豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的診斷分析

李明波，宋忠旭，董斌科，孫 華，雷 斌，梅書棋＊＊

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430209）

豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的診斷分析

李明波，宋忠旭，董斌科，孫 華，雷 斌，梅書棋＊＊

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430209）

豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒病是目前養(yǎng)豬業(yè)廣泛存在且危害較大的疾病，嚴(yán)重影響了種豬的繁殖性能和仔豬的生長性能，多表現(xiàn)為地方性流行和持續(xù)性感染，是其他豬病多發(fā)和頻發(fā)的主要原因。2016年5月，湖北省某規(guī)?；i場內(nèi)育肥前期豬只出現(xiàn)以呼吸困難、高熱、皮膚出現(xiàn)不規(guī)則丘疹、漸行性消瘦等臨床癥狀的急性傳染病，造成豬只生長發(fā)育受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低。根據(jù)臨床癥狀，結(jié)合流行病學(xué)、臨床剖檢觀察、實(shí)驗(yàn)室診斷等方法，最終確診其為豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染引起，同時(shí)對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并采取相應(yīng)措施，有效減緩了疾病的流行與蔓延。研究通過對該場疾病發(fā)生的原因及防控措施進(jìn)行分析，以期為當(dāng)前養(yǎng)殖場該類疾病的臨床防控提供參考。

豬繁殖與呼吸綜合征；豬圓環(huán)病毒2型；診斷分析

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（P orcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses，PRRSV）引起的豬高度接觸感染性傳染病。該病主要引起初胎和妊娠后期母豬的流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、高熱等；哺乳仔豬、保育豬最易感染出現(xiàn)臨床癥狀或者繼發(fā)其他細(xì)菌性疾病如鏈球菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等，病死率較高，以出現(xiàn)發(fā)熱、眼結(jié)膜水腫、呼吸衰竭、關(guān)節(jié)腫脹、間質(zhì)性肺炎等綜合癥狀為主。病毒可經(jīng)呼吸道、胎盤、公豬精液感染傳播[1]。研究表明，當(dāng)前我國養(yǎng)殖場主要流行變異的PRRSV，且不同毒力的毒株引起的臨床癥狀具有較大差異[2，3]。

豬圓環(huán)病毒病2型（Porcine Circovirus，PCV2）是新近發(fā)現(xiàn)的最小的DNA病毒，基因組大小為1 766 bp。該病可以感染各年齡階段的豬只，包括斷奶仔豬的多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、出生豬的先天震顫和生長豬的皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、妊娠母豬產(chǎn)死胎等。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Muhisystemic Wasting Syndrome，PMWS）是臨床較常見也是造成經(jīng)濟(jì)損失最大的豬圓環(huán)病毒病。臨床患PMWS的仔豬表現(xiàn)為皮膚蒼白、呼吸道癥狀、進(jìn)行性消瘦、腹股溝淋巴結(jié)腫大和生長不整齊，容易繼發(fā)細(xì)菌感染等。該病可經(jīng)豬的糞尿、鼻腔、乳汁、胎盤和公豬精液等途徑傳播[4，5]。

PRRSV和PCV2是引起豬群免疫抑制性疾病的重要病原。臨床上，PRRSV和PCV2感染與其他病原體感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病表現(xiàn)極為相似，并常伴隨混合感染和繼發(fā)感染。根據(jù)流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)以及剖檢變化很難做出準(zhǔn)確診斷，需要結(jié)合病原學(xué)和血清學(xué)等方法來做出綜合判斷。

2016年5月，湖北省某規(guī)?；i場內(nèi)育肥期豬只出現(xiàn)急性呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率20%左右，發(fā)病豬臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減退、陣發(fā)性咳嗽、高熱（體溫41 ℃以上）、皮膚出現(xiàn)不規(guī)則紅紫斑及丘疹；嚴(yán)重病例表現(xiàn)為呼吸困難、漸行性消瘦、被毛粗亂及蒼白等癥狀。為切實(shí)掌握發(fā)病情況，本研究結(jié)合流行病學(xué)、臨床剖檢觀察、實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷等方法，最終確診其為豬藍(lán)耳病與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染引起。同時(shí)采取綜合防控措施，及時(shí)了解疾病的發(fā)展規(guī)律，有效減緩了疾病的暴發(fā)與蔓延。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇該規(guī)?；i場內(nèi)臨床癥狀典型的發(fā)病豬只2頭；無菌抽取保育階段健康豬只血樣10份、疑似發(fā)病的育肥期豬只血樣20份，冷藏保存后送至華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心檢測。

1.1.1 主要儀器

德國eppendorf離心機(jī)勻漿機(jī)，PCR儀，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)，DYY-7C電泳儀等。

