狗牙根品種(系)表型及分子遺傳變異研究

謝歡，蔣林峰，馬洪平，張新全，劉偉，彭燕*

(1.四川農業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都611130；2.重慶市墊江縣畜牧生產站，重慶408300)

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狗牙根品種(系)表型及分子遺傳變異研究

謝歡1，蔣林峰2，馬洪平1，張新全1，劉偉1，彭燕1*

(1.四川農業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都611130；2.重慶市墊江縣畜牧生產站，重慶408300)

摘要：狗牙根系世界著名多年生禾本科暖季型草坪草，廣泛用于不同用途草坪建植。本研究對國內審定的5個狗牙根品種，1個新品系及1個國外引進品種進行表型性狀和分子遺傳的比較研究，以進一步明確我國狗牙根品種資源的利用特性和遺傳基礎。結果表明，1)供試狗牙根品種(系)‘02011’在試驗區(qū)域的成坪速度為53 d，綠期為269 d，高于國內審定品種；2)反映株高、匍匐莖、旗葉、花序等特性的9個表型性狀在品種間差異均達極顯著水平(P<0.01)；3)各品種(系)在匍匐莖表面顏色、花序抽出度、葉片上表面顏色、生長習性、生殖枝表面花青甙顯色、外穎穎殼、穎尖花青甙顯色等植物新品種測試性狀上表現(xiàn)出不同程度的群體差異；4)SRAP與SSR分子標記各18對引物分別擴增出167和316條譜帶，多態(tài)性比例分別為87.51%和70.13%，來自相同地域的供試狗牙根品種具有較近的遺傳相似度。

關鍵詞：狗牙根；表型變異；DUS性狀；遺傳多樣性

狗牙根(Cynodondactylon)隸屬于禾本科畫眉草亞科(Eragrostoideae)虎尾草族(Chlorideae)，是世界范圍內分布最為廣泛的多年生暖季型草坪草之一，原產于非洲，現(xiàn)在熱帶、亞熱帶和溫帶沿海地區(qū)均有分布。在我國主要分布于新疆、吉林、青海、甘肅、河北、黃河流域及以南地區(qū)[1]。狗牙根因植株低矮、繁殖力強、抗旱力強、耐踐踏、質地細膩、色澤度好等優(yōu)點，被廣泛用于建植園林綠化、運動場、渠堤護坡、水土保持等草坪[2]。表型性狀變異研究廣泛應用于種質資源評價、遺傳選育、育成品種的注冊登記及品種鑒定。Simone等[3]對野生型、改良型和混合型的44份狗牙根表型觀測表明，其生長速度與表型有顯著關系，且匍匐莖生長速率是評價狗牙根品種的重要指標。劉建秀等[4]通過對我國444份狗牙根種源15個外部性狀變異規(guī)律統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)狗牙根可根據外部形態(tài)聚為5類，即粗高型、直立型、斜高型、斜矮型和矮生型。鄭玉紅等[5]對我國50份狗牙根種源根狀莖深度、密度和直徑進行田間觀測分析，證明不同狗牙根根狀莖特征與其抗寒性有密切聯(lián)系。

新品種的特異性(distinctness)、一致性(uniformity)和穩(wěn)定性(stability)簡稱DUS測試，是新品種保護的技術基礎，在作物[6-7]與觀賞植物[8-9]的品種鑒定與保護中提供可靠的判定依據，而利用DUS技術鑒定狗牙根品種鮮有報道。

傳統(tǒng)的表型性狀鑒定技術易受栽培技術、生育期和環(huán)境因素影響，極大制約著品種鑒定結果的準確性。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)及SSR(simple sequence repeat)分子標記技術常用于作物[10-11]或牧草和草坪草品種[12-13]鑒定。目前該類分子標記技術對狗牙根品種鑒定評價[14-16]多單一使用，這會因引物或分子標記技術的差異得到不同的結果，即對品種鑒定的可信性造成影響。目前結合SRAP與SSR分子標記技術僅用于對狗牙根種質資源的評價[17]，而結合SRAP與SSR鑒定不同狗牙根品種卻較少報道。

