蘭州鲇MyoD基因的克隆與生物信息學(xué)分析

俞兆曦，連總強(qiáng)，吳旭東,3, ，楊忠禮，李　力，張　鋒，肖　偉,賽清云

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州　730070；

2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，銀川　750001；

3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，銀川　750001)

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蘭州鲇MyoD基因的克隆與生物信息學(xué)分析

俞兆曦1,2，連總強(qiáng)2,3，吳旭東1,2,3,，楊忠禮1，李力2,3，張鋒2,3，肖偉2,3,賽清云2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；

2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，銀川750001；

3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，銀川750001)

摘要：為研究蘭州鲇(Silurus lanzhouensis) 生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因，運(yùn)用RT-PCR 、TA 克隆和核酸測(cè)序等技術(shù)對(duì)蘭州鲇MyoD基因的CDS 區(qū)及全基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。獲得蘭州鲇MyoD基因的完整CDS 區(qū)序列810 bp (GenBank 登錄號(hào)：KT277551)及MyoD基因全序列1 210 bp(GenBank 登錄號(hào)：KT339175)，包括部分5′端63 bp和3′端58 bp；ORF區(qū)含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度分別為510 bp、80 bp和220 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為156 bp和123 bp，編碼269個(gè)氨基酸殘基組成的可溶酸性蛋白質(zhì)；預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位MyoD主要分布于細(xì)胞核(56.5%)，MyoD二聚體結(jié)構(gòu)是一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)?；?2種魚類MyoD基因CDS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及編碼區(qū)同源性比較，分析結(jié)果表明，MyoD基因編碼區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中比較保守，且蘭州鲇MyoD與斑點(diǎn)叉尾、白鯰魚、藍(lán)鯰魚之間存在較高的同源性。

關(guān)鍵詞：蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)；MyoD；基因克?。簧镄畔W(xué)

提高魚類生長(zhǎng)速度和抗性成為目前魚類育種研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。已有研究表明，魚類肌肉生長(zhǎng)主要受生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族(Myogenic regulatory factors)調(diào)控[1]，該家族包括MyoD、MyoG、Myf5和MRF4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中MyoD基因的全稱是成肌分化抗原(Myogenic differentiation antigen)，它能調(diào)控肌肉細(xì)胞活性和增殖，在肌肉形成過(guò)程中起正調(diào)控作用[2-3]。繼1987 年Davis等[4]首次獲得人的MyoD基因cDNA 序列后，鯉(Cyprinuscarpio)[5]、金頭鯛(Sparusaurata)[6]、大口黑鱸(Micropterussalmoide)[7]等魚類MyoD基因相繼被克隆，但尚未有蘭州鲇MyoD基因的研究報(bào)道。

蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)又稱黃河鯰，隸屬于鲇形目鲇科鲇屬，是黃河中上游特有的大型經(jīng)濟(jì)魚類。但是由于水利建設(shè)、水域污染、過(guò)度捕撈等因素，近年來(lái)蘭州鲇野生群體數(shù)量日益減少，已被《中國(guó)物種紅色名錄》列為瀕危物種[8]。目前，蘭州鲇的相關(guān)研究主要集中在苗種繁殖、飼料營(yíng)養(yǎng)、生理生化、微衛(wèi)星分子標(biāo)記及線粒體基因組等方面[9-13]，有關(guān)生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因及功能研究報(bào)道較少，僅見王發(fā)新等[14]對(duì)蘭州鲇生長(zhǎng)基因(GH)的研究。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)蘭州鲇MyoD基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，以期為蘭州鲇生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因分子生物學(xué)研究和蘭州鲇家系分子標(biāo)記輔助選育提供資料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蘭州鲇來(lái)源于寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國(guó)家級(jí)蘭州鲇原種場(chǎng)建設(shè)基地，取成年蘭州鲇一尾，在實(shí)驗(yàn)室宰殺后迅速剪取背肌液氮凍存提取RNA，無(wú)水乙醇-20 ℃保存提取DNA。

1.2主要試劑

RNA 提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格公司；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×PowerTaqPCR MasterMix、IPTG及X-Gal、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；100 bp ladder DNA marker、pMD19-T 克隆載體試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3基因組DNA及RNA的提取與檢測(cè)

