結(jié)核分枝桿菌菌懸液光密度值與菌落計數(shù)的關(guān)聯(lián)性

秦云賀，王藝紅，郭慶龍，王洪海，張雪蓮

(復(fù)旦大學生命科學學院，上海　200438)

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌菌懸液光密度值與菌落計數(shù)的關(guān)聯(lián)性

秦云賀，王藝紅，郭慶龍，王洪海，張雪蓮

(復(fù)旦大學生命科學學院，上海200438)

[摘要]目的建立一種基于光密度值計算結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)的可靠方法。方法利用低頻超聲和玻璃珠研磨兩種方法制備H37Ra菌懸液，菌懸液2倍梯度稀釋后，分別測定各個稀釋度菌懸液在600 nm處的光密度值(OD600值)，并分析OD600值與稀釋倍數(shù)曲線，確定最佳的菌懸液制備方法，OD600線性范圍，以及OD600值與CFU關(guān)聯(lián)曲線。結(jié)果OD600值為0.1～0.6，線性范圍內(nèi)OD600值與稀釋倍數(shù)線性回歸分析結(jié)果顯示，玻璃珠研磨法和低頻超聲法相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.98、1.00，均呈良好的相關(guān)性，且低頻超聲法比玻璃珠研磨法的相關(guān)性好，其菌液分散更均勻。OD600值與CFU值線性回歸分析結(jié)果顯示，玻璃珠研磨法和低頻超聲法回歸方程分別是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。結(jié)論低頻超聲法是一種較好的結(jié)核分枝桿菌菌懸液制備方法，結(jié)合OD600值測定，可成為一種可靠、快速的結(jié)核分枝桿菌定量方法。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌； 菌落形成單位； OD600； CFU； 定量； 低頻超聲法； 玻璃珠研磨法

[Chin J Infect Control，2016，15(3)：150-154]

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的傳染性疾病，該病已成為危害人類健康的“頭號殺手”[1]。近年來，隨著卡介苗(BCG)免疫保護力下降[2]、人類免疫缺陷病毒(HIV)全球流行[3]，以及耐藥結(jié)核病[4](drug-resistant tuberculosis,DR-TB)的出現(xiàn)，使得發(fā)現(xiàn)新型免疫保護性抗原、新型抗結(jié)核藥物，以及細菌與宿主細胞相互作用等結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)性研究和相關(guān)應(yīng)用愈加重要，其中藥物敏感試驗、細胞侵染試驗[5]及動物感染實驗[6]等均需準確測定結(jié)核分枝桿菌的菌量。目前，結(jié)核分枝桿菌定量方法主要包括CFU計數(shù)法、麥氏比濁法及光密度法[7-8]，CFU計數(shù)方法相對準確性高，但周期長，不適用于實際研究中菌液濃度的快速測定；麥氏比濁法是經(jīng)典的應(yīng)用于普通微生物濃度測定的方法，該方法用于結(jié)核分枝桿菌定量可操作性和重復(fù)性差；基于光密度值的定量方法具有簡單、便捷、快速的優(yōu)勢，是一種相對實用的定量方法。但由于結(jié)核分枝桿菌生長呈顆粒狀，菌懸液制備方法以及實驗室檢測儀器、細菌培養(yǎng)方法等方面的差異，導(dǎo)致該方法缺乏統(tǒng)一的定量標準，需要探索一種簡便可靠的方法，便于結(jié)核分枝桿菌定量。本研究對比分析低頻超聲法及玻璃珠研磨法兩種菌懸液制備方法，對菌懸液制備方法、菌懸液600 nm處的光密度值(OD600值)與稀釋倍數(shù)關(guān)系、OD600值與CFU關(guān)系等進行分析和探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra為本實驗室保存。

1.1.2儀器和試劑酶標儀(BioTek)、水浴超聲儀(Bioruptor Next Gen UCD-300)、渦旋振蕩器(SCILOGEX MX-S)、尼康正置熒光顯微鏡(Nikon)、4.0 mm玻璃珠(復(fù)旦大學材料供應(yīng)中心)、96孔板(上海睿安生物科技有限公司)、Middlebrook 7H9和7H10(Difco)、Tween80和甘油(國藥集團化學試劑有限公司)、ADC(0.5%牛血清白蛋白、0.2%葡萄糖、0.85%氯化鈉)，所用化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1結(jié)核分枝桿菌H37Ra的培養(yǎng)用接種環(huán)于7H10-10%ADC固體板劃線接種H37Ra，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3周，備用。