與國外相比，我國傳統(tǒng)狗牙根育種工作相對滯后，育成品種少，截至目前，審定登記的國審品種僅有12個，且多數(shù)為野生栽培馴化品種。目前國內應用較多的依然是從國外引進的雜交改良品種。本研究結合DUS表型性狀與SRAP及SSR分子標記技術對7個狗牙根品種形態(tài)及遺傳變異進行分析，探究我國現(xiàn)有狗牙根品種的表型變異與遺傳變異基礎，以期為我國狗牙根育種工作的深入開展及促進國內狗牙根品種資源的合理利用提供理論依據和技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗地概況

本研究于四川省雅安市四川農業(yè)大學草業(yè)科學系科研基地進行，地理坐標為N 30°08′，E 103°14′，海拔600 m，屬亞熱帶濕潤季風氣候。年均氣溫為16.2℃，最熱月(7月)均溫25.3℃，最冷月(1月)均溫6.1℃，極端高溫37.7℃，極端低溫-3℃，年降水量1774.3 mm，年蒸發(fā)量1011.2 mm，年均相對濕度79%，年日照時數(shù)1039.6 h，無霜期304 d，日均溫≥5℃的年積溫5770.2℃，≥10℃年積溫5231℃。試驗地土壤系白堊紀灌口組紫色砂頁巖風化的堆積物形成的紫色土，土質黏重，土壤偏酸pH值為5.6，有機質含量1.46%，土壤速效N、P、K含量分別為100.63 mg/kg，4.73 mg/kg，338.24 mg/kg，該區(qū)域氣候溫和，雨量充沛，適合于多種草坪草生長，在四川盆地丘陵平原中具有代表性。

1.2試驗材料

供試的7個狗牙根品種(系)信息見表1。

1.3材料栽植與管理

草皮塊移栽于2013年5月13日，栽植前進行人工除雜，清除石塊、鐵屑等雜物。耕后耙平，土塊細碎，土塊直徑≤1.5 cm；地面平整，墑情好，移栽前施基肥。每個材料即為一個處理，7個處理，每處理重復4次，共計28個試驗小區(qū)，小區(qū)面積2 m×2 m，采用單因素隨機區(qū)組方式排列。栽植時，選取生長健壯的狗牙根匍匐莖段，每莖段含3個節(jié)，將莖段2個節(jié)埋入地下，1個露出地面，按株行距5 cm×15 cm均勻栽植。各試驗小區(qū)實行統(tǒng)一管理。試驗時間為2013-2014年。

表1　供試狗牙根品種(系)

1.4試驗內容與方法

1.4.1表型性狀與DUS性狀觀測1)成坪速度觀測：各試驗材料小區(qū)蓋度達到90%時所需要的天數(shù)。

2)物候期及綠期觀測：主要物候期(返青期、盛花期、枯黃期)的觀測以50%的植株進入該時期為準。綠期為返青期至枯黃期之間的天數(shù)。

3)表型性狀測定：在盛花期，以小區(qū)為單位隨機選擇10個單株，利用游標卡尺和直尺等工具，分別測定株高(直立莖的最高點的自然高度)、匍匐莖長、匍匐莖節(jié)間長(匍匐莖中最長的一級匍匐莖)、匍匐莖節(jié)間直徑(第4個充分伸展的節(jié)間)、旗葉長度、旗葉寬度、生殖枝長度、花序長度、花序寬度共9個主要表型性狀。

4)DUS性狀測定：在盛花期觀測匍匐莖表面顏色、花序抽出度、生長習性、葉片上表面顏色、直立莖姿態(tài)、生殖枝表面花青甙顯色、外穎穎殼、穎尖花青甙顯色，狗牙根DUS性狀分級評分標準如表2所示[18]。

表2　DUS性狀表達分級標準

SSC：Stolon surface color；DH：Degrees of heading；CSB：Color of surface blade；RBCGC：Reproductive shoot cyanine glucoside color；ESP：Erect stem profile；GH：Growth habit；GCGC：Glume cyanine glucoside color；GTCGC：Glume tip cyanine glucoside color. 下同。The same below.