按照RNA和DNA提取試劑盒分別提取蘭州鲇背肌組織總RNA及DNA，用核酸濃度測(cè)定儀與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

參照GenBank中鲇科魚類的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，送上海生工生物工程股份有限公司合成，其中Myc1為CDS區(qū)(Coding sequence 編碼序列)引物，M53為全基因擴(kuò)增引物，引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表1所示。RT-PCR反應(yīng)的總體積為25 μL，其中模板2 μL(經(jīng)稀釋cDNA的終濃度為50 ng/μL、DNA的終濃度為55 ng/μL)，上下游引物各1 μL(經(jīng)稀釋后濃度為20 ng/μL)，2×PowerTaqPCR MasterMix 12.5 μL，無(wú)菌水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1　引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

1.5 MyoD基因CDS區(qū)和全基因TA克隆與鑒定

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD19-T克隆載體在4 ℃條件下過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至30 μL DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后加800 μL LB 培養(yǎng)液搖勻復(fù)蘇1 h，將復(fù)蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL Amp、0.5%IPTG及0.04 mg/mLX-gal的LB 平板培養(yǎng)皿表面，37 ℃避光培養(yǎng)12 h；挑取白色陽(yáng)性單克隆菌落，用LB(Amp+)培養(yǎng)液37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后進(jìn)行菌液PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：菌液2 μL，上下游引物各1 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL，無(wú)菌水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[15]，篩選陽(yáng)性菌液送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6生物信息學(xué)分析

MyoD基因序列用MEGA5.2軟件和NCBI的ORF Finder 程序分析蘭州鲇MyoD基因序列；使用PredictProtein (http://www.predictprotein.org)[16]、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)、ExPASy-ProtParam (http://www.expasy.org/)等在線分析軟件與Lasergene7.1 軟件包中的Editseq 軟件、Protean 軟件[17]分析MyoD的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)域與理化性質(zhì)；使用在線亞細(xì)胞定位工具PSORT IIPrediction(http://psort.hgc.jp/ form.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件預(yù)測(cè)MyoD的跨膜區(qū)[18]；使用MEGA 5.2軟件進(jìn)行同源性分析，并用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA和RNA檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到蘭州鲇肌肉組織總RNA中具有完整的兩條帶，分別為28 S、18 S(圖1)；測(cè)定的A260nm/A280nm比值在1.8～2.0之間，表明RNA完整性較好，無(wú)蛋白質(zhì)和DNA污染，適合進(jìn)一步RT-PCR反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)肌肉組織DNA條帶清晰。

圖1　蘭州鲇肌肉組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2蘭州鲇MyoD基因目的片段擴(kuò)增與TA 克隆

蘭州鲇RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得單一的DNA 條帶，片段大小介于750～850 bp，與預(yù)擴(kuò)增片段大小一致(圖2)，切膠回收條帶清晰、效果良好，可用于克隆測(cè)序。陽(yáng)性克隆菌液經(jīng)測(cè)序獲得長(zhǎng)度為810 bp的蘭州鲇MyoD基因CDS 區(qū)序列，結(jié)果整理分析后，提交GenBank獲得登錄號(hào)：KT277551。

圖2　蘭州鲇MyoD基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

蘭州鲇M53引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)單一DNA條帶，片段大小介于1 000～1 400 bp，與預(yù)擴(kuò)增片段大小一致(圖3)，切膠回收條帶清晰、效果良好，可用于克隆測(cè)序。陽(yáng)性克隆菌液經(jīng)測(cè)序獲得長(zhǎng)度為1 210 bp蘭州鲇MyoD全基因序列，并提交GenBank獲得登錄號(hào)：KT339175。

圖3　蘭州鲇MyoD全基因基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3蘭州鲇MyoD核苷酸序列及編碼氨基酸序列分析

應(yīng)用NCBI 的ORF Finder 程序分析蘭州鲇MyoD基因CDS序列，并參照Kozak法則[20]，檢測(cè)獲得長(zhǎng)度為810 bp的ORF (Open Reading Frame,開放閱讀框)，起始密碼子為ATG ，終止密碼子為TAG ，CDS序列中G+C含量為53.83%，A+T含量為46.17%，表明MyoD編碼區(qū)的DNA雙鏈較穩(wěn)定。

