鳥胞內(nèi)分枝桿菌mmpL11同源基因序列分析及功能預(yù)測(cè)

王文靖，孫　妍，王心倩，余曉麗*

(1.南陽(yáng)市第二中學(xué)，河南 南陽(yáng) 473000；

2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

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鳥胞內(nèi)分枝桿菌mmpL11同源基因序列分析及功能預(yù)測(cè)

王文靖1，孫妍2，王心倩2，余曉麗2*

(1.南陽(yáng)市第二中學(xué)，河南 南陽(yáng) 473000；

2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

摘要：以非結(jié)核分枝桿菌中的胞分枝桿菌、鳥分枝桿菌兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株為研究對(duì)象，以恥垢分枝桿菌mc2 155和結(jié)核分枝桿菌H37Rv為對(duì)照，對(duì)其mmpL11同源基因進(jìn)行序列分析，并對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)，為后期的抗酸染色陽(yáng)性菌診斷，藥物靶標(biāo)的篩選提供理論基礎(chǔ)。根據(jù)同源比對(duì)找到兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的mmpL11同源基因；應(yīng)用expasy工具預(yù)測(cè)MmpL11同源蛋白理化性質(zhì)；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用TMHMM在線工具進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用Interproscan工具對(duì)蛋白保守序列和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用SSpro對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。OCU48920蛋白的理化性質(zhì)分析顯示：其氨基酸個(gè)數(shù)為1 018，分子量為108.4 kD，理論等電點(diǎn)為7.61，疏水指數(shù)為0.227；MAP3637c蛋白的理化性質(zhì)分析顯示：其氨基酸個(gè)數(shù)為1 007，分子量為107.2 kD，理論等電點(diǎn)為8.59，疏水指數(shù)為0.231。信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11均不存在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽存在。跨膜預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其跨膜次數(shù)分別為12和12肽鏈，N端均在膜內(nèi)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-片層為主。保守序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11蛋白均有兩個(gè)MMPL跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)固醇敏感多肽區(qū)。OCU48920、 MAP3637c為H37Rv的MmpL11同源蛋白，推測(cè)其功能同MmpL11相似，是分枝菌酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與胞內(nèi)小分子的運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：非結(jié)核分枝桿菌；MmpL11；序列分析；功能預(yù)測(cè)

鳥胞內(nèi)分支桿菌復(fù)合體(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)是細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，在吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖，并能引起AIDS病人的機(jī)會(huì)性感染。一般說來，目前市場(chǎng)上有效的藥物單用，甚至多藥聯(lián)合都難以根治MAC感染[1]。是非結(jié)核分枝桿菌(NontuberculosisMycobacteria，NTM)為抗酸染色陽(yáng)性菌，臨床癥狀多與結(jié)核分枝桿菌感染相似，容易誤診為由結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病，且對(duì)多種抗結(jié)核藥物具有耐藥性[2-3]。

MmpL蛋白家族是分枝桿菌耐受-結(jié)節(jié)-分裂家族(Resistance-nodulation-cell division family,RND家族)超家族蛋白中的一種膜蛋白，是影響分枝桿菌的生存和毒力的關(guān)鍵因子之一，在結(jié)核分枝桿菌中包括MmpL1-13[4]。

RND家族中固醇敏感多肽區(qū)(SSD domain)在膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在基因組中，有大約20%～30%的基因產(chǎn)物被預(yù)測(cè)為膜蛋白，在藥物研發(fā)過程中，膜蛋白偶聯(lián)受體是絕大多數(shù)藥物的作用靶點(diǎn)，跨膜蛋白在生物體中擔(dān)負(fù)著各種各樣的重要功能：細(xì)胞的運(yùn)輸，細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)的傳遞及能量轉(zhuǎn)換等[6]。由于膜蛋白數(shù)量巨大而且功能多樣，因此通過跨膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能對(duì)其功能進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。

以非結(jié)核分枝桿菌胞分枝桿菌、鳥分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為研究對(duì)象，恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和H37Rv為對(duì)照，對(duì)其MmpL11進(jìn)行同源性分析、理化性質(zhì)分析、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步闡明抗酸染色陽(yáng)性非結(jié)核分枝桿菌的毒力、致病機(jī)制和疾病研究提供理論依據(jù)。

