

[32]Han S H, Wang S, Li Q,etal. Ultrastructural studies on menbranous inclusions in the vacuoles ofAmmopitanthusmongolicusin winter. Journal of Chinese Electron Microscopy Society, 1994, 13(4): 241-247.

[33]Ritali Z, Ashworth E N. Response of xylem ray parenchyma cells of supercooling wood tissues to freezing stress: microscopic study. International Journal of Plant Sciences, 1995, 156(6): 784-792.

[34]Jian L C, Deng J M, Li P H. Seasonal alteration of the cytosolic and nuclear Ca2+concentration in over-wintering woody and herbaceous perennials in relation to the development of dormancy and cold hardiness. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2003, 128(1): 29-35.

[35]Wang K R, Xue S B, Liu H T. Cell Biology (second edition)[M].Beijing: Beijing Normal University Press, 2002: 685-689.

[36]Shi G X, Xu X S, Wang W,etal. On the observation of amoeboid plastids of cotyledonary cells of Nelumbo nucifera. Chinese Bulletin of Botany, 1993, 10(4): 47-49.

[37]Yang T, Chen D H, Wu L P. Tissue culture ofAnthuriumandareanumand observation of the development of cells and chloroplasts by electron microscope. Subtropical Plant Research Communications, 1998, 27(1): 1-7.

[38]Wu X D, Yang S J. The irregular shaped plastids and mitochondria in suspensor cells of capsella. Journal of Chinese Electron Microscopy Society, 1998, 17(1): 7-10.

[39]Endress A G, Sjolund R D. Ultrastructural cytology of callus cultures ofStreptanthustortuosusas affected by temperature. American Journal of Botany, 1976, 63(9): 1213-1224.

[40]Smith M M, Hodson M J, ?pik H,etal. Salt-induced ultrastructural damage to mitochondria in root tips of a salt-sensitive ecotype ofAgrostisstolonifera. Journal of Experimental Botany, 1982, 33(5): 886-895.

[41]Han Q F, Wu X W, Jia Z K,etal. Analysis on dynamic variety of crown characteristics of different fall dormancyMedicagosativacultivars. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(4): 85-91.

[42]Grandfield C O. Food reserves and their translocation to the crown buds as related to cold and drought resistance in alfalfa. Journal of Agricultural Research, 1943, 67: 33-47.

[43]Pernbleton K G, Volenec J J, Rawnsley R P,etal. Partitioning of taproot constituents and crown bud development are affected by water deficit in regrowing alfalfa (Medicagosativa). Crop Science, 2010, 50(3): 989-999.

參考文獻(xiàn):

[1]孫啟忠, 王育青, 侯向陽. 紫花苜蓿越冬性研究概述. 草業(yè)科學(xué), 2004, 21(3): 21-25.

[8]劉志英, 李西良, 齊曉, 等. 1950年以來中國學(xué)者對(duì)苜蓿屬的研究:歷史脈絡(luò)與啟示. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(10): 58-69.

[11]孫啟忠, 桂榮, 韓建國. 赤峰地區(qū)敖漢苜蓿凍害及其防御技術(shù). 草地學(xué)報(bào), 2001, 9(1): 50-57.

[12]葛秀秀, 房克鳳, 郝強(qiáng), 等. 北方四種衛(wèi)矛屬常綠闊葉植物葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)在冬季的適應(yīng)性變化. 電子顯微學(xué)報(bào), 2010, 29(2): 167-172.

[14]鄭麗梅, 司龍亭, 韓貴超. 低溫處理對(duì)不同耐寒性黃瓜幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)的影響. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(4): 276-279.

[15]簡令成, 荊玉祥, 張寶田. 植物抗寒性的細(xì)胞學(xué)研究—小麥進(jìn)入寒冬時(shí)期細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化. 植物學(xué)報(bào), 1973, 15(1): 22-37.

[19]李榮富, 王麗雪. 低溫脅迫對(duì)葡萄葉片及根系細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 1996, 11(4): 111-115.

[20]周蘊(yùn)薇. 低溫鍛煉和低溫脅迫期間翠南報(bào)春葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)變化. 植物生理學(xué)通訊, 2007, 43(2): 255-258.

[21]李玲, 鄧江明, 郭麗榮. 扶桑插條愈傷組織質(zhì)膜內(nèi)陷的超微結(jié)構(gòu)研究. 云南植物研究, 1998, 20(3): 312-314.