1.2.2菌懸液制備

1.2.2.1玻璃珠研磨法接種環(huán)刮取3環(huán)于7H10-ADC固體板上生長2～3周的菌體，轉(zhuǎn)移至含800 μL 液體培養(yǎng)基(7H9、0.05%Tween80、0.5%甘油、10%ADC)的2.0 mL EP管中，加入5粒4.0 mm 磁珠，置于渦旋振蕩器上，工作速率調(diào)至第三檔，渦旋5 min左右。震蕩過程中，觀察EP管中液體是否充分震懸并隨時調(diào)整振蕩角度，肉眼觀察無可見菌塊且懸液分散均勻停止振蕩，轉(zhuǎn)移至含5.2 mL液體培養(yǎng)基中，靜置30 min，取上層菌液，在顯微鏡下觀察玻璃珠處理后菌體分散狀況。

1.2.2.2低頻超聲法接種環(huán)刮取3環(huán)于Middlebrook 7H10固體板(Middlebrook 7H10、0.5%甘油、10%ADC)上生長2～3周的菌體，轉(zhuǎn)移至含6.0 mL液體培養(yǎng)基中，將菌液分裝在無菌2.0 mL EP管中，500 μL/管，水浴超聲儀功率調(diào)至“LOW”狀態(tài)，工作15 s，停15 s，共8個循環(huán)，勿過度延長超聲時間，200 g 10 min低速離心，取上層菌懸液，在顯微鏡下觀察菌液超聲處理前后分散情況。

1.2.3CFU計數(shù)將制備的菌懸液進行梯度稀釋，分別取梯度稀釋的菌懸液200 μL涂布Middlebrook 7H10固體板，37 ℃靜置培養(yǎng)3～4周，分別計算CFU，每個稀釋度的菌懸液接種3個平板。

1.2.4菌懸液光密度值測定

1.2.4.1菌懸液可見光區(qū)波長掃描以液體培養(yǎng)基為本底，含適量濃度H37Ra的菌懸液為樣品，利用酶標儀掃描其(400～800)nm波長范圍內(nèi)的吸收曲線，間隔為1 nm，并校正光程，通過菌液吸收曲線確定600 nm是否為其較好的吸光度測定波長。

1.2.4.2酶標儀測定菌懸液光密度值分別將兩種方法制備的菌懸液進行2倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋4個梯度(2、4、8、16倍)并利用酶標儀測定每個稀釋梯度λ=600 nm處的光密度值，每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，每種菌懸液均重復(fù)兩次。

1.3數(shù)據(jù)處理所得光密度值均采用均值±標準偏差表示，利用Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件分析OD600與稀釋倍數(shù)關(guān)系，并確定OD600線性范圍；根據(jù)CFU計數(shù)結(jié)果，進行CFU與OD600回歸分析。

2結(jié)果

2.1菌懸液制備結(jié)核分枝桿菌生長易積聚，常規(guī)方法不易將其均勻分散，本實驗采用兩種細菌分散方法對結(jié)核分枝桿菌H37Ra株進行處理，結(jié)果顯示玻璃珠研磨結(jié)核分枝桿菌5 min可增加細菌的分散度，但分散細菌團塊沉降率較大，需靜置30 min；低頻水浴超聲處理結(jié)核分枝桿菌后明顯增加菌液的分散度，且低頻超聲法細菌懸液較為均勻。見圖1。

A:未處理；B:玻璃珠研磨法處理后；C:低頻超聲法處理后

2.2CFU計數(shù)將兩種方法制備并稀釋的結(jié)核分枝桿菌菌懸液分別涂布Middlebrook7H10固體培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)3～4周后計菌落數(shù)，低頻超聲分散法菌落數(shù)比玻璃珠研磨法菌落數(shù)多，但兩種方法制備的菌懸液在同一稀釋倍數(shù)下細菌數(shù)無數(shù)量級差異。

2.3菌懸液可見光區(qū)波長掃描圖根據(jù)測定波長選擇原則：選擇斜率較小處的波長，以保證其穩(wěn)定性；具有適當?shù)奈罩?，確保其靈敏度，菌懸液在可見光區(qū)400～800 nm波長范圍內(nèi)，無最大吸收，菌懸液測定中500～650 nm內(nèi)測定波長均符合要求，本研究采用600 nm測定波長。見圖2。

