纖維素降解細(xì)菌的篩選、生物學(xué)特性及降解效果

賈輝，陳秀蓉*，蘆光新，孔雅麗，楊成德

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,青海 西寧 810016)

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纖維素降解細(xì)菌的篩選、生物學(xué)特性及降解效果

賈輝1，陳秀蓉1*，蘆光新2*，孔雅麗1，楊成德1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,青海 西寧 810016)

摘要：為了從東祁連山高寒草甸土壤中分離篩選纖維素分解細(xì)菌，本研究根據(jù)在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和濾紙平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，初步篩選出3株具有較強(qiáng)纖維素分解能力的細(xì)菌，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，3株菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍為25～30℃；最適生長(zhǎng)pH因菌種不同位于5～8之間；最適生長(zhǎng)鹽濃度位于4%～5%。菌株X1-2具有較好降解特性，根據(jù)形態(tài)觀察、革蘭氏染色及16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育比較，鑒定該菌為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，是一株十分具有開(kāi)發(fā)生產(chǎn)纖維素酶能力的菌株。

關(guān)鍵詞：纖維素分解菌；篩選；生物學(xué)特性；降解效果

纖維素是葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而形成的線性葡聚糖，是一種廣泛存在于植物中的骨架多糖[1-2]。纖維素豐富的糖源可以用于許多原料加工工業(yè)。遺憾的是許多纖維素廢棄物通常被燃燒處理掉，這是一個(gè)普遍存在于發(fā)展中國(guó)家甚至是全球的浪費(fèi)現(xiàn)象[3-4]，由此形成的環(huán)境污染問(wèn)題和資源浪費(fèi)都已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。因此，研發(fā)大規(guī)模、工業(yè)化和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的天然纖維素資源化轉(zhuǎn)化技術(shù)是擺在當(dāng)今世界的一大課題。利用微生物分解轉(zhuǎn)化纖維素類(lèi)物質(zhì)可以將其變?yōu)轱暳?、栽培基質(zhì)、有機(jī)肥料、化工原料等[5-7]。纖維素酶是纖維素降解過(guò)程中的重要酶類(lèi)物質(zhì)，包括3類(lèi)可溶性細(xì)胞外的酶：1,4-β-內(nèi)切葡聚糖酶，1,4-β-外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。許多微生物包括許多細(xì)菌、真菌和放線菌都有產(chǎn)纖維素酶的能力。自然界中具有纖維素分解能力的菌株很多，例如：梭狀芽孢桿菌、球毛殼菌、木霉、青霉屬、曲霉、擔(dān)子菌、蟲(chóng)擬蠟菌、木腐菌和青霉菌等[8-10]。但目前獲得的菌株其纖維素酶活力普遍較低[11-13]，即使酶活力很高的菌株繼代培養(yǎng)后表現(xiàn)出退化或不穩(wěn)定，這些因素一直是阻礙纖維素酶大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題[14-17]。篩選高效纖維素酶活力的菌株仍然是人們努力的目標(biāo)[18-19]。東祁連山高寒草甸金槍河流域，植物群落多樣性復(fù)雜，微生物資源豐富，本研究擬從該地區(qū)土壤中篩選高產(chǎn)纖維素分解細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其纖維素降解能力和生物學(xué)特性測(cè)定，旨在獲得能夠高效、快速降解纖維素的優(yōu)良菌種。

1材料與方法

1.1材料

2013年5月土樣采集自祁連山高寒草甸甘肅省天?？h金槍河地區(qū)。主要供試培養(yǎng)基有以下幾種：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板培養(yǎng)基：NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、CMC-Na 10 g、瓊脂10 g、蒸餾水1000 mL。濾紙平板培養(yǎng)基：NaNO32.5 g、KH2PO41 g、 CaCl2·6H2O 0.1 g、 MgSO40.3 g、NaCl 0.1 g、FeCl30.01 g、濾紙條10 g、蒸餾水1000 mL、無(wú)菌濾紙、pH自然。牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、瓊脂8 g。NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g。

1.2方法

1.2.1具有降解纖維素能力的細(xì)菌分離稱(chēng)取各樣10 g加入90 mL無(wú)菌水，將樣品振蕩10～15 min，使土壤顆粒均勻分散成為懸液，靜置數(shù)分鐘，吸取1 mL土懸液到9 mL稀釋液中，依次按10倍法稀釋?zhuān)ǔＯ♂尩?0-4成一系列稀釋液。取1 mL土懸液接種于羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀使其均勻涂抹于培養(yǎng)基表面，每稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，在28～30℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成后，按菌落特征歸類(lèi)和編號(hào)，然后將菌落特征不同的細(xì)菌轉(zhuǎn)入NA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2供試細(xì)菌分解纖維素能力的測(cè)定對(duì)CMC-Na分解能力的測(cè)定:挑取分離的細(xì)菌菌落接到CMC-Na平板培養(yǎng)基上，于25℃避光培養(yǎng)7 d，采用剛果紅染色，記錄各菌株的透明圈大小。

