黃鼬干粉膠囊對再生障礙性貧血模型小鼠造血功能的影響*

姚金華，馬　駿，杜志榮，夏小軍，段　赟，田　瑩，范曉娜，王生梅慶陽市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅慶陽75000；2甘肅中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理學科研三級實驗室；慶陽市西峰區(qū)疾病預防控制中心；甘肅省腫瘤醫(yī)院

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黃鼬干粉膠囊對再生障礙性貧血模型小鼠造血功能的影響*

姚金華1，馬駿2△，杜志榮3，夏小軍4，段赟4，田瑩1，范曉娜1，王生梅1
1慶陽市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅慶陽745000；2甘肅中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理學科研三級實驗室；3慶陽市西峰區(qū)疾病預防控制中心；4甘肅省腫瘤醫(yī)院

［摘要］目的：觀察黃鼬干粉膠囊對再生障礙性貧血（AA）模型小鼠造血功能的影響及作用機制。方法：采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復合方法復制小鼠AA模型，觀察黃鼬干粉膠囊對小鼠外周血象、骨髓有核細胞數(shù)（BMNC）、骨髓粒細胞-巨噬細胞集落生成單位（CFU-GM）、血清中可溶性細胞間黏附因子1（sICAM-1）和骨髓組織病理學的影響。結果：黃鼬干粉膠囊能明顯增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量，能增加骨髓BMNC數(shù)量，還能升高骨髓CFU-GM和降低血清sICAM-1。與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骨髓組織病理學結果表明，黃鼬干粉能明顯改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶減少，促進骨髓造血。結論：黃鼬干粉膠囊能改善AA模型小鼠造血功能，其作用機制可能與調節(jié)骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有關。

［關鍵詞］黃鼬干粉膠囊；再生障礙性貧血；外周血象；骨髓有核細胞數(shù)；骨髓粒細胞-巨噬細胞集落生成單位；血清中可溶性細胞間黏附因子1；組織病理

Influence of Yellow Weasel Dry Powder Capsules on Hemopoiesis of Mice Model with Aplastic Anemia

YAO Jinhua1,MA Jun2△,DU Zhirong3,XIA Xiaojun4,DUAN Yun4,TIAN Ying1,FAN Xiaona1,WANG Shengmei1
1 Qingyang Municipality TCM Hospital,Qingyang 745000,China;2 Three-step Lab for Pharmacology of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China of Gansu University of Traditional Chinese Medicine;3 Xifeng District Center for Disease Control and Prevention of Qingyang Municipality 4 Gansu Provincial Cancer Hospital

Abstract Objective:To observe the influence of yellow weasel dry powder capsules on hemopoiesis of mice model with aplastic anemia (AA) and the mechanism.Methods:Mice model with AA was prepared by X-ray,cy-clophosphamide and chloramghenicol,the influence of yellow weasel dry powder capsules on peripheral blood,bone marrow mononuclear cells (BMNC),colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM),soluble intercellular adhesion molecules-1 (sICAM-1) and the histopathology of bone marrow were observed.Results:Yellow weasel dry powder capsules could increase the numbers of HGB,RBC,WBC and PLT in peripheral blood of the mice obviously,increase the amount of BMNC,raise CFU-GM and decrease sICAM-1.Compared with model control group,the difference showed statistical meaning (P＜0.05).Histopathological results of bone marrow demonstrated that yellow weasel dry powder could notably improve hypofunction of bone marrow hyperplasia and the decrease of hemopoietic focus of AA mice,and promote hemopoiesis of bone marrow.Conclusion:Yellow weasel dry powder capsules could effectively improve hemopoiesis of AA mice model,and its mechanism might be related to regulating the balance of CFU-GM and sICAM-1.