1.1.2 引物及試劑

擴(kuò)增PRRSV部分NSP2序列及PCV2 ORF2基因引物，Taq DNA polymerase（PCR聚 合 酶 ）、dNTPs、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA快速回收試劑盒為上海生工生物工程產(chǎn)品，Trizol總RNA提取試劑盒為Omiga公司產(chǎn)品，DL 2000 DNA Marker等均為大連寶生物公司（TaKaRa）產(chǎn)品。陽性對照樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心保存。

1.2 檢測方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查和臨床剖檢

了解評估該養(yǎng)殖場內(nèi)種豬群和各階段生長豬只前期主要疫病的血清抗體和病原檢測結(jié)果，以及豬群疫苗免疫程序等防控措施，觀察發(fā)病豬只臨床癥狀，選取2頭發(fā)病豬只進(jìn)行解剖，記錄病例剖檢變化。

1.2.2 主要疫病血清抗體的檢測

無菌抽取保育階段健康豬只血樣10份、疑似發(fā)病的育肥期豬只血樣20份，分離血清后采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）抗體檢測試劑盒分別檢測PRRS抗體、PCV2抗體、偽狂犬gE抗體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗體（ApxIV）等。ELISA抗體檢測試劑盒為武漢科前生物制品公司產(chǎn)品。

1.2.3 血清中主要疫病病原的檢測

按RNATrizol試劑說明書提取血清中病毒總基因組，進(jìn)行PRRSV、PCV2等疑似病原的檢測。采用PCR方法擴(kuò)增PCV2 ORF2基因，樣品中有PCV2存在時(shí)，可擴(kuò)增出494bp的片段，PCR引物為：上游引物：5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′。另采用RT-PCR方法擴(kuò)增PRRSV NSP2基因中覆蓋變異毒株缺失區(qū)域的基因片段，樣品中有變異性PRRSV時(shí)，可擴(kuò)增出678bp的片段；樣品中有經(jīng)典PRRSV時(shí)，可擴(kuò)增出768bp的片段。PCR引物為：上游引物（Dnsp-1161）：5’-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3’，下游引物（Dnsp-1928）：5’-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3’（ 下 劃 線代表兼并堿基），基因特異性反轉(zhuǎn)錄引物(RTnsp-2850)：5’-AGAATGAAGGA-3’。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

初步評估該場前期對疑似發(fā)病豬組織樣的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)場內(nèi)存在變異PRRSV、PCV2的感染和流行，在防控PRRS上使用某公司生產(chǎn)的JXA1-R株減毒活疫苗免疫分娩后母豬和配種前后備豬，育肥階段豬只未免疫PRRS疫苗；場內(nèi)前期監(jiān)測到的PCV2病原為PCV2b亞型，種豬和生產(chǎn)仔豬均免疫PCV2全病毒滅活疫苗。通過了解，該養(yǎng)殖場自2011年起開展了豬瘟、豬偽狂犬病凈化等方面的工作，目前已達(dá)到凈化的目標(biāo)。

2.2 臨床癥狀及剖檢變化

本次發(fā)病的豬只為保育轉(zhuǎn)入育肥階段群體，平均體重30 kg以上，發(fā)病豬最初以高熱（41.5 ℃），表現(xiàn)出急、慢性呼吸道疾病呈腹式呼吸，鼻腔有黏稠黏液，眼結(jié)膜潮紅且分泌物增多，部分豬只背部有不規(guī)則丘疹，早期應(yīng)用林可霉素、5%黃芪多糖、維生素C等復(fù)合制劑進(jìn)行隔離治療后轉(zhuǎn)歸，但生長受阻；嚴(yán)重病例的表現(xiàn)為食欲減退、蒼白消瘦乃至呼吸衰竭致死（圖1），個(gè)別病豬排出黃色水樣稀糞。

對急性發(fā)病豬只和瀕死的豬只進(jìn)行解剖檢查，發(fā)現(xiàn)病變多表現(xiàn)為：心包有積液、肺臟組織水腫出現(xiàn)蝦肉樣病變、全身淋巴結(jié)腫大出血，尤其是腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)腫大充血明顯（圖2），腎臟色澤變淡，1頭重癥豬只脾臟嚴(yán)重腫大淤血。

圖1 發(fā)病豬臨床癥狀

圖2 發(fā)病豬只剖檢癥狀

2.3 主要疫病血清抗體檢測結(jié)果

使用商品化試劑盒分別檢測10份保育豬和20份育肥期豬只血清中豬藍(lán)耳病（PRRS）、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、偽狂犬gE野毒（PRV-gE）、豬胸膜肺炎放線桿菌（ApxIV）抗體，陽性/陰性樣品判定標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒使用說明，檢測結(jié)果如表1所示。

表1 血清學(xué)抗體檢測結(jié)果

圖3 血清中PRRSV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 血清中PCV2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 血清中主要疫病病原的檢測結(jié)果

通過RT-PCR或PCR方法對20份疑似發(fā)病的育肥豬血清樣品進(jìn)行了PRRSV、PCV2病原的檢測，結(jié)果表明20份樣品中檢出PRRSV變異毒株陽性比例為80%，檢出PCV2病原陽性比例為100%，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3、圖4所示。