1方法和步驟

1.1方法

運(yùn)用生物信息學(xué)方法，通過序列對(duì)比，理化性質(zhì)分析，信號(hào)肽預(yù)測(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，保守序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析等生物信息學(xué)手段[7]，對(duì)胞分枝桿菌(M.intracellulareATCC13950)，鳥分枝桿菌(M.aviumsubsp.paratuberculosisK-10)，恥垢分枝桿菌(M.smegmatistrmc2 155)的MmpL11進(jìn)行同源序列分析及功能預(yù)測(cè)。

1.2步驟

1.2.1MmpL 11同源序列比對(duì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找結(jié)核分枝桿菌(MTB)H37Rv的MmpL11的氨基酸序列，在BLAST搜索兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的同源序列。

1.2.2MmpL11理化性質(zhì)分析

用 ExPASy 在線序列分析工具，對(duì)MmpL11蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3MmpL 11信號(hào)肽預(yù)測(cè)

用SSpro(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件對(duì)MmpL11進(jìn)信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

1.2.4MmpL11跨膜結(jié)構(gòu)、保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對(duì)MmpL11進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)對(duì)MmpL11同源序列進(jìn)行保守序列和結(jié)構(gòu)域分析。用SSpro對(duì)MmpL11同源序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2結(jié)果

2.1MmpL11同源序列比對(duì)

同源分析結(jié)果顯示：與H37Rv的MmpL 11比較，胞分枝桿菌同源序列為OCU48920 (Ident，72%)，鳥分枝桿菌為MAP3637c (Ident，76%)，恥垢分枝桿菌為MSMEG0241 (Ident，69%)。

2.2MmpL11理化性質(zhì)分析

用 ExPASy 在線序列分析工具，對(duì)MmpL11蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，見表1。

2.3MmpL 11信號(hào)肽預(yù)測(cè)

用SSpro(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件對(duì)MmpL11進(jìn)信號(hào)肽預(yù)測(cè)，信號(hào)肽分析顯示兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11蛋白均不存在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽存在。

2.4MmpL11跨膜結(jié)構(gòu)、保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用TMHMM 2.0軟件對(duì)MmpL11及其同源序列跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，胞分枝桿菌，鳥分枝桿菌，恥垢分枝桿菌的MmpL11同源蛋白跨膜次數(shù)分別為12、12、11，且同源蛋白的肽鏈N短都分布在膜內(nèi)見圖1(a-d)。

表1　MmpL11蛋白理化性質(zhì)

圖1　MmpL11跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1　Transmembrane structure prediction of MmpL11

H37Rv的MmpL11結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示具有兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MMPL domain)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)固醇敏感多肽區(qū)(Sterol-sensing domain, SSD)，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11同源蛋白均有兩個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè) SSD結(jié)構(gòu)域，說明該同源序列既有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能又有 SSD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能見圖2(a-d)。

用SSpro對(duì)MmpL11同源序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析顯示兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和β-片層為主。

3討論

MmpL家族蛋白是一組與結(jié)核分枝桿菌藥物外排有關(guān)的一個(gè)跨膜蛋白家族，可作為抗結(jié)核藥物或菌種鑒定藥物提供靶位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在恥垢分枝桿菌中MmpL11具有攝取血紅素，轉(zhuǎn)運(yùn)多分枝酰基二?；视?MMDAG)和霉菌酸蠟脂(WE)的功能[8-13]。我們推測(cè)在恥垢分枝桿菌中MmpL11可能參與胞壁含分枝菌酸的脂類運(yùn)輸和脂類代謝。胞壁分枝菌酸在結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色、生長(zhǎng)特性、致病性和抵抗力等密切相關(guān)[14]。

兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11同源序列OCU48920、MAP3637c、MSMEG0241 與H37Rv的同源性分別為72%、76%、69%。通過理化性質(zhì)、跨膜分析、信號(hào)肽預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)域分析顯示：兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11同源序列具有疏水性，其跨膜蛋白不存在信號(hào)肽，具有一個(gè)SSD結(jié)構(gòu)域等。