1.4.2SRAP與SSR分子標記1)DNA提取:于每個試驗小區(qū)中隨機選取具有健康葉片的10個單株，將這40個單株的葉片進行混合待用。利用Doyle等[19]的CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法提取DNA，并分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，合格的樣品保存于-20℃。

2)SRAP與SSR標記引物及反應體系:參考Li和Quiros[20]SRAP合成正反向引物各8條(表3)，共64對引物組合用于引物篩選，共獲得18對條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物用于SRAP試驗；SSR引物設計參考凌瑤等[17]篩選出的18對狗牙根SSR引物(表4)，引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系和程序及產物檢測參照凌瑤等[17]的方法。

表3　SRAP引物序列

表4　SSR引物序列

1.5數(shù)據分析

利用Excel 2007和SPSS 19.0軟件對觀測性狀的變異程度、變異規(guī)律進行統(tǒng)計分析。對獲得的清晰可重復的DNA條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上將穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶的有或無賦值為1和0進行統(tǒng)計，構成原始數(shù)據矩陣。利用 NTSYS 2.1 統(tǒng)計分析軟件計算任意兩個供試材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)[21]?；贕S矩陣，按UPGMA法(算術平均非加權配組法)進行遺傳相似性聚類，并繪制樹狀聚類圖。

2結果與分析

2.1狗牙根品種(系)成坪速度

供試不同狗牙根品種(系)在試驗地具有較強的擴展性，成坪速度較快。其中‘02011’品系成坪速度最快，僅需53 d，與成坪速度最慢的‘保定’狗牙根相差13 d。各品種(系)成坪速度排序為：保定<邯鄲<南京

表5　供試狗牙根品種(系)成坪所需天數(shù)

表6　供試狗牙根主要物候期記錄

表7　供試狗牙根表型性狀分析結果

PH：Plant height；SL：Stolon length；SIL：Stolon internode length；SID：Stolon internode diameter；FLL：Flag leaf length；FLW：Flag leaf width；RBL：Reproductive branch length；IL：Inflorescence length；IW：Inflorescence width；**表示在0.01水平上顯著相關，* 表示在0.05水平上顯著相關，下同。** show significant correlation at the level of 0.01, * show significant correlation at the level of 0.05, the same below.

2.2主要物候期及綠期

供試狗牙根品種(系)主要物候期如表6所示，在試驗區(qū)域，狗牙根返青期為3月下旬至4月初，其中，‘Tifway’、‘02011’與‘川南’的返青期為3月下旬，較其他品種返青早；盛花期為5月中下旬至6月上旬，其中‘Tifway’開花最早，‘南京’開花最晚；12月中旬以后狗牙根陸續(xù)進入枯黃期，‘南京’狗牙根最先進入枯黃期，‘保定’和‘邯鄲’較其他品種枯黃期晚。各品種(系)綠期為261～272 d，其中，‘Tifway’的綠期最長，為272 d，‘南京’的綠期最短，為261 d。

2.3表型性狀變異分析

利用SPSS 19.0對供試狗牙根品種9個主要坪用性狀單因素方差分析，在方差齊性檢驗顯示各樣本間總體方差齊時，F(xiàn)檢驗表明，測定的9個坪用性狀均達到極顯著(P<0.01)。比較F值發(fā)現(xiàn)，株高是F值 (21.622) 最大的坪用性狀，而生殖枝長的F值(4.325)最??；根據F值所代表的差異度大小對不同性狀變異由小到大的排序為：生殖枝長<匍匐莖節(jié)間直徑<匍匐莖節(jié)間長<旗葉長<花序寬<匍匐莖長<旗葉寬<花序長<株高(表7)。

