慢病毒shRNA靶向干擾RegⅣ基因胰腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建

李　健　胡啟立　徐　凌　衛(wèi)　巍　趙　嚴(yán)　劉　華　湯茂春　宋振順　夏小俊　王興鵬,5　王　鋒△

(1同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院普外科,2消化內(nèi)科，4急診科　上?！?00072; 3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬

同仁醫(yī)院消化內(nèi)科　上海　200336;5上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科　上?！?00080)

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慢病毒shRNA靶向干擾RegⅣ基因胰腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建

李健1胡啟立1徐凌2,3衛(wèi)巍4趙嚴(yán)2劉華2湯茂春2宋振順1夏小俊2王興鵬2,5王鋒2△

(1同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院普外科,2消化內(nèi)科，4急診科上海200072;3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬

同仁醫(yī)院消化內(nèi)科上海200336;5上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科上海200080)

【摘要】目的構(gòu)建并鑒定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短發(fā)夾干擾RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體,繼而建立穩(wěn)定干擾RegⅣ基因表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1。方法使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction,PCR)檢測RegⅣ基因在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。構(gòu)建重組靶向干擾RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將載體導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞株。使用熒光定量PCR檢測干擾效率。RegⅣ基因過表達(dá)載體的構(gòu)建方法為:將獲取的目的基因與pEGFP-RegⅣ-3FLAG過表達(dá)質(zhì)粒載體分別進(jìn)行雙酶切,利用電泳回收雙酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行測序驗(yàn)證,驗(yàn)證成功后,使用Western blot檢測其在293T細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果PCR結(jié)果顯示RegⅣ在PANC-1中表達(dá)最高,在BxPC-3中表達(dá)最低。測序驗(yàn)證pGC-shRNA-RegⅣ重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1后能明顯抑制RegⅣ mRNA 表達(dá)水平。過表達(dá)載體pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后進(jìn)行Western blot鑒定,驗(yàn)證pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ過表達(dá)載體構(gòu)建成功。過表達(dá)RegⅣ基因轉(zhuǎn)染BxPC-3后,與空質(zhì)粒組相比,RegⅣ表達(dá)量明顯提高。結(jié)論成功建立了靶向穩(wěn)定干擾RegⅣ基因表達(dá)的shRNA胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1。

【關(guān)鍵詞】胰腺癌;再生基因4;慢病毒;短發(fā)夾干擾RNA

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81472578) and Science and Technology Commission of Shanghai Municipality,China (11JC1410000).

胰腺癌是一種病情進(jìn)展快、早期診斷困難、早期易轉(zhuǎn)移、惡性程度高的疾病,其發(fā)病率幾乎等同于死亡率并且呈上升趨勢。胰腺癌的平均生存時間小于6個月,5年生存率小于5%,死亡率高居癌癥死亡率的第4～5位[1]。如此差的預(yù)后歸因于其早期易轉(zhuǎn)移的特性。因此,針對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的研究是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)性工作。

Reg家族屬鈣依賴植物血凝素超家族,該家族屬于分泌型蛋白,具有急性期反應(yīng)、凝集素和抗凋亡及促進(jìn)生長作用,在G1期增殖和分化中起重要作用,共有4個成員:RegⅠ、RegⅡ、RegⅢ及RegⅣ。近年來在人群、動物模型及細(xì)胞家系的研究中發(fā)現(xiàn),RegⅣ在多種胃腸道腫瘤具有特異性表達(dá),某些對腫瘤的轉(zhuǎn)歸起到關(guān)鍵作用,如RegⅣ能提高胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移率,有助于早期胃癌及腹腔轉(zhuǎn)移的臨床診斷,在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)RegⅣ后能顯著影響細(xì)胞株對5-Fu的敏感性,說明RegⅣ可能抑制某些抑癌藥的效果[2-3];大腸癌患者復(fù)發(fā)后肝轉(zhuǎn)移病例的RegⅣ陽性率明顯高于無肝轉(zhuǎn)移的病例,RegⅣ高表達(dá)患者的生存率明顯低于低表達(dá)的患者,提示血清RegⅣ可能會預(yù)測CRC肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4-5],RegⅣ還與大腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),并且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[6]。

