豬藍(lán)耳病疫苗現(xiàn)狀及其免疫效果評(píng)價(jià)方法

代洪波，李 琰，林 艷，江 勇，岳豐雄，徐宏軍

(1.成都天邦生物制品有限公司，四川 成都625014；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都610066)

豬藍(lán)耳病疫苗現(xiàn)狀及其免疫效果評(píng)價(jià)方法

代洪波1，李 琰2，林 艷1，江 勇1，岳豐雄1，徐宏軍1

(1.成都天邦生物制品有限公司，四川 成都625014；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都610066)

1 豬藍(lán)耳病介紹

豬藍(lán)耳?。ㄓ址Q豬繁殖與呼吸綜合征）是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，曾經(jīng)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失，近年來(lái)該病的死亡率有所降低，但危害并未隨之下降。目前感染豬藍(lán)耳病的豬只主要表現(xiàn)為母豬產(chǎn)后炎癥、少乳、高返情率等癥狀，被感染仔豬通常具有母源抗體保護(hù)，發(fā)病死亡率較低，生長(zhǎng)豬主要表現(xiàn)為育肥期呼吸道癥狀嚴(yán)重[1]。此外，豬藍(lán)耳病的免疫抑制危害不容忽視，主要表現(xiàn)為影響豬瘟、豬偽狂犬等疫苗的免疫效果，豬瘟與豬偽狂犬疫苗的免疫效果不理想，將導(dǎo)致整個(gè)豬群處于不穩(wěn)定狀態(tài)，甚至導(dǎo)致豬瘟、豬偽狂犬病的感染風(fēng)險(xiǎn)加劇[2]。這些間接損失容易被養(yǎng)殖場(chǎng)忽視，但是其危害是巨大的。

我國(guó)對(duì)豬藍(lán)耳病疫苗的使用一直飽受爭(zhēng)議，大多數(shù)養(yǎng)殖企業(yè)感染率高，但是否使用疫苗免疫，選用什么疫苗免疫，常常陷入糾結(jié)。使用疫苗的部分用戶，由于對(duì)豬藍(lán)耳病疫苗的認(rèn)識(shí)不夠充分，往往存在不少的誤區(qū)，例如：1）在使用劑量上比照豬瘟疫苗，一次免疫4頭份/頭，一年免疫3～5次；2）頻繁地更換疫苗毒株等問(wèn)題[3]。以下就我國(guó)現(xiàn)有豬藍(lán)耳病疫苗毒株的現(xiàn)狀以及對(duì)豬藍(lán)耳病疫苗的效果評(píng)價(jià)方法等作一簡(jiǎn)要分析。

2 豬藍(lán)耳病疫苗現(xiàn)狀

目前我國(guó)用于豬藍(lán)耳病防治的疫苗眾多，分為滅活疫苗與弱毒活疫苗兩大類。目前用于該病防控以使用弱毒活疫苗為主，然而活疫苗又分為變異毒株（高致病力）弱毒活疫苗與經(jīng)典株弱毒活疫苗兩種。經(jīng)典株豬藍(lán)耳病弱毒活疫苗包括我國(guó)分離致弱的CH-1R毒株、美國(guó)VR-2332毒株、以及R98毒株；變異毒株主要包括JXA1-R毒株、TJM-F92毒 株、HuN4-F112毒株。正是由于我國(guó)豬蘭耳病疫苗毒株多樣性，給養(yǎng)殖企業(yè)選擇豬藍(lán)耳病疫苗造成了極大的困惑，目前關(guān)注的焦點(diǎn)集中在經(jīng)典毒株與變異毒株之間是否具有交叉保護(hù)，變異毒株是否安全，變異毒株能否用于緊急接種等問(wèn)題，養(yǎng)殖戶急切希望能夠?qū)Σ煌局赀M(jìn)行相應(yīng)的排名以區(qū)分優(yōu)劣，甚至部分企業(yè)開(kāi)始對(duì)自己養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的豬藍(lán)耳病病毒進(jìn)行測(cè)序分析，期望能夠找到與自身豬場(chǎng)最貼近的疫苗毒株。筆者就目前我國(guó)主要的疫苗毒株進(jìn)行基因序列分析，對(duì)比不同毒株之間的主要差異。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢我國(guó)疫苗毒株信息發(fā)現(xiàn)，高致病力江西株提交了原始毒株全基因序列與致弱不同代次的疫苗毒株基因序列信息，湖南株與天津株僅提交了原始毒株的全基因序列；經(jīng)典毒株僅能查到CH-1R與VR-2332毒株的全基因信息。現(xiàn)就三個(gè)變異毒株的原始基因序列信息與兩個(gè)經(jīng)典毒株的基因序列信息進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出：3個(gè)變異毒株的彼此全基因同源性均為99.6%，僅存在部分點(diǎn)突變，未見(jiàn)明顯的區(qū)域性變異；CH-1R與變異株全基因同源性為95.2%左右；VR-2332與變異株全基因同源性為89.7%左右。針對(duì)變異集中的NSP2基因與GP5基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：三個(gè)變異株的NSP2基因同源性為99.5%左右，CH-1R與變異株之間同源性為92.6%左右，VR-2332與變異株同源性為83.6%左右。三個(gè)變異株的GP5基因同源性為99.8%左右，CH-1R與變異株GP5同源性為94.7%左右，VR-2332與變異株同源性為89.4%左右。

