KATP開放劑對骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡和向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物的影響

劉曉靜，胡星星，鄧 波，段 鵬，朱慶磊

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KATP開放劑對骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡和向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物的影響

劉曉靜，胡星星，鄧 波，段 鵬，朱慶磊*

（解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853）

研究KATP開放劑對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）凋亡和向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物的影響。培養(yǎng)4周雄性SD大鼠的BM-MSCs，以二氮嗪（Dia）和吡那地爾（Pin）預(yù)處理細胞，H2O2誘導(dǎo)細胞凋亡，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。在KATP開放劑處理2h后提取各組細胞總mRNA，實時定量PCR法檢測心肌特異基因肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、縫隙連接蛋白43（Cx43）以及α重鏈蛋白（α-MHC）的mRNA表達情況。提取細胞蛋白，Western印跡法檢測cTnI、CK、CK-MB蛋白的表達情況。Dia和Pin 50mol/L預(yù)處理可明顯降低BM-MSCs凋亡率（＜0.05）。Dia和Pin處理2h，能使BM-MSCs的cTnI、CK、Cx43 mRNA表達顯著增加（＜0.05）；同時明顯增加CK、CK-MB蛋白表達（＜0.05）。Dia和Pin能增加BM-MSCs向心肌細胞的轉(zhuǎn)化心肌標志物的表達，并具有抗凋亡的作用。

二氮嗪；吡那地爾；骨髓間充質(zhì)干細胞；凋亡

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）是一種具有多向分化潛能的細胞，具有強大的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等，被認為是組織工程/再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的種子細胞和基因治療中理想的靶細胞[1]。但是，當BM-MSCs被植入體內(nèi)時，會受到各種誘導(dǎo)條件及體內(nèi)環(huán)境的限制，使得移植細胞的存活率和轉(zhuǎn)化率均不高[2]。如何優(yōu)化BM-MSCs向心肌細胞的轉(zhuǎn)化率以及如何提高轉(zhuǎn)化的心肌細胞在受損心肌組織內(nèi)的存活率和滯留率，是利用BM-MSCs移植治療心力衰竭研究中亟待解決的關(guān)鍵問題。

二氮嗪（diazoxide，Dia）和吡那地爾（pinacidil，Pin）是ATP敏感性鉀離子通道（ATP sensitive potassium channel，KATP）開放劑中的兩種，可以特異性激活KATP，提高缺氧耐受性，產(chǎn)生細胞保護的作用[3]。有研究表明[4]，Pin能升高人胚胎干細胞的生存率。Dia和Pin能否提高BM-MSCs的存活率以及能否促進BM-MSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化，均未見報道。本文則研究了KATP開放劑對BM-MSCs存活率和向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

低糖?DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶?EDTA（HycLone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），Dia、Pin、二甲基亞砜（Sigma公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR試劑盒（ABI，美國），肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）和β?actin抗體（Cell Signaling，美國）。

1.2 BM-MSCs的分離和培養(yǎng)

取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死，于75%乙醇浸泡10min。移入彎盤，剪開雙后肢皮膚，盡量完整地剪下雙后肢的股骨和脛骨，去除骨頭上附著的肌肉筋膜等，PBS中浸泡。移入超凈工作臺，PBS沖洗2次，浸入低糖?DMEM培養(yǎng)基中。剪去雙側(cè)干骺端暴露骨髓腔，用新鮮完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓至骨頭發(fā)白，收集全部沖洗液于15ml離心管中，2 000轉(zhuǎn)/min，離心5min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中，培養(yǎng)1.5h后，移取皿中培養(yǎng)基入新的培養(yǎng)皿以去除已經(jīng)貼壁的成纖維細胞，并標記為P0代。將P0代細胞置于37℃、5%CO2恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后半量換液，72h全量換液。以后每2～3d換液，每日置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)特征。80%～90%融合時傳代，備用。

1.3 凋亡率測定

實驗分為3組。（1）對照組：加入H2O2終濃度為100μmol/L，孵育4h。（2）Pin組：在對照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為50μmol/L的Pin，孵育2h。（3）Dia組：在對照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為50μmol/L的Dia，孵育2h。

PBS清洗后，用胰酶消化細胞，收集細胞，2 000轉(zhuǎn)/min離心5min倒掉上清液，加入300μL的1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細胞，加入5μL的膜聯(lián)蛋白A5?異硫氰酸熒光素（Annexin Ⅴ-FITC）染液，混勻，避光室溫孵育15min后，加入5μL的碘化丙啶（propidine iodide，PI）染色，作用5min后加入200μL Binding Buffer，混勻，采用流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）進行凋亡測定。