對(duì)濾紙分解能力的測(cè)定:將分離得到的具有纖維素分解能力的菌株，接入NB培養(yǎng)基中20℃搖床培養(yǎng)5 d后制成菌懸液，于盛有50 mL液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中放入2.6 cm×6.2 cm的濾紙條，接入1 mL菌液100 r/mim進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)8 d，以濾紙條的斷裂程度評(píng)價(jià)降解效果。

對(duì)中華羊茅(Festucasinensis)凋落物分解能力的測(cè)定:稱(chēng)取5 g中華羊茅凋落物，放入盛有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，然后接入1 mL菌液，100 r/mim進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)15 d后取出，烘干稱(chēng)重，按下列公式計(jì)算中華羊茅的減重百分比，確定菌種分解中華羊茅凋落物的能力。

W=(S-S1)/S×100%

式中，W代表中華羊茅凋落物分解百分比，S代表中華羊茅凋落物的原始干重，S1為中華羊茅凋落物溶解后的烘干量。

1.2.3纖維素降解菌的生長(zhǎng)條件測(cè)定最佳生長(zhǎng)溫度的測(cè)定：將復(fù)選出的菌種接于細(xì)菌液體培養(yǎng)基，分別置于5,10,15,20,25,30,35,40,45℃等9個(gè)溫度下懸浮培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)，3 d后測(cè)定菌液的OD600值，并根據(jù)OD600值的大小判斷不同溫度條件下菌體的生長(zhǎng)狀況，確定其最適生長(zhǎng)溫度。

最佳生長(zhǎng)酸堿度的測(cè)定：pH值分別用4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0磷酸緩沖液配制成11個(gè)濃度，置于上述所測(cè)最適溫度下培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)。3 d后測(cè)定菌液的OD600值，并根據(jù)OD600值的大小判斷不同pH條件下菌體的生長(zhǎng)狀況，確定其生長(zhǎng)的最適pH值。

耐鹽能力的測(cè)定：在28℃條件下，將NA培養(yǎng)液中NaCl含量分別調(diào)到0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%,3.5%,4.0%,5.0%,6.0%,7.0%,8.0%和9.0%，然后接入菌體。48～72 h后取出用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，記錄OD600數(shù)值。

1.2.4菌株的分子生物學(xué)鑒定引物設(shè)計(jì)：根據(jù)16S rDNA兩端的保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)細(xì)菌的通用引物。引物1序列：5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′；引物2序列：5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

菌株DNA 的提取和純化：采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，16S rRNA基因的擴(kuò)增按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

系統(tǒng)發(fā)育分析：將純化PCR產(chǎn)物送至上海Sangon生物技術(shù)公司測(cè)序，并將獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的與該序列相似性較高的典型菌株的序列進(jìn)行同源性比較。采用Clustal 1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再用 MEGA 4.1中的Neighbor-joining (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.3數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和分析，并用Excel軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1菌種形態(tài)特征

將初次分離的8株細(xì)菌接在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，對(duì)菌落形態(tài)特征進(jìn)行描述(表1)。

表1　菌落培養(yǎng)特征描述

2.2纖維素分解能力的測(cè)定

2.2.1菌種分解CMC-Na能力測(cè)定將8株分離獲得的具有纖維素分解能力的細(xì)菌，根據(jù)水解圈直徑(D2)與菌落直徑(D1)的比值可以看出，菌株X1-2分解纖維素的能力最強(qiáng)，X1-1和X2次之，X5的纖維素分解能力最弱(表2)。

2.2.2濾紙崩解試驗(yàn)對(duì)獲得的8株纖維素分解細(xì)菌進(jìn)行搖瓶濾紙崩解試驗(yàn)，探究其纖維素分解能力，在15 d的濾紙崩解試驗(yàn)中，有3株細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的濾紙降解效果(圖1)，其菌株X1-1、X1-2和X2中濾紙基本完全崩解，搖瓶中的液體處于半清狀，表明該3株細(xì)菌對(duì)濾紙具有明顯的分解能力。

2.2.3中華羊茅分解定量測(cè)定根據(jù)獲得的菌株在CMC-Na平板上的生長(zhǎng)情況和水解結(jié)果，以及濾紙的崩解試驗(yàn)結(jié)果，選擇3株細(xì)菌X1-1、X1-2和X2進(jìn)一步研究它們對(duì)中華羊茅纖維素的分解效果。對(duì)3株細(xì)菌分別培養(yǎng)5,10,15 d后的中華羊茅重量變化情況進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。

表2　纖維素分解菌株的CMC-Na分解能力測(cè)定

D1:菌落直徑 Diameter of the colony;D2: 水解圈直徑Hydrolysis circle diameter.