豬藍(lán)耳病病毒為單鏈RNA病毒，病毒本身容易產(chǎn)生變異，就豬藍(lán)耳病病毒而言，經(jīng)典毒株與變異毒株之間存在較大的差異，主要體現(xiàn)在NSP2基因的區(qū)域性缺失，改變了豬藍(lán)耳病病毒聚合酶的活性；以及GP5基因上有5%左右的變異。而三個(gè)變異毒株的原始毒株之間，無(wú)論是全基因序列還是NSP2基因與GP5基因上的變異均小于0.5%，因此，期望通過(guò)基因序列分析尋找與自己養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)最貼近的疫苗毒株是不現(xiàn)實(shí)的。此外，就疫苗毒株在致弱過(guò)程中是否產(chǎn)生了明顯的基因突變的問(wèn)題，筆者分析了江西株致弱過(guò)程中不同代次的基因同源性分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，第10代毒與致弱到170代弱毒的全基因序列同源性為99.6%，從10代到70代的變異僅為0.03%，70代到100代的變異僅為0.01%，80代到170代僅變異0.02%。通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在疫苗毒株致弱過(guò)程中主要改變了病毒的生物學(xué)特性，但并未對(duì)基因造成明顯的改變，特別是對(duì)病毒蛋白序列的改變微乎其微。用于JXA1-R株疫苗生產(chǎn)的82代至95代，變異小于0.01%。用于活疫苗生產(chǎn)的毒株對(duì)其遺傳穩(wěn)定性是有較高要求的，必須保證在使用代次內(nèi)的遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定，因此只要嚴(yán)格控制疫苗毒株的生產(chǎn)代次，根本不用擔(dān)心疫苗毒株本身的基因變異，要明白對(duì)現(xiàn)有疫苗毒株進(jìn)行排名是不切實(shí)際的。

在豬藍(lán)耳病疫苗的選擇過(guò)程中，我們首先明確的是變異毒株與經(jīng)典毒株在抗原性與生物學(xué)活性上都存在一定的差異，但經(jīng)典毒株與變異毒株之間仍然存在較好的交叉保護(hù)效果。變異毒株由于其生物學(xué)活性的改變，在接種動(dòng)物后起效更快[4]，同時(shí)從抗原性上也更接近我國(guó)目前普遍流行的變異毒株。然而3個(gè)變異毒株之間的差異，目前尚難以區(qū)分伯仲，只能從產(chǎn)品生產(chǎn)工藝以及質(zhì)量控制等要素進(jìn)行篩選。

表1 不同疫苗毒株基因同源性分析結(jié)果

表2 江西株不同致弱代次全基因同源性分析

3 豬藍(lán)耳病疫苗效果評(píng)價(jià)方法

選擇豬藍(lán)耳病疫苗時(shí)不得不提到疫苗免疫效果評(píng)估，豬藍(lán)耳病疫苗免疫效果評(píng)價(jià)不像豬瘟疫苗那樣簡(jiǎn)便，豬瘟疫苗可以通過(guò)抗體檢測(cè)直接評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。常用的豬藍(lán)耳病抗體ELISA檢測(cè)方法，難以對(duì)疫苗的免疫保護(hù)效果做出準(zhǔn)確評(píng)估，體液免疫中僅中和抗體能用于免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，但是中和抗體的檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。筆者通過(guò)多次試驗(yàn)證明豬藍(lán)耳病ELISA檢測(cè)抗體水平的高低與攻毒保護(hù)之間無(wú)明顯的正相關(guān)關(guān)系，無(wú)論是IDEXX的抗體檢測(cè)試劑盒還是LSI的豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒，即使兩項(xiàng)抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性的豬群，攻毒后仍然會(huì)出現(xiàn)發(fā)病甚至死亡；相反通過(guò)CH-1R株免疫后，無(wú)法通過(guò)這兩種試劑盒檢測(cè)到抗體的豬群，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后，仍然可以提供有效保護(hù)。因此，我們?cè)谂R床上并未將豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)作為是否提供有效保護(hù)的依據(jù)，而是通過(guò)ELISA抗體水平對(duì)豬群的感染狀況進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)行豬藍(lán)耳病疫苗免疫前的評(píng)估。在免疫豬群中可以通過(guò)抗體水平的離散度，抗體值的高低等間接評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。

