幾種用于肽粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

賈維寶，劉良忠，黃　婷，曹宇翔，朱　哲，李文杰

(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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幾種用于肽粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

賈維寶，劉良忠，黃婷，曹宇翔，朱哲，李文杰

(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：考慮到生產(chǎn)實(shí)際，為了找到一種準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便的測(cè)定市售肽粉中蛋白質(zhì)含量的方法，實(shí)驗(yàn)以凱氏定氮法為參考，通過(guò)對(duì)雙縮脲法，福林酚法，考馬斯亮藍(lán)法，紫外吸收法測(cè)定不同分子質(zhì)量段的肽粉中蛋白質(zhì)含量的比較，篩選出測(cè)定肽粉中蛋白質(zhì)含量的最適方法。結(jié)果分析表明：用雙縮脲法測(cè)定的肽粉中蛋白質(zhì)含量最接近于凱氏定氮法，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，且適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：肽粉；蛋白質(zhì)測(cè)定；方法比較

1引言

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來(lái)源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[1]。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過(guò)測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進(jìn)行推算蛋白質(zhì)含量的方法；直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，直接測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法[2]。蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，目前包括定氮法[3]，雙縮脲法[4]，福林酚法(Lowry法)，紫外吸收法[5]和考馬斯亮藍(lán)法[6]。凱氏定氮法較復(fù)雜，但準(zhǔn)確，往往以凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)[7-8]。

氨基酸彼此以酰胺鍵相互連接形成的化合物稱作肽，含10個(gè)以上氨基酸殘基(<50個(gè))的肽通常被稱為多肽，而含10個(gè)以下的稱為寡肽(低聚肽，小肽，短肽)，低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量一般較低，通常在1 000 Da以下。肽是由氨基酸組成的聚合物，主要來(lái)自于蛋白質(zhì)合成或分解的中間產(chǎn)物， 其具有良好的加工特性、營(yíng)養(yǎng)功能和生理活性。

為了方便研究人員對(duì)市場(chǎng)上銷售的肽粉中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行快速檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)以凱氏定氮法做參考，考察用雙縮脲法、福林酚法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肽粉中蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性及適用性，篩選出最簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法。

2實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)樣品

甲基紅：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；溴甲酚綠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清清蛋白：北京天勤一和生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海展云化工有限公司；福林酚試劑：天津百倫斯生物科技有限公司；蛋清肽粉(分子質(zhì)量<3 000)：實(shí)驗(yàn)室自制；蛋清肽粉(分子質(zhì)量<1 000)：實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)儀器

可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；微量滴定裝置，定氮蒸餾裝置等。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1微量凱氏定氮法

精密稱取蛋清肽凍干粉1.5 g于干燥潔凈的凱氏燒瓶中，加入6 g無(wú)水K2SO4，0.2 g CuSO4，20 mL H2SO4。先小火加熱待泡沫停止后加大火，保持液面微沸，直到溶液呈藍(lán)綠色透明時(shí)再繼續(xù)加熱0.5—1 h。冷卻后加水定容至100 mL，然后進(jìn)行微量蒸餾和滴定。最后按照公式(1)計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量，并做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值再進(jìn)行分析。

(1)

式中：V—樣品滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液體積(mL)；

V0—空白滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液體積(mL)；

C—標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液的摩爾濃度(mol/L)；

F—氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)；

m—試樣的質(zhì)量(g) 。

2.3.2雙縮脲法的測(cè)定分析

取7支試管，分別加入0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL的10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20—25 ℃)下放置30 min，于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用上述同樣的方法測(cè)定不同濃度、不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值再進(jìn)行分析。

2.3.3福林酚法(Lowry法)的測(cè)定分析

取7支試管，分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250 μg/mL)。用水補(bǔ)足到1.0 mL，然后每支試管加入5 mL試劑甲( 50份A與1份B混合，即為試劑甲。A液：10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6.4H2O)，溶解于500 mL蒸餾水中。B液：0.5 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100 mL蒸餾水中)，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10 min，再逐管加入0.5 mL福林酚試劑，立即混勻。然后在室溫下放置10 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于750 nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用上述同樣的方法，測(cè)定不同濃度，不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值再進(jìn)行分析。

2.3.4考馬斯亮藍(lán)法的測(cè)定分析

取7只試管分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL濃度為100 μg/ mL牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，補(bǔ)充水到1.0 mL。然后每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻放置5 min，在紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光值。然后以吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用上述同樣的方法，測(cè)定不同濃度，不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值再進(jìn)行分析。

2.3.5紫外吸收法的測(cè)定分析

取7只試管分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL的1.25 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至4 mL，在280 nm條件下測(cè)定其吸光值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用上述同樣的方法測(cè)定不同濃度、不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均值再進(jìn)行分析。

2.4不同蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定蛋清肽蛋白含量的比較

取適量低分子質(zhì)量(<1 000)的蛋清肽凍干粉樣品分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，6%，9%的溶液，然后分別用凱氏定氮法，雙縮脲法，福林酚法，考馬斯亮藍(lán)法，紫外吸收法測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量，具體實(shí)驗(yàn)操作分別參照2.3.1，2.3.2，2.3.3，2.3.4中的測(cè)定方法。最后對(duì)不同方法3次平行測(cè)定結(jié)果的平均值進(jìn)行分析比較。

