暗紋東方鲀Amhr2基因外顯子9的SNP7271檢測及其與性別相關(guān)分析

金　武，聞海波，杜興偉，馬學(xué)艷，顧若波，徐　跑

(1.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實驗室

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫　214081；

2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫　214182)

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暗紋東方鲀Amhr2基因外顯子9的SNP7271檢測及其與性別相關(guān)分析

金武1,2，聞海波1，杜興偉2，馬學(xué)艷1，顧若波1，徐跑1,2

(1.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實驗室

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫214081；

2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214182)

摘要：利用傳統(tǒng)PCR和ABI 3730測序技術(shù)對暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)Amhr2基因外顯子9進(jìn)行了SNP7271檢測和測序分析，并對該SNP位點(diǎn)與暗紋東方鲀性別相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在SNP7271位點(diǎn)發(fā)生了G/C堿基突變，產(chǎn)生了CG、CC兩種基因型。SNP7271和暗紋東方鲀性別存在顯著相關(guān)性(P<0.01)?；蛐蜑镃G的個體生理性別為雄性，基因型CC的個體生理性別為雌性。

關(guān)鍵詞：Amhr2基因；暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)；性別決定；基因型

暗紋東方鲀(Takifuguobscures)體棕褐色，體側(cè)下方黃色，腹面白色，其余體表可見白色狹紋或者白色斑點(diǎn)，因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，與刀魚、鰣并列“長江三鮮”[1]。隨著暗紋東方鲀營養(yǎng)[2-3]、生長與發(fā)育[4-6]、生長影響因子，如溫度[7]、鹽度[2]以及疾病控制與健康養(yǎng)殖技術(shù)[8-9]等研究的廣泛開展，特別是暗紋東方鲀控毒或無毒化處理的研究[10]，使之成為沿海養(yǎng)殖發(fā)展速度最快的品種之一，并從沿海向內(nèi)地擴(kuò)展，成為出口創(chuàng)匯、提高漁民養(yǎng)殖收入的重要品種。

Amhr2(antimüllerianhormonereceptortypeII)是穆勒氏激素通路中的一個重要因子，它的主要作用是調(diào)控哺乳動物和一些脊椎動物的繁殖器官的發(fā)育[11]，主要存在于細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合[12]。對黑鯛[13]、青鳉[13]、矛尾魚[14]的研究表明，雄性性腺中Amhr2基因表達(dá)量顯著高于雌性。通過對一系列SNP標(biāo)記和性別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，Amhr2基因外顯子9的一個編號為7271的SNP位點(diǎn)在東方鲀屬3個種均存在，并具有唯一保守性，在SNP7271位點(diǎn)雜合子(C/G)為生理學(xué)雄性個體，純合子(C/C)為生理學(xué)雌性個體[15]。但SNP7271在其他魚類中尚未發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律。同屬東方鲀屬的暗紋東方鲀的相關(guān)研究仍較少[16]，本研究通過傳統(tǒng)PCR技術(shù)和ABI 3730測序技術(shù)對暗紋東方鲀Amhr2基因外顯子9進(jìn)行了SNP7271驗證和測序分析，以期為養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中篩選雄性個體提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

2014年7—10月，在江陰申港三鮮水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司選取同批養(yǎng)成的1齡成體暗紋東方鲀。通過解剖，肉眼觀察暗紋東方鲀成體生理性別，雄魚精巢呈乳白色，可擠出精液；雌魚卵巢呈淡黃色，可見不同時期卵粒。共雌性47尾，雄性44尾，剪取肝臟組織，用75%乙醇保存。

1.2基因組DNA提取及引物設(shè)計

基因組DNA提取采用TaKaRa MiniBEST Universal基因組DNA提取試劑盒提取。引物設(shè)計在文獻(xiàn)[15]報道的紅鰭東方鲀Amhr2基因SNP7271上下游設(shè)計引物，引物序列為：Forward：5′-ACATCCAGATCTCCCACAGC-3′；Reverse：5′-TAAAACACG-CGTGAAAACCA -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度239 bp，引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。

1.3PCR擴(kuò)增及序列測定

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板50 ng，體積1 μL；1×buffer，體積2 μL；Mg2+濃度為3 mmol/L，體積為0.6 μL；dNTP，濃度為2 mmol/L，體積為2 μL；Taq酶濃度為1 U，體積為0.2 μL；ddH2O 12.2 μL，引物濃度0.5 pM，體積為2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min 30 s，65 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；65 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。紫外透射臺上觀察擴(kuò)增結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化后測序。

1.4實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

λ2獨(dú)立性檢驗計算公式：

Ei為理論值，Oi為實際觀測值。因自由度df=1，因此進(jìn)行連續(xù)性矯正。數(shù)據(jù)分析用R[17](2.15.2)軟件進(jìn)行2×2列雙聯(lián)表分析，進(jìn)行Fisher精確檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增

DNA提取試劑盒所提取的DNA經(jīng)檢測純度較高，可用于PCR擴(kuò)增。所設(shè)計的引物均能擴(kuò)增出239 bp的特異性片段(圖1)。