[22]簡令成, 王紅. 逆境植物細(xì)胞生物學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 140-143.

[24]簡令成, 吳素萱. 植物抗寒性的細(xì)胞學(xué)研究-小麥越冬過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化. 植物學(xué)報(bào), 1965, 13(1): 1-16.

[29]董麗, 賈桂霞, 蘇雪痕. 常綠闊葉植物越冬期間葉片組織結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化. 園藝學(xué)報(bào), 2003, 30(1): 59-64.

[30]楊鳳仙, 董俊梅, 楊曉霞. 低溫脅迫下棉葉葉綠體、液胞超微結(jié)構(gòu)的變化. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2001, 21(2): 116-117.

[32]韓善華, 王雙, 李琪, 等. 冬季沙冬青液泡中膜狀內(nèi)含物的超微結(jié)構(gòu)研究. 電子顯微學(xué)報(bào), 1994, 13(4): 241-247.

[35]汪堃仁, 薛紹白, 柳惠圖. 細(xì)胞生物學(xué)(第二版)[M]. 北京: 北京師范大學(xué)出版社, 2002: 685-689.

[36]施國新, 徐祥生, 王文, 等. 蓮子葉細(xì)胞中變形質(zhì)體的觀察. 植物學(xué)通報(bào), 1993, 10(4): 47-49.

[37]楊濤, 陳德海, 吳荔萍. 安祖花組織培養(yǎng)及其細(xì)胞的葉綠體發(fā)育過程的電鏡觀察. 亞熱帶植物通訊, 1998, 27(1): 1-7.

[38]吳曉東, 楊世杰. 薺菜胚柄細(xì)胞中質(zhì)體和線粒體的形態(tài)變異. 電子顯微學(xué)報(bào), 1998, 17(1): 7-10.

[41]韓清芳, 吳新衛(wèi), 賈志寬, 等. 不同秋眠級(jí)數(shù)苜蓿品種根頸變化特征分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(4): 85-91.

Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering

FANG Qiang-En1, ZHANG Bo1, LI Yu-Bo2, SHI Shang-Li1*

1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,SinoU.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 2.CollegeofInformationScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:In order to explore the cytological mechanism of cold resistance in alfalfa crown buds during winter, a study of ultrastructural changes in young leaf cells of crown buds in the alfalfa variety ‘WL168’ was conducted by means of TEM. The results showed that: 1) a series of active changes in cell ultrastructure adapted to cold temperature take place during overwintering. The major changes included plasmalemma invaginations, the large central vacuole segmentation into multiple small vacuoles, chromatin condensation, plastid becoming crescent or horseshoe-shaped, starch grains depletion or even disappearance and plasmolysis. The capacity for cold resistance in buds was improved gradually by these adaptive adjustments of cell ultrastructure. 2) Two kinds of crown buds were found in winter: white bud and brown bud. These two kinds have different cellular growth states. The white bud cells had a slow response to cooling before winter and did not fully form specialized structures for winter hardiness until soil freezing, but they regrew quickly after cold resistance release in early spring. The cold resistance development of white buds during overwintering went through 4 phases: enhanced phase (late Oct-mid-Dec), maintenance phase (late Dec-mid-Jan), decline phase (late Jan-late Feb) and termination phase (early Mar-mid-Mar). In comparison, brown bud cells responded earlier to low temperatures before winter but more slowly to the warming of temperatures in spring. By mid-March, the cellular structure of brown buds still maintained their cold tolerance. The coexistence of brown and white buds during winter, whose cell ultrastructure changes asynchronously in response to low temperature, could be an adaptive strategy of alfalfa to cold stress.

Key words:alfalfa (Medicago sativa)； crown bud； ultrastructure； cold resistance

*通信作者

Corresponding author. E-mail: shishl@gsau.edu.cn

作者簡介：方強(qiáng)恩(1980-)，男，甘肅天水人，講師，博士。E-mail:fangqen@163.com

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-栽培與草地管理(CARA-35)，農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源保護(hù)與利用(NB2130135)和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1228)資助。

收稿日期：2015-09-22；改回日期：2015-11-16

DOI：10.11686/cyxb2015443

http://cyxb.lzu.edu.cn

方強(qiáng)恩，張勃，李宇泊，師尚禮. 紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 96-107.

FANG Qiang-En, ZHANG Bo, LI Yu-Bo, SHI Shang-Li. Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 96-107.