2.4DUS性狀變異分析

對供試狗牙根品種DUS測試結果表明，7個狗牙根品種在8個DUS性狀上表現(xiàn)出群體差異(表8)。其中，外穎穎殼與穎尖花青甙顯色，匍匐莖表面顏色差異較小，品系‘02011’匍匐莖表面紫褐色，穎殼有較深的花青甙顯色，穎尖翠綠，而品種‘保定’穎尖有明顯的花青甙顯色。其余DUS性狀在不同品種間差異較大。品種(系)‘02011’、‘Tifway’花序抽出度較好，‘川南’和‘陽江’正好，而‘保定’、‘邯鄲’與‘南京’部分抽出；品種‘02011’、‘Tifway’和‘川南’葉片顏色鮮綠，‘保定’和‘邯鄲’葉片顏色較深；‘保定’與‘陽江’生殖枝有較深的花青甙顯色；品種‘Tifway’匍匐生長，而‘02011’、‘川南’屬于半匍匐生長類型，且這3個品種狗牙根直立莖斜出。綜上所述，品系‘02011’匍匐生長、直立莖斜出、葉片鮮綠、花序抽出度較好，外穎穎殼具有較深的花青甙顯色，與其他已登記申報的品種具有明顯的差異。

表8　狗牙根品種(系)DUS性狀

2.5狗牙根品種(系)表型性狀聚類分析

利用SPSS 19.0對供試狗牙根品種主要坪用性狀與DUS性狀聚類分析表明(圖1)，在歐式距離為12.0時，可將7個品種(系)主要分為4個類組，第I聚類組為品種‘保定’、‘邯鄲’，這類狗牙根植株較為高大、莖粗、葉片較大且顏色較深，品種原產地分別為河北的保定和邯鄲地區(qū)；第II類組僅有品種‘南京’，其植株較高，葉片較大，原產地為江蘇南京；第III聚類包括‘Tifway’、‘川南’和‘02011’，此類品種狗牙根植株低矮、節(jié)間細小、葉片細小而致密且顏色鮮綠；第IV類組有品種‘陽江’，品種原產地為廣東，植株較為低矮，葉片較小。

圖1　7個品種(系)狗牙根表型性狀聚類結果Fig.1　Dendrogram of 7 C. dactylon cultivars (lines) derived by UPGMA from the phenotype data

2.6狗牙根品種(系)SRAP和SSR標記分析

2.6.1狗牙根SRAP與SSR標記多態(tài)性分析采用SRAP與SSR引物對7個狗牙根品種(系)DNA進行PCR擴增，由表9可知，SRAP與SSR擴增總條帶分別為167與316條DNA帶，多態(tài)性條帶分別為146和226條，平均每對引物擴增出的多態(tài)性條帶分別為8.11和12.55條，引物的平均多態(tài)性比率(PPB)分別為87.51%和70.13%。SRAP引物等位位點多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.2755～0.4388，平均值為0.3714。SSR引物PIC變幅為0.2993～0.4828，平均為0.3818。數(shù)據結果表明SRAP與SSR分子標記在狗牙根中具有良好的多態(tài)性，可以用于狗牙根種質間遺傳多樣性分析(圖2)。

表9　狗牙根 SRAP 和 SSR 標記的多態(tài)性

圖2　7個品種(系)狗牙根SRAP(左)和SSR(右)擴增結果Fig.2　Amplified of 7 C. dactylon cultivars (lines) by SRAP (left) and SSR (right)

2.6.2狗牙根SRAP和SSR標記聚類分析合并SRAP與SSR標記，利用UPGMA法構建7個不同狗牙根品種(系)聚類圖(圖3)。在遺傳相似系數(shù)(GS)為0.75時可將供試材料分為5個聚類組，第I聚類組共有2個品種，分別為‘邯鄲’、‘保定’；第II聚類組共有2個品種(系)，分別為‘02011’和‘川南’；品種‘Tifway’、‘陽江’和‘南京’單獨聚類。聚類結果顯示，不同地區(qū)的材料遺傳變異較大，地理來源相同的材料聚為一類，表明供試材料與其地理來源及地理分布存在明顯的相關性。

圖3　7個品種(系)狗牙根遺傳多樣性聚類圖Fig.3　Dendrogram of cluster analysis of 7 C. dactylon cultivars (lines) based on SRAP and SSR markers

