鹽酸小檗堿對草魚補(bǔ)體系統(tǒng)及補(bǔ)體c3作用的研究

彭耀宗，周　霞，韓　冰，黃　濤，黃利掛，李學(xué)剛,3,4

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶　400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，400715；

3.重慶中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)力促進(jìn)中心，重慶　400715；

4.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶　400715)

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鹽酸小檗堿對草魚補(bǔ)體系統(tǒng)及補(bǔ)體c3作用的研究

彭耀宗1，周霞1，韓冰2，黃濤1，黃利掛1，李學(xué)剛1,3,4

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，400715；

3.重慶中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)力促進(jìn)中心，重慶400715；

4.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶400715)

摘要：為了探究鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)對草魚(Ctenopharyngodon idellus)補(bǔ)體c3的作用機(jī)理，用含0、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿飼料投喂草魚，在第7 d、14 d檢測血清中補(bǔ)體c3含量，在第14 d檢測肝臟中補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)量及急性感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后存活情況。并進(jìn)一步對鹽酸小檗堿體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和補(bǔ)體消耗試驗(yàn)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示；攝食鹽酸小檗堿的草魚血清中補(bǔ)體c3含量和肝臟補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)量均顯著性增加(P<0.05/P<0.05)，草魚的存活率與對照組相比也有顯著性提高(P<0.01)。補(bǔ)體消耗試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)鹽酸小檗堿在血清中濃度小于5 mg/L時(shí)與對照組相比補(bǔ)體消耗不顯著，當(dāng)鹽酸小檗堿濃度大于5 mg/L時(shí)，補(bǔ)體消耗達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，表明此時(shí)鹽酸小檗堿與補(bǔ)體c3直接結(jié)合，激活補(bǔ)體。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，灌服鹽酸小檗堿后，出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，兩峰值分別是0.243 mg/L和0.117 mg/L，此濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于與補(bǔ)體c3直接結(jié)合量最低量(5 mg/L)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對草魚補(bǔ)體c3的作用機(jī)理可能是通過上調(diào)補(bǔ)體c3mRNA的表達(dá)增加補(bǔ)體c3數(shù)量，而非通過直接結(jié)合補(bǔ)體c3來改變其活性。

關(guān)鍵詞：草魚(Ctenopharyngodon idellus);鹽酸小檗堿;補(bǔ)體c3;中藥

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到長足的發(fā)展，隨之而來的病害防控使得抗生素濫用成災(zāi)，各國取消飼用抗生素的呼聲也越來越高，中藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢已成為各國研究的熱點(diǎn)[1]。魚類主要疾病是細(xì)菌性和病毒性疾病[2-3]，黃連類清熱解毒中藥具有很好的抗菌抗病毒作用，黃連的代表性成分小檗堿(Berberine，BBR)又稱黃連素，是黃連主要的生物堿，是一種黃色的異喹啉類生物堿[4-7]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，小檗堿有殺菌、抗病毒、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等作用[8-9]，在殺菌抗病毒方面，國內(nèi)外已有不少報(bào)道[10-13]。但大部分是黃連復(fù)方殺菌抗病毒[14-15],而關(guān)于黃連單體小檗堿對免疫大分子機(jī)理研究卻鮮有報(bào)道。

補(bǔ)體c3是補(bǔ)體成分中含量最高的一種，不論是經(jīng)典途徑還是替代途徑，均需在c3被活化之后，才能推進(jìn)后續(xù)補(bǔ)體成分的連鎖反應(yīng)[16]，參與抗菌及多種免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答反應(yīng)[17]，在補(bǔ)體系統(tǒng)激活中起關(guān)鍵性作用。因此一定程度上提高補(bǔ)體c3水平對魚類非特異性免疫有重大意義。本研究工作系統(tǒng)評價(jià)了鹽酸小檗堿對補(bǔ)體c3含量，mRNA表達(dá)及其分子結(jié)構(gòu)變化的影響，為黃連等清熱類中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)魚

試驗(yàn)草魚(Ctenopharyngodonidellus)(500±10) g購自重慶市草魚養(yǎng)殖廠，從中挑選整齊、健壯的草魚，在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖箱中馴養(yǎng)14 d，水中溶氧保持在5 mg/L以上，水溫控制(25±1) ℃。

1.2飼料與分組

通威全價(jià)飼料打成粉，按0、600、1 200、2 400 mg/kg添加鹽酸小檗堿，將各種原料充分混合后，加入膨化機(jī)中，即制備成普通飼料(NC)組、0.06%(BBR-L)組、0.12%(BBR-M)組、0.24%(BBR-H)組的鹽酸小檗堿飼料，烘干后放于室溫保存。