1.4 實時定量PCR測定

參考文獻[5]，以TRIzol（Life，美國）提取各組總RNA，NanoDrop2000測定RNA濃度后，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用SYBR熒光試劑盒（ABI，美國），以1μl cDNA產(chǎn)物為模板，加入20μl反應(yīng)體系，采用ABI-7900 Real time PCR測定儀采集實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，QPCR）中SYBR熒光信號。以36β4基因作為內(nèi)參基因，所有樣本做3個平行復(fù)孔，試驗數(shù)據(jù)以2-△CT表示，引物序列如下。（1）36B4。Forword：5'CAGAGGTGCTGGACATCACAGAG3'。Reverse：5'GGCAACAGTCGGGTAGCCAATC3'。（2）CK。Forword：5'GGCTTCACTCTGGACGATGTCA3'。Reverse：5'GTCTTATGCTTGTCTGTGGGTTTG3'。（3）CK-MB。Forword：5'ATGTGGAATGAGCG-TTTAGGAT3'。Reverse：5'TCTTTGGGAAG- CGGCTATCTT3'。（4）心肌特異性肌鈣蛋白I（cardiac-specific troponin I，cTnI）。Forword：5'ATGACCTGCGTGGCAAGTTTAA3'。Reverse：5'TTCTCAATGTCCTCCTTCTTCACC3'。（5）縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）。Forword：5'ATTCGTGTCTGTGCCCACCCTC3'。Reverse：5'TCCCGTACTTGAACTTCTTGATTT3'。（6）α重鏈蛋白（α-heavy chain protein，α-MHC）。Forword：5'CAGAACACCAGCCTCATCAAC3'。Reverse：5'TTCTCCTCTGCGTTCCTACAC3'。

1.5 Western印跡測定

收集各組細胞，根據(jù)細胞的量加入相應(yīng)量的RIPA細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，重懸混勻后于冰上振蕩15min，再于4℃、15 000g離心20 min后，取上清，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘樱?0μg/孔），10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分離，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）上，然后5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）于搖床上室溫封閉2h。按適當比例用5%BSA稀釋配制一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBS-Tween，TBST）漂洗3次，二抗室溫孵育2h，漂洗3次，化學(xué)熒光辣根過氧化物酶底物（chemiluminescent HRP subsrate，ECL）法發(fā)光，顯影并定影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用檢驗，多組間數(shù)據(jù)資料比較通過方差分析。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KATP開放劑對BM-MSCs凋亡的影響

100mol/L的H2O2與BM-MSCs共孵育24h，可誘導(dǎo)BM-MSCs凋亡，凋亡率為66.9%。預(yù)先加入50mol/L KATP開放劑Pin或者Dia，均可觀察到凋亡率的顯著下降（＜0.05），分別降低至37.7%和21.6%。提示Dia和Pin可以明顯降低BM-MSCs凋亡率（圖1）。

圖1 二氮嗪和吡那地爾對BM-MSCs凋亡率的影響

Figure 1 Effects of diazoxide and pinacidil on the apoptosis rate of BM-MSCs (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide. Compared with control group,*＜0.05

2.2 KATP對心肌標志物mRNA表達的影響

BM-MSCs經(jīng)Pin和Dia預(yù)處理后，心肌標志物cTnI、Cx43、CK以及CK-MB的mRNA相對表達量均有明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05；圖2）。在Pin和Dia的作用下：cTnI mRNA表達分別增加16.8倍和11.5倍；Cx43 mRNA分別增加2.5倍和2.9倍；CK mRNA分別增加16.2倍和15.4倍；CK-MB mRNA分別增加15.0和13.8倍。提示Pin和Dia均可上調(diào)BM-MSCs心肌標志物轉(zhuǎn)錄水平的表達。

2.3 KATP對心肌標志物蛋白表達的影響

以Pin和Dia 50mol/L預(yù)處理BM-MSCs 2h后，BM-MSCs中的CK和CK-MB蛋白表達水平均顯著增加（＜0.05；圖3）。在Pin和Dia的作用下：CK分別增加6.8倍和6.7倍；CK-MB分別增加6.7倍和5.4倍。提示Pin和Dia均可上調(diào)BM-MSCs心肌標志物翻譯水平的表達。