圖2　MmpL11跨膜結(jié)構(gòu)Fig.2　Transmembrane domain of MmpL11

結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11蛋白均有兩個(gè)MMPL膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能區(qū)(MMPL domain)和一個(gè)固醇敏感多肽區(qū)(SSD domain)，推測(cè)其可能不僅具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能也可能具有SSD結(jié)構(gòu)域在膽固醇自我平衡調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。

4結(jié)論

通過對(duì)mmpL11基因的信息學(xué)預(yù)測(cè)，為后續(xù)深入研究MmpL11蛋白的生物學(xué)功能、驗(yàn)證 MmpL11作為藥靶的候選蛋白的可行性提供基礎(chǔ)資料，并得出如下結(jié)論。

(1)通過生物信息學(xué)對(duì)鳥胞內(nèi)分枝桿菌MmpL11的研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株中存在MmpL11的同源序列序列，這些同源序列可能在以后的研究中做為藥物標(biāo)靶設(shè)計(jì)藥物達(dá)到診斷或治療結(jié)核病的目的。

(2)在確定兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的MmpL11的同源序列的過程中跨膜次數(shù)與肽鏈N端在膜內(nèi)外的分布情況作為輔助條件進(jìn)行分析的方法未見報(bào)道。

(3)通過生物信息學(xué)篩選出一些MmpL11的同源序列，并通過生物信息學(xué)分析對(duì)其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析，為下一步對(duì)該蛋白功能的研究提供理論支持。

(4)通過生物信息學(xué)對(duì)MmpL11蛋白進(jìn)行分析是一種合理的方法，為結(jié)核分枝桿菌保守序列和靶位點(diǎn)的研究提供了新的研究思路。

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Sequence analysis and function prediction ofMycobacteriumaviumintracellularemmpL11 gene

WANG Wenjing1, SUN Yan2, WANG Xinqian2, YU Xiaoli2*

(1.TheSecondMiddleSchoolNanyang,Nanyang473000,China;2.SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)

Abstract：To provide evidence for future research on the structures and function of mmpL11(Rv0202c) in Mycobacterium, we analyzed homologous sequences, predicted topological structures and conservative domain structures of two Nontuberculous Mycobacterions named M. Intracellulare and M.avium, both of which were compared with M.Smegmatisstr MC2155 and H37Rv. According to the homologous comparison,we found two standard strains of mmpL11 homologous genes. The physicochemical properties and con-served domain of MmpL11 in M. tuberculosis were predicted by ExPASy online tools. Online tool TMHMM Server 2.0 was used to predicted the topological structure.Interproscan was used to predict conservative domain structure. SSpro was used to predict the secondary structure． According to the physical and chemical properties of protein, the amino acid number of OCU48920 was 1 018, molecular weight was 108.4 kD, theoretical isoelectric point was 7.61,hydrophobic index was 0.227, the amino acid number of MAP3637c was 1 007, the molecular weight was 107.2 kD, theoretical isoelectric point was 8.59, hydrophobic index was 0.231,the amino acid number of MSMEG0241 was 954, the molecular weight was 102.6 kD, theoretical isoelectric point was 5.98 and hydrophobic index was 0.305.By SignalP’s predicting,we found MmpL11 didn’t have signal peptide cutting locus in its three standard strains and signal peptide.The forecast of transmembrane showed that it crossed membrane 12 times and 12 peptides.N-terminal was within the membrane.Secondary structure was given priority to with alpha helix and beta patches.The prediction of conservative sequence and MmpL11 protein’s function showed two MMPL transmembrane domain (MMPL domain) structure, a sterol sensitive polypeptide area (SSD domain). OCU48920, MAP3637c were homologous proteins of H37Rv MmpL11.We speculate that their functions were similar with MmpL11, and they were transcators of mycolic-acid.These two proteins participated in transporting intracellular small molecules and signal transduction.

Keywords：Nontuberculous Mycobacterion；MmpL11 ；Sequential analysis;Function prediction

中圖分類號(hào)：Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5565(2016)01-007-06

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.02

作者簡(jiǎn)介：王文靖，女，研究方向：微生物；E-mail：2504692896@qq.com.*通信作者：余曉麗，女，教授，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)；E-mail：yxll268@126.com.

基金項(xiàng)目：武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2014cx019)。

收稿日期：2015-11-12；修回日期：2015-12-15.