葡萄脫毒及無毒苗木快速繁育技術(shù)

郭西智，顧紅，陳錦永，張威遠(yuǎn)，張洋，程大偉（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450009）

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葡萄脫毒及無毒苗木快速繁育技術(shù)

郭西智，顧紅，陳錦永，張威遠(yuǎn)，張洋，程大偉
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450009）

摘 要：葡萄病毒病被稱為葡萄的“癌癥”，在我國葡萄生產(chǎn)中普遍存在。目前，我國葡萄苗木繁育多采用枝條直接扦插方式，以農(nóng)戶分散經(jīng)營為主，苗木市場比較混亂，易帶來葡萄病毒積累和重復(fù)感染，對生產(chǎn)的危害日益嚴(yán)重。針對目前無病毒良種苗木繁育體系不健全，良種繁育場生產(chǎn)的良種苗木遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要，而選用無病毒苗木是防控葡萄病毒病發(fā)生的根本途徑。本文詳細(xì)介紹了葡萄無病毒原種的選擇、葡萄病毒病的常用檢測方法、帶毒苗的主要脫除方法、以及無毒苗木的繁育體系及技術(shù)流程。

關(guān)鍵詞：葡萄；病毒??；檢測；脫毒；快繁

葡萄病毒病是世界性病害，凡是有葡萄栽培的地區(qū)都有病毒病存在?，F(xiàn)已知侵染葡萄的病毒種類達(dá)60多種[1]，國內(nèi)已報(bào)道過的葡萄病毒類病害有11 種[2]，其中扇葉病、卷葉病、栓皮病和斑點(diǎn)病等分布廣、危害重[3]。葡萄被病毒浸染后，會造成減少產(chǎn)量、延遲成熟、降低含糖量、影響著色和風(fēng)味，有的甚至使樹勢衰弱、落葉乃至死亡。研究表明，至少有10種病毒與葡萄卷葉病的產(chǎn)生有關(guān)。葡萄感染卷葉病毒后，植株生長衰弱，果穗、果粒變小且大小不均，著色不良，成熟期推遲，減產(chǎn)10%～76%[4]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2014年，我國葡萄栽培面積達(dá)到76.7 萬 hm2，產(chǎn)量達(dá)1240萬 t。葡萄病毒病的發(fā)生和流行對我國葡萄產(chǎn)業(yè)影響巨大，因此應(yīng)引起高度重視。目前，葡萄繁殖方式主要靠扦插和嫁接，往往造成病株長期帶毒并重復(fù)感染，表現(xiàn)為復(fù)合侵染和潛伏侵染的特征[1]。葡萄一旦被病毒侵染，將終生帶毒，持久危害，沒有藥劑可以有效預(yù)防或控制，培育和使用無病毒苗木是防控葡萄病毒病的最根本有效的方法[5]。葡萄無病毒苗木根系發(fā)達(dá)，定植成活率高，長勢旺，主干壯，節(jié)肥水；產(chǎn)量高，品質(zhì)好；抗逆性強(qiáng)，病蟲害少，可減少農(nóng)藥使用次數(shù)和使用量，降低生產(chǎn)成本，減輕環(huán)境污染[6]，經(jīng)濟(jì)效益和社會效益雙豐收。因此，加強(qiáng)病毒檢測和脫毒技術(shù)研究，繁育和栽培無病毒苗木具有重大意義。

1 葡萄無病毒原種選擇

在5～10年生的葡萄園，選擇生長健壯、性狀優(yōu)良、無病毒癥狀的植株作為繁殖材料。首先進(jìn)行病毒檢測，確定不帶病毒后可作為原種登記并保存在防蟲網(wǎng)室中，定期進(jìn)行病毒病癥狀調(diào)查和病毒檢測，無毒材料可用于繁育葡萄無病毒母本樹，然后用于大量繁殖無毒苗木；如未發(fā)現(xiàn)無病毒單株，則必須進(jìn)行脫毒處理。

2 葡萄病毒的脫除

葡萄脫除病毒的方法有多種，如熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒、超低溫脫毒、化學(xué)處理脫毒、體細(xì)胞胚胎發(fā)生脫毒及電療法脫毒等，不同的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1 熱處理脫毒