3 討 論

BM-MSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后具有增殖分化為心肌樣細胞的能力，將其移植于缺血的心肌可明顯改善心功能。但是，BM-MSCs的低成活率和低轉(zhuǎn)化率限制了其治療效果和臨床應(yīng)用。缺血預(yù)處理能提高包括心臟在內(nèi)的多種組織器官的功能和耐受力，產(chǎn)生保護作用[6]。其中，KATP起關(guān)鍵作用[7]。KATP開放劑包括比卡林（bimakalim）、Pin、阿普卡林（aprikalim）、Dia等[8]。Dia已經(jīng)被證實具有抗凋亡以及提高細胞生存率的作用[9]。Pin具有舒張血管、保護心臟以及抗低毒的作用。Barbaric等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Pin有提高人胚胎干細胞生存率的作用[11]。在本次實驗中，我們探討了在Pin和Dia干預(yù)下BM-MSCs的凋亡率、及向心肌細胞分化心肌標志物的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Dia以及Pin預(yù)處理的BM-MSCs能顯著降低凋亡率，提高存活率，為BM-MSCs進一步發(fā)揮自身作用提供了可能。Dia可能是通過在凋亡早期促進細胞色素c進入細胞漿以及保持線粒體膜的完整性來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)[12]。同時它還能增加缺氧狀況下肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的分泌，HGF以及bFGF能激活蛋白激酶B磷酸化，進而起到促進核因子κB（NF-κB）家族的作用，提高細胞生存率[13]。Pin可提高凋亡抑制基因Bcl-2的表達，減輕缺血缺氧后的細胞凋亡[14]，且Pin能明顯減輕心肌細胞缺氧復(fù)氧時細胞內(nèi)的鈣超載[15]。這些可能是KATP開放劑抗凋亡保護BM-MSCs的機制。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Dia和Pin預(yù)處理能增加BM-MSCs心肌特異基因CK、CK-MB、cTnI、Cx43轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達。眾所周知，cTnI、肌鈣蛋白T、CK及CK-MB、Cx43等心肌特異性蛋白的表達增加，可作為BM-MSCs向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化的一種表現(xiàn)，且Cx43是心臟組織的一種縫隙連接蛋白，參與維持心臟功能。實驗研究證實其與細胞生存有關(guān)，可以用Cx43的表達水平來表示誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化效率[16,17]。我們的研究表明，Dia和Pin不僅對BM-MSCs有抗凋亡的作用，而且可增加BM-MSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物的表達，提示KATP開放劑誘導(dǎo)了BM-MSCs向心肌細胞的轉(zhuǎn)化。而KATP開放劑是如何誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細胞的分化以及在整體動物水平是否也能促進BM-MSCs向心肌細胞的轉(zhuǎn)化等問題仍需要進一步地研究和探討。

圖2 二氮嗪和吡那地爾對BM-MSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化心肌標志物基因mRNA的影響

Figure 2 Effects of diazoxide and pinacidil on the mRNA level of cardiac biomarkers in trans-differentiation of BM-MSCs into cardiomyocytes (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide; cTnI: cardiac-specific troponin I; CX43: connexin 43; CK: creatine kinase; CK-MB: creatine kinase isoenzyme. Compared with control group,*＜0.05

圖3 二氮嗪和吡那地爾對BM-MSCs CK和CK-MB蛋白表達的影響

Figure 3 Effects of diazoxide and pinacidil on the CK and CK-MB protein expression of BM-MSCs (＝6) BM-MSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; Pin: pinacidil; Dia: diazoxide; CK: creatine kinase; CK-MB: creatine kinase isoenzyme. Compared with control group,*＜0.05

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（編輯: 呂青遠）

Effects of KATPopener on apoptosis and cardiac biomarkers in rat bone marrow mesenchymal stem cells during differentiation into cardiomyocytes

LIU Xiao-Jing, HU Xing-Xing, DENG Bo, DUAN Peng, ZHU Qing-Lei*

(Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

To determine the effect of ATP sensitive potassium channel (KATP) openers on the apoptosis of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and on the cardiac biomarkers in the differentiation of the cells into cardiomyocytes.BM-MSCs Were isolated from 4-week-old male SD rats, and then amplified and preconditioned by KATPopeners, diazoxide (Dia) and pinacidil (Pin). The cell apoptosis was induced by H2O2, and the apoptosis rate was detected by flow cytometry. After the BM-MSCs were treated with 2 KATPopeners respectively for 2h, the total mRNA was extracted for the expression levels of cardiac specific genes, including cardiac-specific troponin I (cTnI), creatine kinase (CK), creatine kinase isoenzyme (CK-MB), connexin 43 (Cx43) and α-heavy chain protein (α-MHC). Western blotting was used to detect the expression of cTnI, CK and CK-MB.Both Dia and Pin of 50mol/L significantly decreased the apoptosis rate of BM-MSCs (＜0.05). After 2h preconditioning, Dia and Pin obviously increased the mRNA levels of cTnI, CK, CK-MB and Cx43 (＜0.05), and enhanced the protein levels of CK and CK-MB (＜0.05).KATPopeners enhance the expression of cardiac biomarkers in the differentiation of BM-MSCs into cardiomyocytes, and also exert anti-apoptotic effect.

diazoxide; pinacidil; bone marrow mesenchymal stem cells; apoptosis

(81070200).

R963

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2016.01.011

2015?09?14;

2015?10?27

國家自然科學(xué)基金面上項目（81070200）

朱慶磊, E-mail: qlzhu@yahoo.com