Keywords yellow weasel dry powder capsules;AA;peripheral blood;BMNC;CFU-GM;sICAM-1;histopathology

黃鼬(學名Mustela sibirica)，俗名黃鼠狼，為鼬科小型雜食動物［1］。黃鼬肉骨在我國民間歷來被視為一種藥材，認為具有抗癌、增強免疫力等功效，對急性白血病(AL)、再生障礙性貧血(AA)、免疫性血小板減少癥等疾病也有一定療效。甘肅隴東地區(qū)民間常以黃鼬干粉用于AA及AL化療后骨髓抑制患者，也用以治療骨髓增生低下性疾病，效果滿意。本實驗擬觀察黃鼬干粉膠囊對AA模型小鼠骨髓造血功能的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物昆明小鼠，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g，由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物場提供，實驗生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘) 2010-0001，動物實驗合格證號：0000981。

1.2藥物和試劑黃鼬干粉膠囊(甘肅省慶陽市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號：130706)，臨用前將藥粉用8倍量蒸餾水浸泡2小時，水浴鍋煎煮30分鐘，800rpm離心5分鐘，取上清液，80℃濃縮至30％和90％的濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫凰咎惯虼计?廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，批號：130416)；注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：04120103)；氯霉素注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：130523)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字H13020657)；注射用硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：20130615)；M199培養(yǎng)基(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：130811)；馬血清(鄭州益康生物有限公司生產(chǎn)，批號：130608)；瓊脂粉(青島高科園海博生物技術有限公司生產(chǎn)，批號：20130406)；ELISA(sICAM-1)試劑盒(產(chǎn)品型號E12789，規(guī)格96T，上海華壹生物有限公司生產(chǎn)，批號：20130522)。

1.3實驗儀器醫(yī)用直線加速器(型號BD-6M，北京醫(yī)療器械研究所提供)；低溫高速離心機［Biofuge fresco(美國)］；血細胞分析儀［CD1200(美國)提供］；奧林帕斯生物顯微鏡［Olympus公司(日本)生產(chǎn)］；BS110S型sartorius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)。

1.4實驗方法

1.4.1對AA模型小鼠外周血象、骨髓有核細胞數(shù)（BMNC）和骨髓組織病理學的影響［2-4］

1.4.1.1分組、造模、給藥取小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。除正常對照組外，其余各組采用醫(yī)用直線加速器X射線一次性全身照射(皮源距100 cm，輻射劑量為8.0 Gy/min，輻射時間為4分鐘)，分別于第4天、5天、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg，連續(xù)3天。造模的同時，正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水，陽性對照藥組灌胃司坦唑醇片1 mg/kg(相當于人體臨床日用量的10倍)，黃鼬干粉膠囊高、低劑量組分別灌胃黃鼬干粉膠囊煎液18 g/kg 和6 g/kg(相當于臨床人1日用量的30倍和10 倍)。均為0.02 mL/g，各組每天1次，連續(xù)15天。

1.4.1.2外周血象及BMNC計數(shù)末次給藥后次日，摘眼球取血，用血細胞分析儀測定外周血象變化。隨后各組小鼠脫頸椎處死，分離出兩側股骨。取右側股骨中段7 mm，用3％冰醋酸溶液10 mL沖出全部骨髓，并經(jīng)6號針頭抽吸一次，分散骨髓細胞。然后通過血細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)骨髓有核細胞數(shù)(BMNC)。

1.4.1.3骨髓切片制備與觀察將左側股骨浸入4％中性甲醛內固定2小時，再用2％的硝酸脫鈣2小時，水洗2次，室溫下乙醇梯度脫水各2次，然后用甲液、乙液順序浸透各12小時，用包埋液封閉，放入-20℃冰箱內過夜，第2天進行切片，蘇木素-姬姆薩-伊紅染色，最后置于光學顯微鏡下觀察骨髓增生程度及造血細胞變化。

1.4.2對AA模型小鼠粒-巨噬細胞集落生成單位（CFU-GM）、可溶性黏附因子1(sICAM-1)的影響［5-8］

1.4.2.1小鼠骨髓CFU-GM的檢測小鼠分組、模型制備及給藥同上。培養(yǎng)體系為含20％馬血清的M199培養(yǎng)液3.5 mL，5塊0.3 mm3小鼠肺組織生成的細胞刺激因子，適量青、鏈霉(濃度100 U/mL、100 μg/mL)，分別加入以上各組各時間點小鼠的骨髓單個核細胞(終濃度為2×105)，置于37℃水浴15分鐘，加入瓊脂0.3 mL(終濃度為0.3％)，再放入2.7％的甲基纖維素(終濃度為0.9％)，振蕩混勻后澆入培養(yǎng)皿，移入含5％ CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)7天，用倒置顯微鏡計數(shù)各組生成的細胞集落，≥50個細胞組成的細胞團為1個細胞集落。