3結(jié)果分析

3.1不同蛋白測(cè)定方法對(duì)不同分子質(zhì)量蛋清肽粉中蛋白含量的測(cè)定

3.1.1雙縮脲法的測(cè)定分析

由圖1數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得：雙縮脲法測(cè)定的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0.0334x+0.1201(R2=0.9996)，蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)曲線方程為y=0.0274x+0.1591(R2=0.9922)，蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)曲線方程為y= 0.029x+ 0.1121(R2= 0.9948)，均有較好的線性關(guān)系，從而說(shuō)明雙縮脲法適用于測(cè)定肽粉中的蛋白質(zhì)含量，也適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)的測(cè)定。

圖1　雙縮脲法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.2福林酚法的測(cè)定分析

由圖2數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0025x+0.217(R2=0.9989)，蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)曲線方程為y=0.0015x+0.2128(R2= 0.9953)，有較好的線性關(guān)系。而蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A750無(wú)線性關(guān)系，這可能與蛋清肽粉分子質(zhì)量較小有關(guān)。從而說(shuō)明，對(duì)于小分子質(zhì)量的肽粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，福林酚法不適用。

圖2　福林酚法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.3考馬斯亮藍(lán)法的測(cè)定分析

由圖3數(shù)據(jù)繪制考馬斯亮藍(lán)法的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0052x+0.0143(R2=0.9958)，線性關(guān)系良好。而蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)和蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A595均無(wú)線性關(guān)系。從而表明考馬斯亮藍(lán)法不適用于肽粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

圖3　考馬斯亮藍(lán)法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.4紫外吸收法的測(cè)定分析

由圖4數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到：紫外吸收法繪制的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0011x-0.1103(R2=0.9901)，線性關(guān)系良好。而蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)和蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A280均無(wú)線性關(guān)系。從而表明紫外吸收法不適用于肽粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

圖4　紫外吸收法比較不同肽粉蛋白含量

3.2不同蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定低分子質(zhì)量肽粉蛋白含量的結(jié)果比較

由圖5可以看出：當(dāng)?shù)头肿淤|(zhì)量蛋清肽凍干粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%，6%，9%時(shí)，雙縮脲法測(cè)定蛋清肽溶液中蛋白含量的值分別為23.6 mg/mL，43.94 mg/mL，68.57 mg/mL，最接近于凱氏定氮法的測(cè)定值23.64 mg/mL，47.16 mg/mL，71.33 mg/mL，其次是福林酚法的測(cè)定值20.8 mg/mL，35.75 mg/mL，58.69 mg/mL，紫外吸收法的測(cè)定值16.2 mg/mL，27.4 mg/mL，51.34 mg/mL，而考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定值0.64 mg/mL，6.09 mg/mL，4.25 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于凱氏定氮法測(cè)定值，誤差較大。因此我們可以得出：凱氏定氮法和雙縮脲法是測(cè)定低分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)含量的最適方法。

圖5　不同蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定肽粉的比較

4結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)中可以看出，凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量最常用的方法，是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的經(jīng)典方法，適用樣品廣泛，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確[6]，但是，操作較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不適合用于蛋白質(zhì)含量的快速測(cè)定。在對(duì)于低分子質(zhì)量的蛋清肽粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定時(shí)，雙縮脲法所測(cè)得的結(jié)果和凱氏定氮法差距不大(當(dāng)?shù)头肿淤|(zhì)量蛋清肽凍干粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，雙縮脲法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量為23.23 mg/mL，凱氏定氮法測(cè)定值為23.64 mg/mL，誤差僅為1.73%，且操作簡(jiǎn)單，快速，效果較好。考馬斯亮藍(lán)法、福林酚法、紫外吸收法均不適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。引起測(cè)定結(jié)果差異的原因可能是：紫外吸收法在測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)時(shí)，有一定的誤差且僅適用于測(cè)試無(wú)色樣品，對(duì)于有色樣品，需進(jìn)行預(yù)處理，排除顏色干擾后才適用于此方法[9]。Folin-酚法對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定會(huì)受到酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸，糖類、甘油等的干擾作用[10]。考馬斯亮藍(lán)染色法快速、靈敏，但只對(duì)微量蛋白有較好的測(cè)定線性范圍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須將樣品的蛋白濃度稀釋至0.1—1 mg/mL，這對(duì)于未知蛋白濃度的樣品來(lái)說(shuō)不易操作，而且實(shí)驗(yàn)必須在1 h內(nèi)完成，否則測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確[11]。雙縮脲法對(duì)不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)深淺相近，不受溫度影響，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，可快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量。因此，雙縮脲法可以適用于不同分子質(zhì)量的肽粉中蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)，而對(duì)于其的檢測(cè)限則可作為下一步的研究重點(diǎn)。

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Comparison of several methods for determinating the content of protein in peptides

JIAWei-bao,LIULiang-zhong,HUANGTing,CAOYu-xiang,ZHUZhe,LIWen-jie

(School of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

Abstract：Taking into account the actual production,in order to find an accurate and simple method to determine the content of proten in peptides, the experiment was based on the method of kjeldahl determination, the comparison of the biuret method, Folin phenol method, coomassie blue staining, uv absorption method for determinating the content of protein in different molecular peptides to screening out the best method.Results show that the datas of biuret method are close to by kjeldahl determination. This method is very simple and accurate. And it also suitable to determination the protein in short peptides.

Key words：peptides, protein determination, method comparison

中圖分類號(hào)：Q 51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.004

文章編號(hào)：2095-7386(2016)01-0017-04

作者簡(jiǎn)介:賈維寶(1989-)，男，碩士研究生，E-mail:15681901206@163.com.通信作者:劉良忠(1963-),男，教授，博士，E-mail：liu2022888@163.com.

收稿日期：2015-10-30.