根據(jù)病毒和葡萄組織細(xì)胞對高溫耐受程度的差異，采用適當(dāng)?shù)臏囟群颓‘?dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間，使葡萄植株體內(nèi)的病毒活性降低甚至失活，而葡萄植株細(xì)胞則快速生長，最終導(dǎo)致葡萄植株生長點(diǎn)附近的細(xì)胞不含病毒，從而達(dá)到脫毒的目的[7]。操作要點(diǎn)是：將待處理的優(yōu)良品種或砧木移植到營養(yǎng)缽中，待長出3～5片葉時(shí)，放入恒溫38 ℃的光照培養(yǎng)箱中處理2～3個(gè)月，然后切取1.5～2.0 cm的嫩梢，嫁接在盆栽無毒砧木上，成活后移植田間正常管理[5]，病毒待檢。該方法設(shè)備簡單、易操作，但存在成活率低、脫毒不完全的缺點(diǎn)。

2.2 莖尖培養(yǎng)脫毒

葡萄植株一旦染病就全身帶毒，但在不同的組織和部位病毒的濃度分布有很大差異，一般生長點(diǎn)附近即莖尖和根尖的分生組織大多不含病毒或含量很低[1]。通過對莖尖的組織培養(yǎng)可達(dá)到葡萄脫毒、優(yōu)良品種快速繁育和工廠化育苗的目的。操作要點(diǎn)：在春季切取待處理的優(yōu)良品種或砧木的嫩芽0.1～0.2 mm，清洗消毒后，接種在輔加1.5～2.0 mg/L BA和20 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上[7]，28 ℃恒溫光照培養(yǎng)，經(jīng)分化增殖后再經(jīng)生根和土壤培養(yǎng)可繁育出無毒植株。莖尖培養(yǎng)成活率較高，但不能達(dá)到百分之百脫毒，脫毒率為94.7%[8]。

2.3 熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫毒

綜合葡萄品種及病毒種類等因素，在優(yōu)良品種快速繁育和工廠化育苗過程中，適宜采用熱處理和莖尖組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)行脫毒，該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是脫毒率高，可達(dá)100%，是比較理想的脫除葡萄病毒的有效途徑，可以實(shí)現(xiàn)兩種方法的脫毒效果互補(bǔ)，這說明該方法適用于葡萄病毒的脫除，有利于無病毒原種母本樹的培育。其缺點(diǎn)是苗木成活率低，僅30.5%[8]。操作要點(diǎn)：將預(yù)先選好的優(yōu)良單株或砧木的盆栽苗放入25～28 ℃下促其抽枝快長，待新梢長出3～5片葉時(shí)，放入光照4000～6000 Lx，相對濕度60%～80%，溫度37～40 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)處理2～3個(gè)月；切取1～2 cm長帶芽嫩梢，10%次氯酸鈉消毒10 min，75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗后在解剖鏡下進(jìn)行莖尖剝離，莖尖剝離大小為2～3 mm；將剝離的莖尖接種到莖尖培養(yǎng)基上，在恒溫28 ℃下光照培養(yǎng)，待芽增大生長后，再轉(zhuǎn)入生莖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，促進(jìn)叢生芽生長，以后再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，促進(jìn)生根[7-8]；經(jīng)練苗、沙培、基質(zhì)土培養(yǎng)成苗，檢測無毒即可移栽至原種圃大量繁殖應(yīng)用。不同功能培養(yǎng)基見表1。

表1　不同功能培養(yǎng)基配方[8]

2.4 超低溫脫毒方法——玻璃化法[9-11]

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超低溫保存處理后再生的植物材料，其含毒量降低，大部分材料完全沒有病毒，因此產(chǎn)生了低溫療法。在超低溫條件下，植物體細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝和生命活動幾乎完全停止，但細(xì)胞活力得以保存，遺傳性狀不會改變。超低溫冰凍基于玻璃化理論。無論是脫除植物病毒還是植物材料保存，玻璃化法簡單、快速、有效，是目前最常用的脫毒方法。

2.4.1 預(yù)培養(yǎng)

將剝?nèi)〉钠咸亚o尖在含0.3～0.4 mol/L蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d。預(yù)培養(yǎng)的目的是使材料脫水、增加含糖量和提高細(xì)胞膜在嚴(yán)重脫水條件下的穩(wěn)定性。