利用Lasergene7.1軟件包的EditSeq軟件對(duì)蘭州鲇MyoD基因的核苷酸組成及其序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，蘭州鲇MyoD基因全序列長(zhǎng)度為1 210 bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度分別為510 bp、80 bp和220 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為156 bp和123 bp，除長(zhǎng)度為63 bp的5′和58 bp的3′區(qū)外，基因堿基序列的A+T含量為52.71%，G+C含量為47.29%，其中3個(gè)外顯子區(qū)域的G+C含量均高于A+T含量。

利用EditSeq軟件對(duì)測(cè)序得到的蘭州鲇MyoD基因CDS序列進(jìn)行翻譯，獲得由269個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，其中Ser最多(13.0%)，其次為Pro(8.2%)，Trp最少(0.4%)。蘭州鲇MyoD氨基酸序列中含有37個(gè)堿性氨基酸(Lys、Arg、His)，38個(gè)酸性氨基酸(Asp、Glu)，96個(gè)非極性氨基酸(Ala、Ile、Leu、Phe、Trp、Val、Met、Pro)，98個(gè)極性氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr、Gly)。

2.4蘭州鲇MyoD蛋白理化性質(zhì)分析

應(yīng)用ExPASy-ProtParam在線軟件對(duì)MyoD蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，蘭州鲇MyoD的相對(duì)分子質(zhì)量為29 972.1 KD，半衰期為30 h，理論等電點(diǎn)為5.40；消光系數(shù)為17 920；不穩(wěn)定系數(shù)為71.83，根據(jù)Guruprasad等[21]提出的不穩(wěn)定系數(shù)大于40即為不穩(wěn)定性蛋白，預(yù)測(cè)蘭州鲇MyoD為不穩(wěn)定性蛋白；疏水指數(shù)為62.42，總平均親水性為-0.738，表明MyoD蛋白整體呈現(xiàn)親水性，為可溶酸性蛋白[22]。

利用TMHMM在線軟件對(duì)蘭州鲇MyoD蛋白進(jìn)行了跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明該蛋白不含跨膜區(qū)(圖4)。利用PSORT II Prediction在線軟件對(duì)MyoD的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，MyoD蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、線粒體及分泌系統(tǒng)囊泡中的分布比例分別為56.5%、26.1%、8.7%、4.3%、4.3%，表明MyoD蛋白主要在細(xì)胞核分布。

2.5蘭州鲇MyoD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用PredictProtein在線軟件對(duì)蘭州鲇MyoD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)MyoD蛋白中α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲所占的比例分別為17.47%、82.53%(表2)，以無(wú)規(guī)卷曲為主。采用SWISS-MODEL軟件對(duì)蘭州鲇MyoD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明蘭州鲇MyoD為穩(wěn)定的螺旋-環(huán)-螺旋二聚體結(jié)構(gòu)(bHLH)(圖5)。

圖4　蘭州鲇MyoD蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)類型預(yù)測(cè)比例α-螺旋(α-helix)17.47%無(wú)規(guī)卷曲(coil)82.53%

圖5　蘭州鲇 MyoD同源二聚體示意圖

2.6蘭州鲇MyoD基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖6　基于MyoD基因cDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

物種核苷酸同源性/%氨基酸同源性/%GenBank登錄號(hào)白鯰魚Ameiuruscatus9297AY562556斑點(diǎn)叉尾 Ictaluruspunctatus9297AY534328藍(lán)鯰魚Ictalurusfurcatus9196AY562555黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco9095HM363525鯉Cyprinuscarpio8281AB012882長(zhǎng)絲裂腹魚Schizothoraxdolichonema8081KC184122斑馬魚Daniorerio8080AF318503虹鱒Oncorhynchusmykiss7974X75798大西洋鱈魚Gadusmorhua7469AF329903尼羅羅非魚Oreochromisniloticus7164GU246715點(diǎn)帶石斑魚Epinepheluscoioides7067HM190250