圖1　暗紋東方鲀Amhr2基因外顯子9 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1-16為樣本編號，M是marker泳道，片段大小自下而上為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp

2.2序列測定與分析

由圖2測序結(jié)果可知，雄性個體在SNP7271處發(fā)生了堿基C/G非同義突變，雄性個體在該位點(diǎn)呈雜合子狀態(tài)，雌性個體在該位點(diǎn)呈純合子狀態(tài)。

2.3Amhr2外顯子9基因型與性別相關(guān)性分析

通過列2×2列聯(lián)表，進(jìn)行Fisher精確檢驗。結(jié)果表明，SNP7271和暗紋東方鲀性別之間存在顯著相關(guān)性(P<0.001)。

圖2　暗紋東方鲀Amhr2基因外顯子9的

性別實際觀察次數(shù)理論次數(shù)樣本數(shù)PC/G雜合子雄性384747雌性1044C/C純合子雄性9047雌性434444<0.001

3討論

3.1SNP7271與東方鲀屬性別相關(guān)性

暗紋東方鲀性別非生殖季節(jié)從外表不容易區(qū)分，在生殖季節(jié)可以通過測量形態(tài)學(xué)指標(biāo)[18]、觸摸腹部[19]、觀察游泳姿勢[20]等方法判定，但準(zhǔn)確率仍不能達(dá)到100%，且需要長期經(jīng)驗積累，缺乏快速、高通量鑒別暗紋東方鲀性別的方法。

對紅鰭東方鲀SNP7271性別相關(guān)SNP位點(diǎn)的研究表明，SNP7271和1齡紅鰭東方鲀(孵化后271日齡)性別存在很高的相關(guān)性[21]。本研究表明，在暗紋東方鲀1齡成體中，SNP7271和性別存在顯著相關(guān)性，可以為1齡暗紋東方鲀性別鑒定提供參考。

由于SNP7271雌雄差異僅為1個堿基，在對數(shù)目較多的個體大批量進(jìn)行性別鑒定時，采用高分辨率熔解(High-resolution melting，HRM)法，通過PCR之后的熔解曲線分析快速、高通量地鑒別暗紋東方鲀性別[21]。部分專門用于HRM分析的儀器[22-24]甚至可以做到5 min完成96/384孔板PCR產(chǎn)物突變掃描或基因分型，且單個PCR產(chǎn)物檢測成本較低。這些技術(shù)對于篩選單雄性暗紋東方鲀進(jìn)行養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要意義，不僅節(jié)約了雌性個體消耗的飼料支出，特別是繁殖期間攝入能量物質(zhì)均轉(zhuǎn)化為不能食用的卵巢，而且提供市場優(yōu)質(zhì)、安全的精巢及精巢加工品，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2SNP7271檢測性別準(zhǔn)確性

用SNP7271來檢測暗紋東方鲀準(zhǔn)確性較高(雄性為80.9%，雌性為97.7%)。雌性基因型(C/C)個體誤判為生理學(xué)雄性的可能原因是：(1)這9個樣本卵巢發(fā)育慢或未發(fā)育，雖然進(jìn)行性腺檢查時剪破精巢進(jìn)行觀察是否有乳白色液體，但卵巢未發(fā)育，有可能將組織液誤判為精液；(2)與紅鰭東方鲀類似，暗紋東方鲀雄性性別的形成也可能受多個因素的影響，出現(xiàn)雌性基因型為C/C的生理學(xué)雄性個體[21]。SNP7271判斷雌性個體時，僅1尾誤判，因此在后續(xù)開展全雄暗紋東方鲀篩選時，可以通過排除雌體的方法提高群體雄性個體比例。

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(責(zé)任編輯：陳細(xì)華)

SNP7271 detection of exton 9 of Amhr2 gene and its associations with sex association in the Takifugu obscurus

JIN Wu1,2,WEN Hai-bo1,DU Xing-wei2,MA Xue-yan1,GU Ruo-bo1,XU Pao1,2

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheriesandGermplasmResourcesUtilization,MinistryofAgriculture/FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuxi214081,Jiangsu,China;2.WuxiFisheriesCollege,NanjingAgricultureUniversity,Wuxi214182,Jiangsu,China)

Abstract：In order to identify gender of Takifugu obscurus before reproduction season and save the input of aquaculture of T.obscurus,SNP7271 of exton 9 of T.obscus Amhr2 gene were detected by PCR and DNA sequencing in present study.The correlation analysis between the polymorphism of Amhr2 and sex determination was studied.The results indicated that a G/C mutation at the position SNP7271 of the Amhr2 gene by sequencing and resulted in 2 genotype (GG,GC).There was significant correlation between SNP7271 and the gender of T.obscurus.The genotype CG was male and the genotype CC was female.

Key words：Amhr2 gene; Takifugu obscurus; sex determination;genotype

中圖分類號：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)02-0099-04

作者簡介：第一金武(1984-)，男，助理研究員，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖與水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail:jinw@ffrc.cn通訊作者：徐跑。E-mail:xup@ffrc.cn

收稿日期：2014-03-21；

修訂日期：2015-06-03

資助項目：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2013JBFR07)；江蘇省水產(chǎn)三新工程項目(D2014-9)

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