1.3測定指標(biāo)與方法

1.3.1草魚血清補(bǔ)體c3含量測定

將試驗(yàn)魚隨機(jī)分在NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組,每組6尾，每天投喂飼料10 g/尾，分別在第7 d、14 d尾靜脈取血，4 ℃離心,4 000 r/min，10 min，取上清液置備血清，血清保存于4 ℃冰箱，重復(fù)三次，血清補(bǔ)體c3含量測定按南京建成補(bǔ)體c3試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RNA的提取及cDNA的合成：NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組喂養(yǎng)(10 g/(尾·d))14 d后取肝臟每尾50 mg，液氮研磨，按照TRIzol (Invitrogen公司)說明書提取肝臟總RNA，測定其濃度和純度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，按照PrimeScript?RTreagentKit(Takara公司)試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)：利用primer Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得草魚的補(bǔ)體c3全長序列(GenBank登錄號：AY374472.1) 和β-actin 基因(GenBank登錄號：DQ211096.1)，設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)， 熒光定量PCR反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green，根據(jù)TaKaRa公司產(chǎn)品設(shè)計(jì)反應(yīng)體系。在Bio-Rad的CFX96系統(tǒng)上執(zhí)行。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,53.9 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s ，42個(gè)循環(huán),溶解曲線從55.0 ℃到95.0 ℃ 每5 s增加0.5 ℃作為一個(gè)時(shí)間間隔用來檢測補(bǔ)體c3的表達(dá)差異。mRNA相對表達(dá)水平的計(jì)算采用了2-△△CT法和用β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1　草魚補(bǔ)體c3基因和β-actin參考基因引物序列

1.3.3細(xì)菌攻毒實(shí)驗(yàn)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)菌株由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供，將NC、BBR-L、BBR-M、BBR-H組喂養(yǎng)14 d后，每組30尾，分別腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水和等量的嗜水氣單胞菌(108cfu/mL)，觀察發(fā)病癥狀及死亡情況，分離細(xì)菌，確認(rèn)死因，連續(xù)10 d均無死亡情況后統(tǒng)計(jì)草魚存活情況。

1.3.4補(bǔ)體消耗實(shí)驗(yàn)

鹽酸小檗堿體外補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)Ji等[18]已報(bào)道。本研究在他們實(shí)驗(yàn)上稍加改善。將試驗(yàn)魚隨機(jī)分為8組，每組10尾，尾靜脈取血，分離血清，取30 μL的草魚血清分別與等量的4、10、20、40、80、120、160 mg/L的鹽酸小檗堿溶液充分混合，攪拌1.5 h。用等體積的PBS代替鹽酸小檗堿作為對照組。分別在每支試管中加入60 μL新鮮兔紅細(xì)胞(1×108cells/mL)，不時(shí)輕微搖動(dòng)1.5 h后，在每支試管中加入3.38 mL PBS，并在1 600g條件下離心5 min，取上清液于414 nm處測定吸光度。在60 μL兔紅細(xì)胞中分別加入3.44 mL蒸餾水或PBS，獲得溶血的最大值和最小值(自發(fā)溶血)。補(bǔ)體引起的兔紅細(xì)胞溶血率按下面公式計(jì)算：溶血率={[A414 nm(樣品)-A414 nm(自然溶血)]/

[A414 nm(100% 全溶血)-A414 nm(自然溶血)]}×100%。

1.3.5藥代實(shí)驗(yàn)

每尾魚按48 mg/kg灌服鹽酸小檗堿(5 mg/mL)，藥液務(wù)必灌入草魚前腸，無回吐者用于試驗(yàn)。在0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12、24、36 h尾靜脈采血，置于預(yù)先用1%肝素鈉抗凝過的試管內(nèi)，分離血漿，-20 ℃保存，各時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)。樣品前處理參考馬寅[19]的方法，把血清和乙酸乙酯按體積比1∶4比例混合，離心，收集上清液于15 mL離心管中，同法重復(fù)1次，合并2次收集的上清液，置于氮吹儀上吹干，加入1 mL甲醇，渦旋2 min，經(jīng)0.25 μm一次性針頭過濾器過濾后，采用流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鉀(50∶50)，流速1.0 mL/min,檢測波長345 nm，進(jìn)樣量50 μL，進(jìn)樣檢測，保留時(shí)間為25 min，回收率及精密度試驗(yàn)參考馬寅[19]方法進(jìn)行。

1.3.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析

所有數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析采用spss軟件，用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性,P<0.05 為顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1草魚血清補(bǔ)體c3含量的變化

投喂鹽酸小檗堿飼料后血清補(bǔ)體c3的變化見圖1，投喂7 d， BBR-M和BBR-H組顯著高于對照組(P<0.05)。當(dāng)投喂14 d后，3個(gè)給藥組補(bǔ)體c3升高均達(dá)顯著水平(P<0.05)，且呈一定趨勢的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表明鹽酸小檗堿能促進(jìn)草魚血清補(bǔ)體c3含量的增加，且與濃度和喂養(yǎng)時(shí)間成正相關(guān)。