在RegⅣ的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),RegⅣ能將胞外信號傳遞給EGFR和AKT，增加了AP-1轉(zhuǎn)錄因子活性,從而導(dǎo)致下游效應(yīng)的放大,因此RegⅣ可能作為EGFR/Akt/AP-1信號通路的激活劑參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。我們之前的胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)RegⅣ是Hedgehog信號通路中轉(zhuǎn)錄因子Gli1的靶基因,起到信號傳遞作用,最終起到影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[8]。

RegⅣ是再生基因家族 (regenerating gene family)最新發(fā)現(xiàn)的成員,是目前Reg家族中最短小的一個,有6個外顯子和5個內(nèi)含子,編碼158個氨基酸的蛋白質(zhì),基因定位于染色體1p12～13.1,其17 000的蛋白產(chǎn)物在消化系統(tǒng)的上皮層特異性地表達(dá),在胃腸道細(xì)胞的增殖分化過程中發(fā)揮重要作用,并同消化系腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移和抗藥性有關(guān)。RegⅣ在胰腺癌的杯狀囊泡狀結(jié)構(gòu)中或腫瘤細(xì)胞胞漿中表達(dá),其在胰腺癌組織以及胰腺上皮內(nèi)瘤變3期 (PanIN3)標(biāo)本及胰腺癌患者血清中均呈高表達(dá)[9-10]。重組RegⅣ蛋白能呈劑量依賴性促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長,其促生長效應(yīng)可能通過PKB/AKT信號通路介導(dǎo),而RegⅣ的單克隆抗體能抑制胰腺癌細(xì)胞的生長[9-10]。RegⅣ在胰腺癌中的高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),高表達(dá)RegⅣ的胰腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)抵抗化療及放療的作用,且更易于發(fā)生局部復(fù)發(fā)[11]。我們還證實(shí)RegⅣ是Hedgehog信號通路下游靶基因[11]，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。為了更好地研究RegⅣ基因在胰腺癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,并為后續(xù)的基因治療提供理論基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)成功設(shè)計(jì)了針對RegⅣ基因的shRNA序列,構(gòu)建了過表達(dá)載體,并成功構(gòu)建了低表達(dá)RegⅣ基因的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1。

材 料 和 方 法

材料PCR 引物、雙鏈脫氧核糖核酸Oligo (上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成),慢病毒載體系統(tǒng) (上海吉凱基因技術(shù)有限公司)包括3種質(zhì)粒(pGCSIL-GFP載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體),其中pGCSIL-GFP載體含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及WRE等輔助元件,同時含有GFP基因,pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包裝所需的元件。慢病毒的包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞株 (中國科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫),胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990 均由上海市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科保留。限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶 (英國New England Biolabs公司),DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS，美國Gibco公司)、胰蛋白酶 (美國Invitrogen公司),大量質(zhì)粒提取試劑盒 (德國Qiagen公司),Lipofectamine2000 (美國Invitrogen公司)。

方法

RT-PCR、Western blot法檢測各胰腺癌細(xì)胞株RegⅣ的表達(dá)按照Trizol試劑盒說明提取5種胰腺癌細(xì)胞株 (AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990)總RNA,RT-PCR引物 (上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)。RegⅣ上游引物:5′-CGCTGAGATGAACCCC-AAG-3′,下游引物:5′-TGAGAGGGAAGTGGGA-AGAG-3′,擴(kuò)增長度145 bp;β-actin上游引物:5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′,下游引物:5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′,擴(kuò)增長度為145 bp；循環(huán)參數(shù)制定為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、進(jìn)行40個循環(huán)后采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白,利用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品,以12%SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗 (1∶100)4 ℃孵育過夜,加入二抗 (1∶500)孵育1 h,洗膜后,以化學(xué)發(fā)光液顯像,暗室中進(jìn)行X光片壓片、顯影、定影后得到目的蛋白表達(dá)變化條帶。取重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