3 討論

3.1 病因分析

1）從檢測結(jié)果來看，10頭保育階段健康豬只未檢測出PRRS抗體，說明此階段豬只未感染PRRSV，且PCV2疫苗免疫抗體陽性率為100%（抗體均值為0.502），這部分豬從臨床來看健康水平也較好；20頭疑似發(fā)病育肥豬血清中檢出PRRS抗體陽性率為95%，說明在保育轉(zhuǎn)育肥階段或許就感染了PRRSV，這個(gè)也可從血清中PRRSV的病原檢測結(jié)果反應(yīng)出來，其病原陽性率為80%（16/20），從RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果來看，PRRSV信號為弱陽性，說明豬只個(gè)體被感染的病毒劑量還不是很大，但卻可以誘發(fā)細(xì)菌性疾病以及PCV2在豬體內(nèi)復(fù)制能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病，這些很好解釋了當(dāng)前該場育肥期豬只病情不穩(wěn)定的一些問題。下步將對血清樣品中檢測出的PRRSV、PCV2病原分別進(jìn)行GP5和ORF2基因序列測序分析，進(jìn)一步明確毒株的來源和其在該場的傳播規(guī)律。

2） PCV2與PRRS都屬免疫抑制性疾病，可以互相促進(jìn)感染增殖，從育肥豬PCV2病原檢測結(jié)果來看，PCR擴(kuò)增信號為強(qiáng)陽性，雖然該場在仔豬21日齡已進(jìn)行該病的疫苗免疫，但是已有研究表明，不管是PCV2還是PRRSV，豬只免疫2種疫苗后都不能完全清除體內(nèi)病毒，只能在一定程度上減少病毒血癥時(shí)間或者部分抑制豬只排毒[6]。PCV2感染后可誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，姜平等研究表明熱應(yīng)激促進(jìn)PCV2的復(fù)制與Hsp70（熱休克蛋白）和Hsp27蛋白相關(guān)，這或許可以解釋夏季PCV2感染能力增強(qiáng)的一些原因，如豬的皮炎腎病綜合征（圖1所示）。

3）保育和育肥階段豬群中均未檢測到豬胸膜肺炎放線桿菌抗體和偽狂犬野毒抗體。從疫病流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果來看，育肥前期豬只疫病的發(fā)生有以下幾個(gè)原因：一是PRRSV+PCV2感染是誘因，導(dǎo)致繼發(fā)細(xì)菌性疾病如多殺性巴氏桿菌、支原體等感染的現(xiàn)象；二是該場豬群及飼養(yǎng)環(huán)境控制力度不夠，不同日齡階段的豬部分混群、欄舍飼養(yǎng)密度大等；三是養(yǎng)殖場現(xiàn)有防疫與生物安全防控基礎(chǔ)條件不足，且豬舍主動(dòng)通風(fēng)和除塵措施較差；四是夏季蚊蟲多發(fā)，通過交叉?zhèn)鞑ピ黾恿瞬≡腥編茁省?/p>

3.2 防控措施

1）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，重視場內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生工作，嚴(yán)格執(zhí)行空圈欄舍的徹底消毒沖洗和消毒管理制度。實(shí)行定期帶豬消毒，保持豬舍環(huán)境清潔衛(wèi)生、干燥、通風(fēng)良好，同時(shí)做到豬群轉(zhuǎn)群全進(jìn)全出，各生長階段飼養(yǎng)豬群分區(qū)飼養(yǎng)，降低飼養(yǎng)密度。并及時(shí)將發(fā)病豬只和健康豬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)及治療。

2）豬群轉(zhuǎn)群后飼料中通過脈沖給藥方式進(jìn)行控制，添加10%替米考星1 000 mg/kg+黃芪多糖10～15 d，同時(shí)在飲水中添加葡萄糖、電解多維增強(qiáng)豬體質(zhì)，減少應(yīng)激反應(yīng)。

3)保育階段仔豬（35日齡左右）加強(qiáng)免疫PRRS疫苗一次，1頭份/頭，圓環(huán)病毒2b亞型滅活疫苗調(diào)整為28日齡免疫，1頭份/頭。

該養(yǎng)殖場通過實(shí)施上述防控方案及進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全防控措施后，有效降低了發(fā)病豬死淘率，豬群健康水平出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，豬場情況趨于穩(wěn)定。

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2016-07-19）

農(nóng)業(yè)部國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系武漢綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（編號：CARS-36)；十三五創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：2016—620—004—001）。

李明波（1982-），男，湖北宜都人，碩士，助理研究員，研究方向：豬傳染病的病原學(xué)診斷和臨床防控技術(shù)(E-mail：lmb409@126.com)。

**通訊作者：梅書棋，研究員，研究方向：豬遺傳育種，(E-mail：msqlfe@163. com)。