圖2 　可見光區(qū)結(jié)核分枝桿菌H37Ra的光密度值

2.4OD600值酶標儀測定兩種不同稀釋梯度的菌懸液OD600值，結(jié)果顯示兩種方法制備的菌懸液吸光值均具有明顯的梯度依賴性，其線性相關(guān)區(qū)間OD600值為0.1～0.6。見表1。線性范圍內(nèi)OD600值與稀釋倍數(shù)線性回歸分析，結(jié)果顯示玻璃珠研磨法和低頻超聲法相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.98、1.00，均呈良好的相關(guān)性。見圖3。低頻超聲法制備的菌懸液多次測定結(jié)果重復(fù)性及穩(wěn)定性好于玻璃珠研磨法。

表1兩種不同稀釋梯度結(jié)核分枝桿菌菌懸液OD600值

Table 1OD600 ofM.tbsuspension at two different dilution ratios

稀釋倍數(shù)玻璃珠研磨法低頻超聲法11.89±0.151.90±0.0920.68±0.070.76±0.0240.37±0.060.37±0.0380.14±0.030.17±0.01160.08±0.010.08±0.01

2.5OD600值與CFU值回歸分析對OD600值與CFU值進行線性回歸分析，結(jié)果顯示玻璃珠研磨法和低頻超聲法回歸方程分別是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。

A：玻璃珠研磨法(R2=0.98)；B：低頻超聲法(R2=1.00)

3討論

結(jié)核分枝桿菌細胞壁脂質(zhì)含量較高，在液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)下，細菌均呈顆粒狀，因此在進行結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)研究和臨床藥物敏感性測定中，細菌準確定量是一個影響結(jié)果穩(wěn)定性的重要因素。CFU計數(shù)、麥氏比濁法、稱重法等傳統(tǒng)結(jié)核桿菌定量方法時間周期長，可操作性及重復(fù)性差。分光光度計的操作簡單、靈敏度高，測定結(jié)果準確度和重復(fù)性好，因此紫外-可見分光光度法測定細菌懸液的光密度值成為一種細菌定量的快速、實用的方法，然而結(jié)核桿菌呈顆粒狀生長的特點使得光密度細菌定量法的穩(wěn)定性受到很大影響，制定一套標準化的結(jié)核桿菌OD600值與CFU關(guān)聯(lián)方法具有重要的應(yīng)用價值。Peuelas-Urquides等[9]曾對光密度法進行了初步探索，對結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)CFU值和菌懸液OD600值關(guān)聯(lián)性進行分析，結(jié)果顯示OD600值為0.39時，其CFU數(shù)值為1.97×106/mL。本研究立足于實驗室條件，對比分析玻璃珠研磨法和低頻超聲法兩種方法，計算OD600值與細菌CFU計數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系，確定了不同制備方法獲得的菌懸液光密度值與細菌數(shù)量對應(yīng)關(guān)系。

本研究中采用了低頻超聲法分散細菌，CFU計數(shù)結(jié)果表明低頻率超聲不會導(dǎo)致細菌破裂，對結(jié)核分枝桿菌活力沒有影響，其結(jié)果高于玻璃珠研磨法所獲得菌懸液CFU數(shù)量。與傳統(tǒng)的玻璃珠研磨法相比，低頻超聲法制備的菌懸液分散度高、菌體多單個存在。實驗中玻璃珠研磨菌體5 min后采用30 min靜置而非離心方法，主要由于玻璃珠研磨后，細菌的顆粒依然比較大，低速離心會嚴重降低菌懸液中細菌數(shù)量。另外，在OD600值測定中，低頻超聲法具有較高重復(fù)性，而玻璃珠研磨法所獲得菌懸液沉降較快，同一樣品的不同時間測定結(jié)果偏差很大。

本實驗表明，兩種方法均可用于結(jié)核分枝桿菌的菌懸液制備，低頻超聲法比玻璃珠研磨法重復(fù)性好、菌體分散良好，在進行結(jié)核分枝桿菌基因敲除株、重組株構(gòu)建等試驗制備感受態(tài)細菌時，可采用低頻超聲法獲得較為均一的菌懸液，有利于電轉(zhuǎn)外源DNA和后期陽性細菌克隆的篩選；對細菌數(shù)量要求較為精確的實驗，如藥敏試驗也可采用低頻超聲法制備菌懸液。值得注意的是，在使用玻璃珠分散結(jié)核分枝桿菌時，要避免因菌懸液沉降較快，而導(dǎo)致同一樣品不同時間測定結(jié)果之間的偏差。同時由于各個實驗室使用的振蕩器或水浴超聲儀的型號不同，在制備菌懸液時，需要根據(jù)儀器震蕩或超聲頻率的不同，調(diào)整制備菌懸液的具體操作時間和頻率。