RegⅣ-shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建RegⅣ (NM_001159352.1)的基因信息來自GenBank,siRNA靶位點(diǎn)的尋找從RegⅣ開放閱讀框起始密碼子“ATG” 開始,在其下游75至100堿基位置后選取“AA”二連序列后的21個堿基序列。siRNA的設(shè)計(jì)優(yōu)先選擇GC含量在40%～55%之間的靶基因序列,為了排除同源序列,確定特異性序列,需要將選擇的序列與在Gen-Bank中檢索獲得的基因組數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行比較。設(shè)計(jì)4對小干擾RNA序列 (表1)。為了使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在每一單鏈內(nèi)21nt的寡核苷酸以正反向組合,中間添加loop結(jié)構(gòu)。在shRNA 3′端和5′端分別引入AgeI和EcoR I酶切位點(diǎn),終止信號TTTTT連接在反義片段后從而終止轉(zhuǎn)錄,使后續(xù)克隆與鑒定更加方便。取等摩爾量的寡核苷酸干擾片段正負(fù)鏈,將其溶于退火緩沖液中,溫度為90 ℃水浴中放置15 min,待其緩慢降至室溫,即可獲得具有EcoR I和AgeI酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA。將上面獲得的雙鏈DNA和pGCSIL-GFP載體進(jìn)行連接,即可獲得PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒載體,分別命名為shRNA-RegⅣ-1、shRNA-RegⅣ-2、shRNA-RegⅣ-3、shRNA-RegⅣ-4。將上述4種載體轉(zhuǎn)化到DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中,搖菌后接種到LB瓊脂培養(yǎng)[(含Amp抗性 (100 μg/mL)]上在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)16 h,然后將生長的單菌落群進(jìn)行基因測序以及PCR檢測。

RegⅣ基因過表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR的方法從cDNA文庫中獲取目的基因,上述產(chǎn)物與pEGFP-RegⅣ-3FLAG過表達(dá)質(zhì)粒載體分別進(jìn)行XhoI、kpnI雙酶切,定向交換后通過電泳回收的雙酶切產(chǎn)物,然后轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞并且進(jìn)行測序驗(yàn)證,正確后需要Western blot進(jìn)一步檢測該質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度。

慢病毒顆粒的包裝和滴度測定首先使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞,然后選擇干擾最明顯的shRNA與載體質(zhì)粒pHelper 1.0及pHelper 2.0以及重組慢病毒載體PGC-shRNA-RegⅣ共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)8 h和48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá),觀察是否有明顯的綠色熒光,然后收集細(xì)胞上清液,其中含慢病毒顆粒。選取96孔板,每孔鋪4×104個293T細(xì)胞,總體積為100 μL。分別加入90 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基于無菌的Ep管中,數(shù)量7～10個,其根據(jù)為病毒的預(yù)期滴度。將待測定的病毒原液10 μL加入到第1個Ep管中混勻,取其中的10 μL加入到第2個Ep管中,以此類推直到最后一管。選擇需要的細(xì)胞孔,丟棄其90 μL培養(yǎng)基,補(bǔ)充90 μL稀釋后的病毒溶液培養(yǎng)24 h,再補(bǔ)充100 μL的完全培養(yǎng)基,在熒光顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞比例在10%左右的孔中熒光細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)滴度計(jì)算公式:熒光細(xì)胞數(shù)×相應(yīng)稀釋倍數(shù),即可計(jì)算出病毒原液的滴度值,單位為 (TU)/mL[9]。