3討論

3.1供試狗牙根表型性狀變異特點

草坪草有觀賞、綠化等多種用途，因而被廣泛用于庭園、公園、運動場等公共場所。優(yōu)質草坪草是城市建設和園林綠化中的重要組成部分，其不僅可以提高城市美感，而且能夠作為環(huán)境凈化的調節(jié)劑[22]。本試驗中供試狗牙根成坪速度快、綠期長，但不同品種間具有差異。從西南地區(qū)選育的品種(系)‘02011’和‘川南’成坪速度分別需53與56 d，而綠期為269 d，優(yōu)于品種‘南京’、‘保定’與‘邯鄲’。這與初秀娟等[23]試驗結論相似，品種(系)‘02011’和‘川南’對西南地區(qū)的適應性較優(yōu)于品種‘Tifway’與‘南京’。另外，不同狗牙根品種表型性狀具有廣泛的變異，7個供試狗牙根品種(系)在生長習性、直立莖姿態(tài)、葉片顏色與匍匐莖表面顏色等DUS性狀測試下可以將其進行區(qū)別。試驗中不同狗牙根品種表型性狀變異具有一定的規(guī)律，綜合表型性狀與DUS性狀的聚類結果可將供試狗牙根品種分為4類：品種‘保定’、‘邯鄲’為一類，此類狗牙根植株高，葉片大且顏色深；品種(系)‘川南’和‘02011’植株低矮、節(jié)間細小、葉片細小而致密且顏色鮮綠，且與雜交品種‘Tifway’歸于同類，表明四川的2個狗牙根品種(系)坪用特性較為優(yōu)良，與其他品種相比，在外觀形態(tài)上雜交狗牙根相似度更高一些；而品種‘南京’植株較高，葉片較大，品種‘陽江’植株較為低矮，葉片較小，所以這兩個狗牙根品種分別聚為一類。劉建秀等[4]將我國狗牙根根據表型形態(tài)分為5類，與本試驗中不同地區(qū)品種(系)狗牙根分類類似。綜上所述，測試的品系‘02011’植株低矮、匍匐莖細長且多節(jié)，短時間內能迅速成坪，加之葉片細而致密，顏色鮮綠、綠期長，能夠形成較為均一的草坪，具有較好坪用價值，可作為我國西南地區(qū)優(yōu)質草坪草資源。

3.2供試狗牙根分子遺傳特點

利用分子標記技術能充分了解植物種質資源遺傳背景，對于新品種合理選擇與改良具有重要意義。本試驗利用SRAP和SSR分子標記分別獲得了87.51%與70.13%多態(tài)性，高于劉偉等[24]與易楊杰等[25]對狗牙根遺傳多樣性研究結果，說明這兩種分子標記多態(tài)性豐富，適用于狗牙根品種鑒定。另外，試驗結合SRAP與SSR分子標記結果對7個不同品種(系)狗牙根聚類分析發(fā)現(xiàn)，不同地理來源的狗牙根可聚為一類，如華北地區(qū)狗牙根品種‘保定’和‘邯鄲’，西南地區(qū)狗牙根品種(系)‘川南’與‘02011’，長江中下游地區(qū)狗牙根品種‘南京’及其以南地區(qū)品種‘陽江’，國外引進品種‘Tifway’，這與凌瑤等[17]合并多種分子標記結果研究狗牙根遺傳多樣性結果類似。而劉君等[15-16]試驗結果將品種‘南京’、‘陽江’和‘Tifway’區(qū)分于3個不同的聚類組也與本試驗結果相同。由此可見，結合多種分子標記結果比采用單一分子標記更能較綜合、全面地反映狗牙根遺傳變異特點，并有效用于狗牙根品種的分子鑒定。