2.4.2 裝載處理

預(yù)培養(yǎng)后的莖尖放入2 mL的冷凍管中，然后用移液器吸入裝載溶液（2 mol/L甘油 + 0.4 mol/L蔗糖），完全浸沒莖尖，室溫下處理20～30 min。

2.4.3 玻璃化溶液處理脫水

為保證超低溫保存后材料能夠成活，脫毒材料必須經(jīng)過玻璃化溶液的處理，常用的玻璃化溶液為PVS2溶液：30%甘油(w/v)+15 % 乙二醇+15 % DMSO(w/v)+0.4 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基，pH為5.8。將冷凍管中的裝載溶液吸出，吸入1～2 mL的玻璃化溶液，5 min后，更換新鮮的玻璃化溶液，在0 ℃下處理30 min左右。

2.4.4 快速冷凍

將裝有玻璃化溶液和莖尖的冷凍管迅速放入液氮中，冷凍1 h以上。

2.4.5 溫水水浴

將冷凍管從液氮中取出，迅速放入40 ℃水浴鍋中水浴2～3 min。

2.4.6 玻璃化卸載

水浴后，將冷凍管中的玻璃化溶液吸出，吸入裝載溶液（MS液體培養(yǎng)基+2 mol/L甘油+1.2 mol/L蔗糖），室溫下處理10～15 min，重復(fù)3次，以清除細(xì)胞內(nèi)的玻璃化溶液。

2.4.7 后培養(yǎng)

將莖尖轉(zhuǎn)到裝有生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1 d，再將莖尖轉(zhuǎn)到新配制的生長培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。即可達(dá)到脫除病毒的目的。

2.5 其它脫毒方法

（1）化學(xué)藥劑處理脫毒。研究發(fā)現(xiàn)，一些化學(xué)藥劑具有延遲或抑制病毒復(fù)制的作用，其原理是影響病毒酶的合成。具體應(yīng)用時(shí)通常是將化學(xué)處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合進(jìn)行病毒的脫除，這種方法取材要求不嚴(yán)，接種莖尖可大于1 mm，易于分化出苗，可提高存活率[12]。

（2）體細(xì)胞胚胎發(fā)生脫毒。在適宜的條件下，通過植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官可產(chǎn)生類似胚胎的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)育成完整的植株。近年來該方法在葡萄病毒的脫除中得到應(yīng)用，已成功脫除了多種韌皮部限制性病毒和線蟲多面體病毒，在葡萄類病毒脫除研究中也表現(xiàn)出較高的脫除效率[1]。

（3）電療法脫毒。電脈沖可以促進(jìn)植株生長，獲得無病毒植株。據(jù)報(bào)道，將3 cm長的葡萄莖段在30 mA的電流下處理15 min，可成功脫除葡萄病毒A[1]。

3 葡萄病毒的檢測

經(jīng)以上脫毒方法處理、培育出的植株，并非百分之百地脫除了病毒，只有一部分不帶病毒，這就需要對所有植株進(jìn)行病毒檢測。目前采用的檢測方法主要有5種：癥狀識別法、電鏡觀察法、指示植物法、血清學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法等。

3.1 癥狀識別法

受病毒侵染的葡萄，大部分表現(xiàn)出一定的癥狀，該癥狀是識別葡萄病毒病的重要依據(jù)，具有很高的診斷價(jià)值，許多葡萄病毒病可以通過癥狀初步確定[5]。如葡萄受卷葉病毒侵染后表現(xiàn)為：病株長勢減弱；夏末秋初，植株下部葉片向下反卷，后逐漸蔓延至整個(gè)植株；紅色品種葉脈間變紅，白色品種葉色變黃；果穗小且果粒著色不良，成熟期延遲；根系發(fā)育不良，易受凍害；枝蔓嫁接成活率顯著降低；生根能力差等。對葡萄生長期進(jìn)行長期系統(tǒng)的觀察可以獲得良好的診斷效果。