圖1　培養(yǎng)15 d后菌株對(duì)濾紙的崩解效果Fig.1　Disintegration of filter paper with isolates after culturing for 15 days

圖2　培養(yǎng)15 d后菌株對(duì)中華羊茅的分解效果Fig.2　Disintegration of F. sinensis with isolates after culturing for 15 days

項(xiàng)目Item時(shí)間Time(d)5X1-1X1-2X210X1-1X1-2X215X1-1X1-2X2CK5.005.005.005.005.005.005.005.005.00殘余質(zhì)量Residualmass(g)4.524.314.483.863.253.973.122.243.36分解率Resolutionratio(%)9.813.911.322.835.026.336.255.432.8

培養(yǎng)5 d后，3株細(xì)菌對(duì)中華羊茅纖維素都有所分解，但差異性不顯著，其中中華羊茅的分解率分別為9.8%，13.9%和11.3%。培養(yǎng)10 d后3株菌株對(duì)中華羊茅的分解率都有了顯著的增加，分別為22.8%，35.0%和26.3%，尤其是菌株X1-2降解中華羊茅纖維素的能力最高，繼續(xù)培養(yǎng)至15 d后菌株X1-2使得中華羊茅的分解率達(dá)到了55.4%，分解效果明顯。

2.3菌株生物學(xué)特性測(cè)定

2.3.1溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，接菌培養(yǎng)3 d后，3種菌在15～45℃均能夠生長(zhǎng)。X1-1最適生長(zhǎng)溫度為25℃，在30和35℃均生長(zhǎng)良好，與25℃相比差異顯著(P<0.05)，低于25℃，在15,10和5℃時(shí)菌體生長(zhǎng)明顯受阻，與25℃相比差異顯著(P<0.05)； X1-2最適生長(zhǎng)溫度為25℃， 低于20℃或高于30℃對(duì)菌體生長(zhǎng)均產(chǎn)生明顯的差異(P<0.05)；X2在15～45℃之間生長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，且隨著溫度的上升，生長(zhǎng)有增強(qiáng)趨勢(shì)，屬高溫菌(表4)。

2.3.2pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，3株細(xì)菌在pH為4.5～8.5之間均能生長(zhǎng)，但最適生長(zhǎng)的pH值存在較大差異。X1-1偏酸性，最適pH值為5.5，與pH為5.0差異不顯著(P>0.05)，大于5.5或小于5.0均存在顯著性差異(P<0.05)；X1-2生長(zhǎng)的酸度范圍較廣；X2的最適pH均為8.5，大于或小于8.5存在顯著差異(P<0.05)?？傮w可見(jiàn)偏酸環(huán)境(pH<4.5)對(duì)3種菌均有不同程度的抑制作用，與對(duì)照無(wú)明顯差異(P>0.05)(表5)。

2.3.3鹽濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)表明，每種菌體的最適鹽濃度不同，X1-1最適鹽濃度為6.0%，與5.0%差異不顯著(P>0.05)，大于6.0%或小于5.0%均存在顯著差異(P<0.05)； X1-2最適鹽濃度為3.0%，與1.0%，1.5%，2.0%和2.5%差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明X1-2耐鹽性較差；X2在0.5%～8.0%的鹽度范圍內(nèi)生長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，即X2對(duì)鹽度具有廣泛的適應(yīng)性，有一定的耐鹽能力；總體上3個(gè)菌株的鹽濃度承受值X2>X1-1>X1-2(表6)。

表4　溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

OD:平均OD值Mean of OD.同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters in the same column indicate the significant differences (P<0.05). The same below.

表5　pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

表6　鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4菌株形態(tài)特征和16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

綜合評(píng)價(jià)幾株細(xì)菌的CMC-Na水解圈試驗(yàn)、濾紙崩解試驗(yàn)以及中華羊茅分解試驗(yàn)，菌株X1-2對(duì)纖維的分解能力最強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，易培養(yǎng)，具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的潛力，因此，本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行了分析鑒定(圖3和圖4)。

菌株X1-2為好氧、桿狀，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，菌落乳白色，表面無(wú)光澤且較粗糙，邊緣不整(圖3A)。在NA培養(yǎng)基上，易培養(yǎng)，生長(zhǎng)較快，革蘭氏陽(yáng)性菌(圖3B)。

圖3　菌株X1-2菌落和菌體形態(tài)Fig.3　Micrograph of strain X1-2 with colonies on a NA plate and its morphology 　A：NA培養(yǎng)基中菌落照片NA medium colony photos；B：革蘭氏染色顯微照片Gram staining micrograph.