3.3供試狗牙根表型變異與分子遺傳的相互關系

表型性狀和分子標記是兩種常用的遺傳相似性分析方法。分子標記體現(xiàn)DNA水平的差異，而表型性狀是環(huán)境和DNA變異共同調控的結果。本研究分別利用表型基礎與遺傳基礎對供試狗牙根品種(系)聚類分析。聚類結果反映了供試狗牙根品種(系)與其來源的地域環(huán)境具有一定的相關性，來自相同地域的狗牙根具有相似的表型性狀與較為接近的遺傳基礎；但基于表型性狀和分子標記聚類結果并不完全相同，品種‘保定’與‘邯鄲’，‘川南’與‘02011’、‘南京’在形態(tài)水平和分子水平上能進行聚類，而品種‘Tifway’在形態(tài)上趨于西南地區(qū)狗牙根，分子水平卻單獨聚類。其中可能原因，首先表型性狀范圍大、覆蓋面廣，植物的形態(tài)、生理、生長發(fā)育都能影響其變異來源，大多數(shù)數(shù)量性狀也易受環(huán)境變化影響，國外引進的狗牙根品種種植于西南地區(qū)，可能產生一定形態(tài)變異；其次，基因組的變化不只是部分SRAP與SSR引物能夠完整揭示，不同引物和分子標記手段得到的結果也不一定相同，同時‘Tifway’屬于美國引進的雜交狗牙根，遺傳基礎本身與國內狗牙根品種存在差異。所以，利用多種分析方法研究狗牙根表型與遺傳多樣性，能夠更好地揭示狗牙根潛在的利用價值，為收集和改良狗牙根種質資源，選育新型狗牙根品種奠定基礎。

4結論

本研究通過對我國7個主要狗牙根品種(系)的坪用物候期、成坪速度、綠期、表型性狀、DUS性狀及分子遺傳多樣性系統(tǒng)研究表明，各供試狗牙根品種表型性狀與遺傳背景差異明顯。品系‘02011’在成坪速度、綠期、坪用性狀等方面表現(xiàn)突出，且分子水平與其他品種存在差異，是具有潛力的狗牙根新品系。

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The phenotypic traits and molecular genetic variation of Bermudagrass (Cynodondactylon) cultivars and breeding lines

XIE Huan1, JIANG Lin-Feng2, MA Hong-Ping1, ZHANG Xin-Quan1, LIU Wei1, PENG Yan1*

1.DepartmentofGrasslandScience,AnimalScienceandTechnologyCollege,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.DepartmentofLivestockProductionStationofDianjiang,Chongqing408300,China

Abstract:Bermudagrass (Cynodon dactylon) is a perennial, warm-season turfgrass well known and widely used for different purposes throughout the world. In order to further clarify the characteristics and genetic basis of C. dactylon germplasm in China, this study performed a comparative study of the phenotypic traits and molecular genetics of 5 cultivars and 1 breeding line, as well as 1 cultivar introduced in China. The green stage and turf speed are 53 and 269 d for the breeding line ‘02011’, higher than the 5 cultivars. The differences between cultivars in terms of plant height, flag leaf, creeping stem, and inflorescence characteristics were highly significant (P<0.01). 8 DUS (distinctness, uniformity and stability) characteristics (including stolon surface color, degrees of heading, color of surface blade, reproductive shoot cyanine glucoside color, growth habit, glume cyanine glucoside color, glume tip cyanine glucoside color) differed among the tested cultivars to varying degrees. 167 and 316 bands were amplified for 18 pairs of primers by SRAP and SSR, of which 87.51% and 70.13% were polymorphic. SRAP and SSR showed that C. dactylon cultivars from the same geographical area could exhibit similar phenotypic traits and relatively close genetic similarities.

Key words:Cynodon dactylon; phenotypic variation; distinctness, uniformity and stability (DUS) characters; genetic diversity

*通信作者

Corresponding author. E-mail:pengyanlee@163.com

作者簡介：謝歡(1990-)，男，四川宜賓人，碩士。E-mail:5151887579@qq.com

基金項目：四川省“十二五”飼草育種攻關項目(2011NZ0098-11)和現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-35-05)資助。

收稿日期：2015-04-29；改回日期：2015-08-25

DOI：10.11686/cyxb2015228

http://cyxb.lzu.edu.cn

謝歡, 蔣林峰, 馬洪平, 張新全, 劉偉, 彭燕. 狗牙根品種(系)表型及分子遺傳變異研究. 草業(yè)學報, 2016, 25(3): 86-95.

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