結(jié)核分枝桿菌的準確定量具有重要的研究意義，本研究中所采用的OD600值與CFU關(guān)聯(lián)方法具有普遍適用性，低頻超聲法可操作性和重復(fù)性好，可以為各個實驗室建立基于OD600值的結(jié)核分枝桿菌定量標準提供重要的參考。

[參 考 文 獻]

[1]Paulson T. Epidemiology: a mortal foe[J]. Nature, 2013, 502(7470): S2-S3.

[2]Nankabirwa V, Tumwine JK, Mugaba PM, et al. Child survival and BCG vaccination: a community based prospective cohort study in Uganda[J]. BMC Public Health, 2015, 15: 175.

[3]World Health Organization. Global tuberculosis report 2014[M].WHO, 2014.

[4]Udwadia ZF, Amale RA, Ajbani KK, et al. Totally drug-resistant tuberculosis in India[J]. Clin Infect Dis, 2012, 54(4): 579-581.

[5]Mishra BB, Rathinam VA, Martens GW, et al. Nitric oxide controls the immunopathology of tuberculosis by inhibiting NLRP3 inflammasome-dependent processing of IL-1β[J]. Nat Immunol, 2013, 14(1): 52-60.

[6]王應(yīng)輝, 王洪海，曹健，等. 潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染動物模型[J]. 中國感染控制雜志, 2011, 10(4): 312-315.

[7]Iona E, Giannoni F, Pardini M, et al. Metronidazole plus rifampin sterilizes long-term dormantMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(4): 1537-1540.

[8]Taneja NK, Tyagi JS. Resazurin reduction assays for screening of anti-tubercular compounds against dormant and actively growingMycobacteriumtuberculosis,MycobacteriumbovisBCG andMycobacteriumsmegmatis[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 60(2): 288-293.

(本文編輯：豆清婭)

Correlation between optical density and colony forming units ofMycobacteriumtuberculosissuspension

QINYun-he,WANGYi-hong,GUOQing-long,WANGHong-hai,ZHANGXue-lian

(SchoolofLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a reliable approach for quantification of colony forming unit(CFU) of Mycobacterium tuberculosis(M.tb) by measuring optical density(OD).MethodsM.tb suspension H37Ra was prepared using low-power ultrasonic or glass bead beating methods, and was two-fold serially diluted, OD at 600nm (OD600) of each dilution ratio was measured respectively, OD600 and dilution curve were analyzed to determine the optimum approach for preparing bacterial suspension，linear range of OD600, as well as linear relationship between OD600 and CFU.ResultsOD600 was 0.1-0.6, linear regression analysis of OD600 and dilution ratio within linear range revealed that correlation coefficient (R2) of glass bead beating and low-power ultrasonic methods were 0.98 and 1.00 respectively，both presented a good correlation, low-power ultrasonic method was better than glass bead beating method, bacterial suspension dispersed more evenly. Linear regression analysis results of OD600 and CFU values showed that the regression equation of glass bead beating method and low-power ultrasonic method were CFU=2.35×107×OD600+4.42×105 and CFU=3.26×107×OD600+6.89×105 respectively.ConclusionLow-power ultrasonic method is a good method for preparation of M.tb suspension，combined the measurement of OD600 value， it can be a reliable and rapid method for quantitative analysis of M.tb.

[Key words]Mycobacterium tuberculosis; colony forming unit； OD600； CFU； quantification; low-power ultrasonic method; glass bead beating method

[中圖分類號]R378.91+1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-9638(2016)03-0150-05

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.03.002

[作者簡介]秦云賀(1988-)，男(漢族)，河南省新鄉(xiāng)市人，碩士，主要從事新型抗結(jié)核藥物發(fā)現(xiàn)和機制研究。[通信作者]張雪蓮E-mail：xuelianzhang@fudan.edu.cn

[基金項目]上海市科技支撐項目(15431900200)

[收稿日期]2015-07-25