穩(wěn)定表達(dá)PGC-shRNA-RegⅣ人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的感染與篩選選取6孔板,將PANC-1細(xì)胞分別鋪入6孔板中培養(yǎng),共設(shè)3組,分別為:PGC-shRNA-RegⅣ實(shí)驗(yàn)組、空白對照組以及空載體組。轉(zhuǎn)染液的配制:50 μL的OPTI-DMEM與2 μL Lipofectamine 2000 混和為A液,50 μL OPTI-DMEM與1 μL PGC-shRNA-RegⅣ混合為B液,將A液與B液混合后即獲得轉(zhuǎn)染液。將上述轉(zhuǎn)染液室溫放置20 min混勻,加入6孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,棄去轉(zhuǎn)染液,換無抗生素的含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,在熒光顯微鏡下觀察慢病毒RNAi質(zhì)粒上GFP的表達(dá) (綠色熒光),觀察到至少80%以上的熒光表達(dá)。然后即可進(jìn)行篩選,將6孔板中得培養(yǎng)基換為含殺稻瘟菌素 (1.25μg/mL)的選擇性培養(yǎng)基,培養(yǎng)2周后觀察是否有含抗體的細(xì)胞長出。若有細(xì)胞長出,則繼續(xù)傳代培養(yǎng)即可獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

熒光定量PCR以及Western blot法共同檢測穩(wěn)定干擾后RegⅣ的表達(dá)為檢測RegⅣ在各種細(xì)胞中的表達(dá)情況,選取3種細(xì)胞,分別為:PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。分別提取總RNA,使用紫外分光光度儀進(jìn)行RNA定量,分別取2 μg RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用RT-PCR檢測含量 (RT-PCR擴(kuò)增條件設(shè)置:95 ℃ 35 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán))。RegⅣ及內(nèi)參基因引物同前。結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析 (ACt=待測基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,-AACt=對照組平均Act-樣本Act,2-AAc代表基因相對對照組的表達(dá)倍數(shù))。重復(fù)3次后取其平均值。

結(jié)果

RegⅣ在各種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示,RegⅣ在PANC-1中的mRNA水平在5株胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)最高,而BxPC-3表達(dá)量最低。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中也得到同樣的數(shù)據(jù)。選擇PANC-1和BxPC-3細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn) (圖1)。

PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒載體的PCR電泳及測序鑒定將表達(dá)RegⅣ基因的shRNA片段與載體連接后進(jìn)行PCR電泳,回收電泳中重組陽性克隆,進(jìn)行測序 (由上海生工完成),其測序結(jié)果顯示:4組重組的RNA干擾慢病毒載體與設(shè)計(jì)合成的靶向鏈?zhǔn)且恢碌?(圖2)。證實(shí)shRNA慢病毒干擾載體已成功構(gòu)建。

DNA were collected from 5 pancreatic cancer cell lines,and relativeRegⅣ mRNA expression were detected by qRT-PCR.All results were normalized to β-actin mRNA.Expression ofRegⅣ proteins in 5 pancreatic cancer cell lines were detected by Western blot analysis on cell extracts,using anti-RegⅣ antibodies.Expression ofRegⅣ is the highest in PANC-1 cell line both in mRNA level and protein level.

圖1RegⅣ基因在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

Fig 1The expression ofRegⅣ in

pancreatic cancer cell lines

RegⅣ基因的過表達(dá)載體的鑒定成功合成過表達(dá)載體pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ后,首先進(jìn)行Western blot測試,在蛋白水平上進(jìn)行鑒定 (圖3)。圖3中泳道1為WB標(biāo)準(zhǔn)品 (48 000),帶FLAG標(biāo)簽,以及融合GFP基因;泳道2為空載的293T細(xì)胞樣品,無表達(dá);泳道3為過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T后的樣品,其中插入的基因片段為477 bp。對3種樣品進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果顯示在45 000處有條特征帶。

慢病毒載體包裝及其滴度測定將RegⅣ-1干擾序列質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 (圖4),在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量,將熒光細(xì)胞比例在10%左右的孔選擇出來,計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞個數(shù)。病毒原液的滴度值=以上計(jì)數(shù)×相應(yīng)的稀釋倍數(shù),本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果為2.3×108TU/mL,說明病毒已經(jīng)包裝成功,已經(jīng)有大量質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。