圖1　各個(gè)濃度鹽酸小檗堿對草魚血清補(bǔ)體c3的影響

2.2補(bǔ)體c3 mRNA的表達(dá)

投喂鹽酸小檗堿飼料14 d后，檢測肝臟中補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)的變化(圖2)。PCR結(jié)果顯示，試驗(yàn)組草魚補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)均顯著性升高(P<0.05)，高濃度的上調(diào)比例大于低濃度，且上調(diào)的趨勢與血清中補(bǔ)體c3結(jié)果類似。表明鹽酸小檗堿能上調(diào)草魚補(bǔ)體c3 mRNA的表達(dá)。

圖2　不同含量鹽酸小檗堿對補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)的影響

2.3細(xì)菌攻毒試驗(yàn)結(jié)果

攻毒結(jié)果見圖3,BBR-L、BBR-M、BBR-H組草魚存活數(shù)分別是15尾、21尾和22尾，存活率分別為50%、70%、73.3%。而對照組(NC)存活僅3尾，存活率為10%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，各個(gè)濃度試驗(yàn)組草魚存活率均顯著提高(P<0.01)，表明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力，且高劑量比低劑量更有效。

圖3　草魚投喂不同濃度鹽酸小檗堿后用嗜水氣

2.4體外補(bǔ)體消耗試驗(yàn)

圖4可見，當(dāng)鹽酸小檗堿在血清中濃度為2 mg/L時(shí)溶血率為85.71%，與對照組85.19%相比變化不大，此時(shí)未激活補(bǔ)體，當(dāng)鹽酸小檗堿在血清中濃度為5 mg/L時(shí)，溶血率為82.42%，溶血率有所下降但未達(dá)顯著水平(P>0.05)，當(dāng)鹽酸小檗堿在血清中的濃度超過10 mg/L時(shí)，溶血率先降低后升高，其濃度為10、20、40、60 mg/L時(shí)溶血率顯著性下降(P<0.05)，此結(jié)果與Ji等[18]報(bào)道是一致的，表明此濃度的鹽酸小檗堿激活補(bǔ)體系統(tǒng)。40 mg/L以后溶血率逐漸升高，可能是由于高濃度鹽酸小檗堿具有溶血功能。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)血清中鹽酸小檗堿濃度小于5 mg/L時(shí)不能激活補(bǔ)體，當(dāng)鹽酸小檗堿濃度≥10 mg/L時(shí)補(bǔ)體被激活。

圖4　鹽酸小檗堿對補(bǔ)體消耗的影響

2.5鹽酸小檗堿藥代動(dòng)力學(xué)

在設(shè)定的色譜條件下，本法回收率為95.3%±1.1%，日內(nèi)與日間精密度均小于10%，結(jié)果顯示此法適合樣品檢測。灌服鹽酸小檗堿后，血藥濃度隨時(shí)間變化見圖5，灌服藥物后血藥濃度逐漸升高，在1.5 h時(shí)達(dá)到第一個(gè)峰(0.243 mg/L),之后血藥濃度下降后又升高，在第5 h時(shí)到達(dá)第二峰(0.117 mg/L)，36 h后檢測不到鹽酸小檗堿。本研究結(jié)果出現(xiàn)明顯雙峰現(xiàn)象與秦青英[20]研究羅非魚口灌鹽酸小檗堿和王亮等[21]研究小鼠口服小檗堿等結(jié)果類似，出現(xiàn)雙峰的原因可能是因?yàn)榉植?重吸收，當(dāng)組織的藥物濃度高于血漿，藥物可能從組織轉(zhuǎn)移到血漿，或肝腸循環(huán)造成二次吸收帶來的。

圖5　口灌鹽酸小檗堿在草魚體內(nèi)血漿的藥物濃度-

3討論

補(bǔ)體系統(tǒng)在被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后,能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗體的形成,介導(dǎo)病原體的清除[22],其中補(bǔ)體c3在激活途徑中起關(guān)鍵作用，其水平是衡量體液免疫的重要指標(biāo)[23-24]。在我們研究中，投喂鹽酸小檗堿14 d后，攻毒實(shí)驗(yàn)表明草魚存活率顯著提高。為探究體液免疫的保護(hù)作用，我們對補(bǔ)體c3作用機(jī)理展開了研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草魚攝食鹽酸小檗堿后，血清中補(bǔ)體c3的含量明顯升高，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)也表明補(bǔ)體c3 mRNA相對表達(dá)顯著性增加，蛋白質(zhì)的表達(dá)與mRNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，說明鹽酸小檗堿能通過上調(diào)補(bǔ)體c3 mRNA表達(dá)來提高補(bǔ)體c3數(shù)量。