3.2 電鏡觀察法

上世紀(jì)50年代，電鏡技術(shù)就廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域[13]，其觀測結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，還可以觀測到病毒引起的寄主細(xì)胞的病變和內(nèi)含體特征，是深度研究病毒病機(jī)理的重要手段之一[14]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，雖然有電鏡檢測新技術(shù)支持，但由于電鏡設(shè)備昂貴，操作技術(shù)水平要求高，因此該法沒有得到廣泛應(yīng)用。

3.3 指示植物法

其原理是通過汁液摩擦接種方式將待檢測病害植株的汁液接種到對一種或幾種病毒病敏感，并能表現(xiàn)出特殊癥狀的指示植物上的檢測方法。運(yùn)用指示植物法鑒定植物病毒病具有鑒定譜廣、無需貴重儀器和設(shè)備、操作技術(shù)簡便、易于掌握、結(jié)果直觀性好等特點(diǎn)，因此在葡萄病毒檢測過程中應(yīng)用最多的方法即為指示植物法，也是最可靠的方法。其缺點(diǎn)就是耗時(shí)較長，時(shí)效性差，易受周圍環(huán)境影響[13]，所以病毒檢測時(shí)應(yīng)注意隔離。葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒、葡萄病毒A和葡萄斑點(diǎn)病毒均可采用指示植物法進(jìn)行檢測[15]。

3.4 血清學(xué)檢測法

血清學(xué)檢測法中常用的是酶聯(lián)免疫法（ELISA），該法是利用抗原抗體體外特異性免疫性反應(yīng)檢測葡萄病毒。血清學(xué)檢測法檢測葡萄病毒病具有快速、直觀、方便及靈敏度高等特點(diǎn)，其結(jié)果的準(zhǔn)確性往往依賴于抗血清的品質(zhì)，且無法檢測類病毒和不穩(wěn)定的病毒[14]。葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒1、葡萄卷葉病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑點(diǎn)病毒均可采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測[15]。

3.5 以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的RT-PCR檢測法

RT-PCR檢測技術(shù)是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種檢測植物RNA病毒的方法，適用于多數(shù)植物病毒的診斷和檢測。其原理是先把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)而進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雜交試驗(yàn)[16]。該法以其操作較簡單，且具有高效、快速、靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，因而具有廣闊的發(fā)展前景，將來有望取代指示植物法檢測葡萄病毒，尤其適用于檢測那些耗時(shí)較長的韌皮部限制性病毒。葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒、葡萄病毒A和葡萄斑點(diǎn)病毒均可采用RTPCR法進(jìn)行檢測[15]。

4 葡萄無毒苗木的繁育

4.1 強(qiáng)化葡萄無毒苗木繁育體系建設(shè)

建立無病毒檢疫檢驗(yàn)制度及規(guī)范的操作規(guī)程。培育無病毒原種，防止苗木帶毒傳播，必須有相應(yīng)的技術(shù)人員做保障。從事葡萄無毒苗木生產(chǎn)必須具備有育苗溫室、用于原種保存的防蟲網(wǎng)室、良種母本園、葡萄良種采穗園、葡萄種苗繁育圃等。

4.2 無毒苗木繁育技術(shù)

4.2.1 無毒試管苗繁育技術(shù)

圖1　葡萄無毒苗木繁育流程

目前，葡萄大規(guī)模工業(yè)化育苗技術(shù)已逐漸成熟和完善，可廣泛應(yīng)用于葡萄無毒苗木的快速繁育。試管苗出瓶前需在陽光下進(jìn)行煉苗，先帶瓶蓋練苗3～4 d，再打開瓶蓋練苗2～3 d，當(dāng)苗葉色深綠、根褐色老熟時(shí)即可出瓶沙培移栽，然后定植于母本園進(jìn)行管理[4]，沙培基質(zhì)配比為河沙:珍珠巖:草炭土=1:1:1。應(yīng)該注意的是無毒苗快速繁育的各個(gè)環(huán)節(jié)必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，以防病毒侵染。

4.2.2 無毒苗木的扦插、嫁接

從母本園或采穗圃采取無毒枝條直接扦插、嫁接，達(dá)到快速繁育的目的。

4.3 快速繁育葡萄無毒苗木的工藝

快速繁育葡萄無毒種木工藝流程見圖1。

4.4 防蟲網(wǎng)室、無毒母本園及無毒苗繁殖圃的建立

防蟲網(wǎng)室應(yīng)建在通風(fēng)透光良好、未見傳毒線蟲、6～8年之內(nèi)沒有栽植過葡萄的地塊，與商品葡萄園和苗圃的距離大于50 m，網(wǎng)室建好后應(yīng)全方位消毒。