RegⅣ基因的干擾效率檢測使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對各個慢病毒載體構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株的RegⅣ表達(dá)情況進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示其RegⅣ表達(dá)量分別為:共轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為95.63%±1.38%;RegⅣ-1干擾序列組為81.77%±1.82%,RegⅣ-2干擾序列組為13.53%±1.76%,RegⅣ-3干擾序列組為60.43%±0.87%,RegⅣ-4干 擾序列組為23.80%±3.06%,RegⅣ-1、RegⅣ-2、RegⅣ-3、RegⅣ-4干擾序列組與空質(zhì)粒組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),其中RegⅣ-1干擾效果最明顯,在mRNA水平中得到同樣的結(jié)果。可見RegⅣ-shRNA可明顯抑制RegⅣ基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的表達(dá) (圖5)。

The sequence of positive recombinant colons products is the same as that of sequences of primers showed in Tab 1.

圖2重組陽性克隆的測序結(jié)果

Fig 2The result of sequence analysis of positive recombinant colons products

1:Standard control; 2:293T cell without transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ;3:293T cell transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ.

圖3重組過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-3FLAG-

RegⅣ Western blot鑒定

Fig 3Recombinant over-expression virus vector pEGFP-

N1-3FLAG-RegⅣ tested by Western blot

A:Phase image×100;B:Fluorescence image× 100.

圖4重組慢病毒轉(zhuǎn)染后熒光圖

Fig 4Fluorescence microscope image after transfected

with recombinant virus vector

過表達(dá)RegⅣ基因的效率檢測采用2-△△Ct法分析比較過表達(dá)RegⅣ基因轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞株后RegⅣ的相對表達(dá)。結(jié)果顯示:在與親本對照組相比較時,空質(zhì)粒組RegⅣ mRNA相對表達(dá)水平無明顯變化,過表達(dá)組相對RegⅣ表達(dá)量為339.00%±13.26% (圖6)。

討論

RNAi技術(shù)包括小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),小發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA),雙鏈RNA (double-stranded RNA,dsRNA),微小RNA (microRNAs,miRNA)等。shRNA是具有緊密發(fā)夾環(huán)的一段RNA序列,發(fā)夾結(jié)構(gòu)是由兩個短反向重復(fù)序列與一個莖環(huán) (loop)序列位組成,莖環(huán)結(jié)構(gòu)的作用是分隔兩個序列,后附以TTTTT為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。載體中的啟動子可以確保shRNA的表達(dá),然后利用載體把shRNA導(dǎo)入細(xì)胞,此載體可以與shRNA一起傳遞到子代細(xì)胞中去,使子代細(xì)胞的基因也被沉默,從而得以形成穩(wěn)定持續(xù)的轉(zhuǎn)染效果。RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物 (RNA-induced silencing complex,RISC)可以結(jié)合siRNA,此siRNA來源為被細(xì)胞機(jī)制切割的shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu),這些發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以降解目的基因mRNAs而發(fā)揮RNA干擾效應(yīng)。常用的病毒表達(dá)載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒等,具有特異、高效的轉(zhuǎn)染效率,RNAi效應(yīng)高,抑制作用穩(wěn)定持續(xù)。但是逆轉(zhuǎn)錄病毒與腺病毒載體系統(tǒng)也都有一定的弊端,如腺病毒載體在實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)方面能力不足,并且在多次使用會引起免疫反應(yīng)[12];而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的不足主要表現(xiàn)在當(dāng)其應(yīng)用于主要處于靜止期的細(xì)胞時,其長期表達(dá)的特點(diǎn)就難以體現(xiàn)[13],并具有免疫原性和致瘤性問題[14]。本組采用的慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-1),是攜帶干擾RNA的理想載體,其優(yōu)勢在于相對較低的免疫原性和細(xì)胞毒性,當(dāng)其整合到宿主細(xì)胞時,可以使得目的基因穩(wěn)定表達(dá),另外不可忽視的優(yōu)點(diǎn)在于,其感染效率很高,對于大片段的外源性目的基因包容性較強(qiáng)[15]。