天然補(bǔ)體c3發(fā)揮功效主要是通過蛋白酶水解切割后其構(gòu)象改變完成的[25]，補(bǔ)體c3活化會(huì)引起膜攻擊復(fù)合物的形成，當(dāng)補(bǔ)體c3被激活后進(jìn)而推動(dòng)后續(xù)免疫反應(yīng)[26]。Ji等[18]報(bào)道在草魚血清中加入鹽酸小檗堿，鹽酸小檗堿能與補(bǔ)體c3直接結(jié)合，改變補(bǔ)體c3構(gòu)象，進(jìn)而激活補(bǔ)體c3。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似，即鹽酸小檗堿在血清中濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，可以激活補(bǔ)體c3，但未達(dá)顯著水平，當(dāng)鹽酸小檗堿濃度達(dá)到10 mg/L后，激活作用達(dá)到顯著水平，可見高濃度的鹽酸小檗堿可以與補(bǔ)體c3直接結(jié)合并改變補(bǔ)體c3的構(gòu)像，激活補(bǔ)體c3，濃度低于5 mg/L則無此作用。研究鹽酸小檗堿體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，藥-時(shí)曲線出現(xiàn)2個(gè)峰，最大值為0.243 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鹽酸小檗堿與補(bǔ)體c3直接作用所需要的濃度(5 mg/L)，因此，可以推測，草魚攝食鹽酸小檗堿后，體內(nèi)血藥濃度不足以達(dá)到鹽酸小檗堿與補(bǔ)體c3直接相結(jié)合的濃度，此時(shí)鹽酸小檗堿與補(bǔ)體c3不能直接結(jié)合產(chǎn)生激活作用。

本試驗(yàn)表明，鹽酸小檗堿能提高草魚免疫力，對草魚補(bǔ)體c3作用機(jī)理可能是通過上調(diào)補(bǔ)體c3 mRNA的表達(dá)，增加體內(nèi)補(bǔ)體c3數(shù)量來完成。而并非通過直接結(jié)合補(bǔ)體c3改變其活性來完成的，這也為黃連、黃柏等含小檗堿的中草藥用于水產(chǎn)疾病的防止提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

The effects of berberine hydrochloride on complement system and complement c3 in Ctenopharyngodon idellus

PENG Yao-zong1,ZHOU Xia1,HAN Bing2,HUANG Tao1,HUANG Li-gua1,LI Xue-gang1,3,4

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.SchoolofLifeSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;3.InstituteofModernBioPharmaceutical，Chongqing400715,China;4.EngineerResearchCenterofChongqingPharmaceuticalProcessandQualityControl，Chongqing4001715,China)

Abstract：To explore the effect of berberine hydrochloride on the complement c3 of Ctenopharyngodon idellus,the level of complement c3 in serum were studied for 7 day and 14 day,the mRNA expression of c3 in the liver and resistance against acute Aeromonas hydrophila infection in C.idellus were evaluated after 14 days of feeding with berberine hydrochloride at the rate of 0,0.06%,0.12%,0.24%,respectively.The pharmacokinetics in vivo and complement consumption test in vitro of berberine hydrochloride were further studied.The results showed that the complement c3 levels in serum and the mRNA expression of c3 in the liver of fish fed with berberine hydrochloride increased significantly when compared with the control (P<0.05/P<0.01).The survival rate was significantly higher in groups fed with berberine hydrochloride than the control (P<0.01).In addition,complement consumption showed significant difference only when the concentration of berberine hydrochloride was higher than 5 mg/L.Berberine hydrochloride combined with complement molecules directly and the complement system was activated at this time.The pharmacokinetics experiment found that bimodal phenomena appeared after taking berberine hydrochloride and the value of two peaks was 0.243 mg/L and 0.117 mg/L,respectively,which was much lower than 5 mg/L.The results suggested that the berberine hydrochloride could enhance the immunity of C.idellus and the effect of berberine hydrochloride on the complement c3 in C.idellus might not be by combining with complement molecules directly,but through up-regulating the mRNA expression of c3 to increase the quantity of c3 protein.

Key words：Ctenopharyngodon idellus;berberine hydrochloride;complement c3;Chinese herbal medicine

中圖分類號：S948

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)02-0050-05

作者簡介：第一彭耀宗(1988-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail:pyz516565384@163.com通訊作者：李學(xué)剛。E-mail:xuegangli@swu.edu.cn

收稿日期：2015-07-15；

修訂日期：2015-10-28

資助項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃-石柱黃連規(guī)范化種植基地及其SOP優(yōu)化升級研究(2011BAI13B02-1)；石柱黃連須散中試工藝研究，西南大學(xué)校地合作基金(Sz201302)；重慶百名高端工程技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