3討論

蘭州鲇MyoD基因可編碼由 269個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的可溶酸性蛋白質(zhì)。賈浩等[25]研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)半衰期與其穩(wěn)定性之間存在密切聯(lián)系，一般來(lái)說(shuō)，半衰期長(zhǎng)則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。本研究結(jié)果顯示，MyoD具有較長(zhǎng)的半衰期，但卻屬于不穩(wěn)定蛋白，這一特性與其生理功能的發(fā)揮是否存在某種聯(lián)系值得更進(jìn)一步的研究和探討。蘭州鲇MyoD為螺旋-環(huán)-螺旋二聚體結(jié)構(gòu)(bHLH)，符合該基因家族的保守結(jié)構(gòu)[23]，與前人研究結(jié)果一致，但這種結(jié)構(gòu)是否影響該蛋白的能量代謝、運(yùn)輸和結(jié)合等過(guò)程還有待更深入的研究。

分析11種魚的MyoDcDNA序列對(duì)應(yīng)的核苷酸同源性及氨基酸同源性，發(fā)現(xiàn)蘭州鲇與白鯰、藍(lán)鯰魚及黃顙魚氨基酸同源性均高于核苷酸同源性，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近，其親緣關(guān)系最為密切，因此說(shuō)明蘭州鲇和這3個(gè)同屬于鲇形目魚類的CDS序列存在個(gè)別堿基差異，但所編碼的氨基酸序列基本一致，個(gè)別堿基突變均屬同義突變，體現(xiàn)了密碼子簡(jiǎn)并性的特點(diǎn)，說(shuō)明蘭州鲇的MyoD與鲇形目魚類的一致，兩者之間并不存在生物學(xué)功能上的差異。MyoD基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹與生物進(jìn)化的物種樹基本一致，這一結(jié)果與動(dòng)物分類學(xué)的觀點(diǎn)相一致[26]，也說(shuō)明MyoD基因編碼區(qū)在這些物種間比較保守。

本研究對(duì)蘭州鲇MyoD基因的克隆、序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為揭示蘭州鲇MyoD基因的遺傳變異、表達(dá)與調(diào)控等的研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)信息和理論依據(jù)。后續(xù)研究中將從蘭州鲇MyoD基因的組織特異性表達(dá)、單核苷酸多態(tài)性、QTL定位和生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)等方面開展，為蘭州鲇家系選育提供更充分的數(shù)據(jù)資料。

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(責(zé)任編輯：陳細(xì)華)

Cloning and Bioinformatics Analysis of MyoD Gene in Silurus lanzhouensis

YU Zhao-xi1,2，LIAN Zong-qiang2,3，WU Xu-dong1,2,3,YANG Zhong-li1，

LI li2,3，ZHANG Feng2,3，XIAO Wei2,3，SAI Qing-yun2,3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070,China；2.NingxiaFisheryInstitute，Yinchuan750001,China；3.NingxiaFisheryEngineeringTechnologyResearchCenter，Yinchuan750001,China)

Abstract：In order to explore the gene related to growth trait of Silurus lanzhouensis,MyoD gene of S.lanzhouensis was cloned and analyzed with RT-PCR ,TA cloning and nucleic acid sequencing technology.The 810bp length CDS region(GenBank accession No.:KT277551) and 1 210 bp length whole gene(GenBank accession No.:KT339175) of MyoD was obtained,the 1 210 bp length whole gene included 5′UTR in 63 bp length and 3′UTR in 58 bp length,and ORF included three exons and two introns,the length of three exons was 510 bp,80 bp and 220 bp,and the length of two introns was 156 bp and 123 bp.A total 269 amino acids were encoded by the MyoD gene.Subcellular localization of MyoD was mainly in nucleus (56.5%).The secondary structure of MyoD was a helix loop helix (bHLH).Phylogenetic tree and the Homology of twelve fish based on MyoD gene coding region analysis showed that the encoding of MyoD gene sequences were highly conservative,S.lanzhouensis had a higher homology with Ictalurus punctatus,Ameiurus catus and Ictalurus furcatus.

Key words：Silurus lanzhouensis;MyoD;gene cloning;bioinformatics

中圖分類號(hào)：S917.43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)02-0010-06

作者簡(jiǎn)介：第一俞兆曦(1989-)，男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳與生物技術(shù)。E-mail:yzx1731@163.com通訊作者：吳旭東。E-mail:amy95@126.com

收稿日期：2015-09-06；

修訂日期：2015-11-28

資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360633)；寧夏對(duì)外科技合作項(xiàng)目；寧夏自然科學(xué)基金(NZ14212)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B09)