圖4　菌株X1-2的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4　Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequences of strain X1-2

由測(cè)序結(jié)果可知，菌株X1-2的16S rRNA 序列全長(zhǎng)為1443 bp。通過(guò)與GenBank中序列比對(duì)，調(diào)取與之基因序列最為相近的菌種使用MEGA 5.0進(jìn)行Clustal X多序列匹配比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明，菌株X1-2與芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切。結(jié)合形態(tài)特征，初步確定菌株X1-2屬于芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3結(jié)論與討論

3.1多指標(biāo)篩選體系的建立

濾紙屬纖維素類(lèi)物質(zhì)，能夠在濾紙上生長(zhǎng)的菌種，說(shuō)明可以利用濾紙作為碳源，濾紙片液體培養(yǎng)基中濾紙片的潰爛程度可以證明供試菌種具有纖維素分解能力。在本研究中首先以供試菌種在CMC-Na培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況和透明圈大小作為指標(biāo)，篩選出具有纖維素分解能力的細(xì)菌，然后結(jié)合濾紙平板上的生長(zhǎng)情況、濾紙片液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，選用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行初步篩選，避免了單一篩選方法的不足，多指標(biāo)篩選體系的建立可防止試驗(yàn)誤差可能出現(xiàn)的漏選菌種。

3.2纖維素分解細(xì)菌的特性

細(xì)菌分解纖維素時(shí)，首先是細(xì)菌黏附在纖維素上，在多種酶的協(xié)同作用或多纖維素酶的作用下，在接觸點(diǎn)纖維素被溶解，細(xì)菌從纖維素的表面向內(nèi)增生，逐漸分解纖維素。由于天然分解菌活性低、降解速度慢，而纖維素的降解需要多種酶協(xié)同作用，所以充分利用自然界多種微生物的協(xié)同關(guān)系，人工篩選構(gòu)建能夠產(chǎn)生多種纖維素酶的高效穩(wěn)定菌系，引起了人們的高度重視。

3.3纖維素分解細(xì)菌穩(wěn)定性的研究

穩(wěn)定性試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界條件(如溫度、pH值、鹽濃度)幾乎相同時(shí)，3個(gè)菌種一直很穩(wěn)定。采用CMC-Na培養(yǎng)基和剛果紅染色相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選，淘汰了纖維素分解能力不穩(wěn)定的菌株，保證了具有穩(wěn)定遺傳特性的菌株基因資源，將菌株的穩(wěn)定性作為一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行篩選，目標(biāo)性更強(qiáng)，并且具有實(shí)際的意義。

3.4培養(yǎng)條件對(duì)菌種的影響

研究供試菌種的培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，對(duì)了解菌體的生物學(xué)以及生理學(xué)特性具有重要的意義，尤其是對(duì)一些新的微生物資源的認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)利用更具有不可估測(cè)的作用。本研究通過(guò)溫度、pH值、鹽濃度3個(gè)培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)進(jìn)行了初步研究。

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Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity

JIA Hui1, CHEN Xiu-Rong1*, LU Guang-Xin2*, KONG Ya-Li1, YANG Cheng-De1

1.KeyLabofGrasslandEcosystemofMOE,CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.DepartmentofGrasslandScience，AgricultureandAnimalHusbandryCollegeofQinghaiUniversity,Xining810016,China

Abstract:Eight bacterial strains were isolated from soil in the east Qilian Mountains. Of these, four strains had a higher capacity for degradation of plant cellulose when cultured on a CMC-Na plate medium. The growth characteristics of the four strains were studied, and the optimum temperature range of the 4 active strains was 25-30℃, the optimum pH for growth was 5-8, and the optimum sodium concentration was 4% to 5%. A strain designated X1-2 possessed the highest cellulose degradation ability. Based on morphology, gram stain reaction, and 16S rRNA phylogenetic comparison, this strain was identified as a member of the genus Bacillus (Bacillus sp.). It is a bacterium with strong plant cellulose degradation ability.

Key words:cellulose-decomposing bacteria; screening; biological characteristics; degradation

*通信作者

Corresponding author. E-mail:chenxiurong@gsau.edu.cn，lugx74@qq.com

作者簡(jiǎn)介：賈輝(1981-),男,甘肅古浪人,在讀博士。E-mail:jiah66@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460152，41261064)和青海省科技廳項(xiàng)目(2014-ZJ-924Q)資助。

收稿日期：2014-04-08；改回日期：2015-09-07

DOI：10.11686/cyxb2014172

http://cyxb.lzu.edu.cn

賈輝，陳秀蓉，蘆光新，孔雅麗，楊成德. 纖維素降解細(xì)菌的篩選、生物學(xué)特性及降解效果. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 60-66.

JIA Hui, CHEN Xiu-Rong, LU Guang-Xin, KONG Ya-Li, YANG Cheng-De. Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 60-66.