葡萄無病毒母本園或采穗園應(yīng)建在水肥良好、未見傳毒線蟲、6年之內(nèi)沒有栽植過葡萄的地塊，與商品葡萄園和苗圃的距離大于50 m，以防止粉蚧等媒介從帶毒葡萄園中傳帶病毒。

葡萄無毒苗繁殖圃建園時(shí)，應(yīng)選擇水肥良好、3年以上未栽植過葡萄的地塊，園址應(yīng)離其它葡萄園20 m以上。

建園前對土壤進(jìn)行消毒。葡萄生長季按規(guī)定進(jìn)行病毒抽檢，發(fā)現(xiàn)病毒植株立即挖除淘汰，并將所有根系清除，同時(shí)對穴坑周圍土壤進(jìn)行消毒。各園區(qū)生產(chǎn)用農(nóng)機(jī)具、修剪工具等專管專用，定期消毒。

4.5 葡萄無病毒苗木的質(zhì)量要求及標(biāo)準(zhǔn)

葡萄無病毒苗木必須品種純正、生長健壯，不帶《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單》（農(nóng)業(yè)部公告第617號，2006年3月）規(guī)定的有害生物。標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2010年頒布實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)（《葡萄無病毒母本樹和苗木》NY/T1843-2010）執(zhí)行。

參考文獻(xiàn)

[1]胡國君,董雅鳳,張尊平,等.葡萄病毒脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào),2013,30(2):304-310.

[2]李大志,周敏,聶松青,等.葡萄病毒病脫毒技術(shù)[J].中國果業(yè)信息,2013(10):78-79.

[3]王國平,劉福昌.蘋果葡萄草莓病毒病與無病毒栽培[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1993:84-85.

[4]王際軒.果樹的病毒病與無病毒苗繁育技術(shù)[J].北方果樹,2006(6):53-55.

[5]魯曉燕,牛建新,馮建榮.葡萄無毒苗木繁育與栽培[J].中外葡萄與葡萄酒,2004(5):32-34.

[6]董雅鳳,劉鳳之,張尊平,等.發(fā)展葡萄無毒化栽培 控制病毒病危害[J].中外葡萄與葡萄酒,2007(3):37-41.

[7]朱世民,鄧建平,黃益鴻.葡萄病毒病與脫毒技術(shù)[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(2):49-50.

[8]曹孜義,李唯,李知行,等.葡萄脫毒及無毒苗試管快繁技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,1991(12):13-14.

[9]陳芳,王子成.植物脫毒新技術(shù)——低溫療法[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(12):11-13

[10]吳昀,張琳,林田,等.超低溫保存植物種植資源的新途徑——小滴玻璃化法[J].植物生理學(xué)報(bào),2012,48(5):511-517

[11]徐剛標(biāo).植物種質(zhì)資源離體保存研究進(jìn)展[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào),2000,20(4):81-86

[12]孫琦,張春慶.植物脫毒與檢測研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,34(2):307-310.

[13]周錦鵬.電子顯微鏡新進(jìn)展及其生物學(xué)研究技術(shù)簡介[J].生物學(xué)通報(bào),1983(3):31-33.

[14]張偉,徐碩,陳德鑫.常用植物病毒檢測技術(shù)比較[J].南方農(nóng)業(yè),2013(12):25-28.

[15]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.葡萄無病毒母本樹和苗木.中國標(biāo)準(zhǔn)書號:NY/T 1843-2010[S].北京:中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2010-05-20.

[16]王新,莫笑晗,林良斌.分子生物學(xué)技術(shù)在植物病毒檢測中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(28):13498-13500.

作者簡介：郭西智，男，助理研究員，主要從事果樹和西瓜甜瓜栽培技術(shù)推廣工作，E-mail:guoxizhi569@163.com

基金項(xiàng)目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程（2013KTDZ02-01）；河南省大宗水果產(chǎn)業(yè)體系資助。

收稿日期：2015-09-23

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.01.007