本研究設(shè)計(jì)的4對干擾靶序列來源是依據(jù)PubMed Home所提供的RegⅣ的基因信息,再經(jīng)過載體連并且隨后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中后,進(jìn)行陽性克隆的篩選,測序鑒定結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)的序列相一致,說明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了4對shRNA-RegⅣ慢病毒載體。本實(shí)驗(yàn)隨后又將shRNA-RegⅣ慢病毒載體和已經(jīng)表達(dá)目的基因的克隆質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并用Western blot進(jìn)行了蛋白水平的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的載體對目的基因的敲減作用很顯著。經(jīng)過一系列的慢病毒包裝以及滴度檢測,使得重組慢病毒載體感染細(xì)胞的效率較高。當(dāng)目的基因進(jìn)入細(xì)胞后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄從而整合到基因組中對RegⅣ產(chǎn)生了持續(xù)、高效、特異的抑制,為了使后期研究更具有說服力,我們還成功構(gòu)建了RegⅣ過表達(dá)載體,奠定了后期對RegⅣ在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制和動物實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)。

1:PANC-1 transfected with empty vector control; 2:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ1;3:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ2; 4:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ3; 5:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ4.

圖5RT-PCR及Western blot法檢測PANC-1細(xì)胞中

RegⅣ基因的表達(dá)

Fig 5Expression ofRegⅣ mRNA and proteins were detected

by Western blot and RT-PCR in PANC-1 cell lines

1:BxPC-3; 2:BxPC-3 transfected with empty vector control; 3:BxPC-3 transfected with over-expression vectorRegⅣ.

圖6RT-PCR檢測RegⅣmRNA在3組細(xì)胞中的表達(dá)情況

Fig 6Expression ofRegⅣ mRNA in three groups by RT-PCR

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Establishment of pancreatic cancer cells with stable interference by lentivirus shRNA targetingRegⅣ gene

LI Jian1, HU Qi-li1, XU Ling2,3, WEI Wei4, ZHAO Yan2, LIU Hua2, TANG Mao-chun2,SONG Zhen-shun1, XIA Xiao-jun2, WANG Xing-peng2,5, WANG Feng2△

(1DepartmentofGeneralSurgery,2DepartmentofGastroenterology,4DepartmentofEmergency,ShanghaiTenthPeople’sHospital，TongjiUniversity,Shanghai200072,China;3DepartmentofGastroenterology,TongRenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China;5DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct siRNA expression and overexpression vector targeting RegⅣ gene and establish the pancreatic cancer cells PANC-1 with stable inhibition or stable over-expression of RegⅣ gene.MethodsRegⅣ gene expression were examined in several pancreatic cancer cell lines by real-time PCR.The recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector and pEGFP-N1-3FLAG-Reg Ⅳ vector were constructed,and then transfected into pancreatic cancer cells by Lipofectamine2000.After pancreatic cancer cells with constant expression of the pGC-shRNA-RegⅣ were established,the interference efficiency of RegⅣ mRNA expression was detected by real-time PCR.ResultsThere was highest expression of RegⅣ gene in the pancreatic cancer cell line PANC-1 and lowest expression in BxPC-3.Recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector was successfully constructed by the identification of sequencing.The recombinant vector markedly inhibited RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line PANC-1.Recombinant lentivirus pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ vector was successfully constructed by sequencing and Western blot, which markedly increased RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line BxPC-3. ConclusionsRecombinant lentivirus vector pGC-shRNA-RegⅣ and overexpression vector pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ targeting RegⅣ gene was successfully constructed and pancreatic cancer cell line PANC-1 with stable siRNA expression targeting RegⅣ gene and BxPC-3 with stable over-expression were established.

【Key words】pancreatic cancer;regenerating islet-derived family member 4 gene;lentivirus vector;short hairpin RNA

(收稿日期:2015-09-06;編輯:王蔚)

【中圖分類號】R576

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.004

國家自然科學(xué)基金(81472578);上海市科學(xué)技術(shù)委員會基金(11JC1410000)

△Corresponding authorE-mail:wolffeng2000@hotmail.com