1.4.2.2小鼠血清sICAM-1的檢測末次給藥后，小鼠眼眶靜脈竇取血0.5 mL，室溫放置20分鐘，以3 000 r/min離心20分鐘，取血清5 μ L，按試劑盒說明書操作，檢測血清中sICAM-1濃度值。

1.5統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料用(±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠外周血象和BMNC比較模型對照組小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量明顯減少，BMNC數(shù)明顯降低，與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。司坦唑醇片組和黃鼬干粉膠囊高、低劑量組小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量以及BMNC數(shù)量明顯增加，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

正常對照組骨髓增生活躍，全片有核細胞密布，巨核細胞多見。模型對照組骨髓增生極度低下，造血細胞明顯減少，大量脂肪細胞代替造血細胞，間質水腫，巨核細胞未見。黃鼬干粉膠囊高、低劑量組及司坦唑醇片組仍顯示骨髓增生低下，但可見散在造血灶，偶見巨核細胞。見圖1。

表1　各組小鼠外周血象和BMNC比較

圖1　各組小鼠骨髓組織病理學表現(xiàn)（40×）

2.2各組小鼠骨髓CFU-GM、血清SICAM-1比較采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復合方法復制小鼠AA模型，模型對照組小鼠骨髓CFU-GM生成量明顯降低，血清中SICAM-1明顯升高，與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。司坦唑醇片組和黃鼬干粉膠囊高、低劑量組均能提高模型小鼠骨髓CFU-GM生成量，降低小鼠血清中SICAM-1含量，與模型對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2　各組CFU-GM、SICAM-1比較(骨髓細胞數(shù)4×105)

3　討論

AA是一組由化學、物理、生物及自身免疫等因素所致的骨髓造血干細胞和(或)造血微環(huán)境損傷而出現(xiàn)的造血功能衰竭性疾病。其主要的病理改變是紅骨髓向心性萎縮，被脂肪髓代替，無惡性細胞及網(wǎng)狀纖維增生，以致外周血液中全血細胞減少出現(xiàn)貧血、出血、感染等臨床癥狀［9-10］。

AA屬于中醫(yī)“髓勞病”范疇［11］?！侗静菥V目》記載，黃鼬的肉甘、溫，有小毒，入肺、腎二經(jīng)，具有殺蟲療瘡、溫腎縮尿的功效，治疥瘡、瘡潰不愈合、尿頻等癥。甘肅隴東地區(qū)民間AA及AL化療后骨髓抑制的患者大多服用黃鼬干粉［12-13］，但相關實驗研究尚未見報道。

本實驗研究表明，采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復合方法復制小鼠AA模型，黃鼬干粉膠囊能明顯增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量，能增加骨髓BMNC和CFU-GM數(shù)量，降低血清SICAM-1水平。骨髓組織病理學結果表明，黃鼬干粉膠囊能明顯改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶減少，促進骨髓造血。其治療AA的作用機制可能與調節(jié)骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有關。本研究為中醫(yī)臨床使用黃鼬干粉膠囊治療AA和進一步新藥研發(fā)提供了藥理學實驗依據(jù)。

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通訊作者：△馬駿（1966—)，男，碩士研究生導師，教授。研究方向：中藥藥理學與安全性評價。

作者簡介：姚金華（1973—），男，副主任醫(yī)師。研究方向：血液病的中西醫(yī)診治。

*基金項目：甘肅省慶陽市科技計劃項目（編號2011-1003-NKCM013）。

收稿日期：2015-10-30

［中圖分類號］R285.5

［文獻標識碼］A

［文章編號］1004-6852(2016)02-0012-04