目前在豬藍(lán)耳病活疫苗研制新獸藥注冊(cè)過(guò)程中，效力檢驗(yàn)的主要方法是通過(guò)免疫攻毒效力檢驗(yàn)試驗(yàn)評(píng)估，將待檢疫苗免疫健康易感豬群后一段時(shí)間，以檢驗(yàn)用強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，對(duì)照組應(yīng)5/5發(fā)病，并有2/5以上死亡，試驗(yàn)成立，疫苗免疫豬群應(yīng)4/5以上保護(hù)。發(fā)病試驗(yàn)豬的判定要求為：1）至少3 d體溫在41 ℃以上；或出現(xiàn)精神委靡、食欲下降，眼結(jié)膜炎，咳嗽、喘等呼吸道癥狀；2）剖檢肺部出現(xiàn)片狀實(shí)變。符合以上2條即可判定為發(fā)病。豬藍(lán)耳病活疫苗的每頭份疫苗的病毒含量與免疫攻毒保護(hù)之間為正相關(guān)關(guān)系，因此疫苗攻毒效力檢驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的替代方法為病毒含量測(cè)定。然而無(wú)論是病毒含量測(cè)定，還是免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，都不太適用于豬藍(lán)耳病疫苗臨床使用效果評(píng)估。目前大型養(yǎng)殖企業(yè)可以通過(guò)公司的技術(shù)部門完成病毒含量測(cè)定，來(lái)評(píng)定不同生產(chǎn)廠家豬藍(lán)耳病活疫苗的質(zhì)量以及產(chǎn)品穩(wěn)定性，但是我國(guó)廣泛存在的中小規(guī)模養(yǎng)殖企業(yè)無(wú)法進(jìn)行相應(yīng)評(píng)估，豬藍(lán)耳病疫苗的實(shí)際使用效果難以評(píng)價(jià)就成為事實(shí)，同時(shí)也為豬藍(lán)耳病活疫苗的推廣增加了難度。豬群免疫以后豬藍(lán)耳病ELISA抗體水平的高低與攻毒保護(hù)之間無(wú)明顯的正相關(guān)，同時(shí)感染豬群也可能存在高水平的抗體，我們急需更為直觀，更為客觀的豬藍(lán)耳病活疫苗使用效果評(píng)價(jià)體系。當(dāng)建立起切實(shí)可行的豬藍(lán)耳病活疫苗臨床使用免疫效果評(píng)價(jià)體系后，將會(huì)進(jìn)一步規(guī)范豬藍(lán)耳病活疫苗的臨床使用。

目前，針對(duì)豬藍(lán)耳病陰性豬場(chǎng)，專家都建議做好生物安全，不使用豬藍(lán)耳病疫苗。針對(duì)豬藍(lán)耳病感染的穩(wěn)定豬場(chǎng)，需要針對(duì)豬藍(lán)耳病引起的實(shí)際問(wèn)題進(jìn)行免疫效果評(píng)估。如果豬場(chǎng)表現(xiàn)為豬藍(lán)耳病感染后使豬瘟、豬偽狂犬病等其他疫苗的免疫效果不佳，此時(shí)加入豬藍(lán)耳病疫苗免疫，通過(guò)對(duì)其他疫苗免疫效果的改善，來(lái)評(píng)價(jià)豬藍(lán)耳病疫苗的實(shí)際使用效果，此方法較為可行。針對(duì)豬藍(lán)耳病感染的不穩(wěn)定豬場(chǎng)，首先關(guān)注豬藍(lán)耳病導(dǎo)致豬場(chǎng)不穩(wěn)定的主要體現(xiàn)，是表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、返情，還是表現(xiàn)為育肥豬呼吸道癥狀等。通過(guò)使用豬藍(lán)耳病疫苗免疫一段時(shí)間后，針對(duì)性驗(yàn)收相應(yīng)癥狀是否得到改善，以此來(lái)判定豬藍(lán)耳病疫苗的免疫效果。

豬藍(lán)耳病在豬群的持續(xù)存在，勢(shì)必會(huì)對(duì)豬群的生產(chǎn)成績(jī)?cè)斐梢欢ǖ挠绊?，豬場(chǎng)如果診斷出存在豬藍(lán)耳病感染，需要對(duì)生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找豬藍(lán)耳病對(duì)豬群生產(chǎn)成績(jī)的影響，找到評(píng)價(jià)豬藍(lán)耳病疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，再使用豬藍(lán)耳病疫苗免疫來(lái)解決生產(chǎn)中實(shí)際存在的問(wèn)題，是現(xiàn)行豬藍(lán)耳病疫苗在中小規(guī)模豬場(chǎng)使用的有效評(píng)價(jià)方式。一旦豬群藍(lán)耳病疫苗使用產(chǎn)生效果，需要繼續(xù)使用該疫苗以維持豬群健康，我國(guó)想在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)該病的凈化是有一定困難的，因此我們只能通過(guò)目前可行的方式來(lái)為我國(guó)的養(yǎng)豬生產(chǎn)保駕護(hù)航。

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2016-10-19）

代洪波（1988-），男（漢），四川德陽(yáng)人，碩士研究生，從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究