依托咪酯對HEK-293細(xì)胞中異源表達的hERG鉀通道電流的抑制作用*

韓圣娜，劉　備，孔　嵐，李　靚，馮　馨，張　衛(wèi)，張莉蓉#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001　2)河南省腫瘤醫(yī)院麻醉科 鄭州 450008　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

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依托咪酯對HEK-293細(xì)胞中異源表達的hERG鉀通道電流的抑制作用*

韓圣娜1)，劉備1)，孔嵐2)，李靚1)，馮馨1)，張衛(wèi)3)，張莉蓉1)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 4500012)河南省腫瘤醫(yī)院麻醉科 鄭州 4500083)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞依托咪酯；hERG鉀通道；全細(xì)胞膜片鉗；HEK-293細(xì)胞

摘要目的：觀察依托咪酯對HEK-293細(xì)胞中異源表達的hERG鉀通道電流的抑制作用及其機制。方法：采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法將野生型hERG(WT-hERG)、突變型Y652A-hERG和F656C-hERG分別轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄依托咪酯對轉(zhuǎn)染后HEK-293細(xì)胞表達的hERG鉀通道電流的抑制作用以及對激活曲線和失活曲線的影響。結(jié)果：依托咪酯可濃度依賴性地抑制WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流，其半數(shù)最大抑制濃度為(6.41±2.43) μmol/L，對激活曲線和失活曲線無明顯影響。與WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞相比，依托咪酯對突變體Y652A-hERG及F656C-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞內(nèi)鉀通道電流的抑制作用減弱。結(jié)論：F656C可能是依托咪酯抑制hERG鉀通道的重要靶點。

Inhibition effects of etomidate on hERG K+channel expressed in HEK-293 cells

HANShengna1)，LIUBei1)，KONGLan2)，LILiang1)，F(xiàn)ENGXin1)，ZHANGWei3)，ZHANGLirong1)

1)DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofAnesthesiology，HenanCancerHospital,Zhengzhou4500083)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsetomidate; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cell

AbstractAim: To investigate the molecular mechanisms of etomidate on hERG K+channel expressed in human embryonic kidney(HEK-293) cells.Methods: HEK-293 cells were transfected transiently with different hERG plasmid (WT, mutant Y652A and F656C, respectively) using lipofection. Whole-cell patch clamp technique was used to record the effects of etomidate on hERG K+channel current,and the activation and inactivation curves expressed in HEK-293 cells. Results: Etomidate directly inhibited WT-hERG K+current in a concentration-dependent manner, and half-maximum block concentration was (6.41±2.43)μmol/L. But etomidate did not markedly modify the activation and inactivation curves of WT-hERG K+channel. The inhibition effects of etomidate on mutant Y652A-hERG and F656C-hERG K+channel were attenuated compared with WT-hERG K+channel.Conclusion: F656C may be the key target that etomidate inhibits the hERG K+channel.

長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一種嚴(yán)重的心律失常，在圍手術(shù)期發(fā)生率較高，其表現(xiàn)主要為體表心電圖QT間期延長、ST-T段異常，嚴(yán)重者可引發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes，TdP)等惡性心律失常，甚至引起患者暈厥或猝死[1]。QT間期作為心臟安全性的一個重要指標(biāo)引起越來越多臨床醫(yī)生和藥廠的關(guān)注。臨床上由藥物引起的后天獲得性LQTS(acquired long QT syndrome，aLQTS)更為常見，許多心血管藥物和非心血管藥物都可使QT間期延長[2]。這些藥物主要通過抑制參與心肌動作電位復(fù)極3期的快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，造成細(xì)胞內(nèi)K+外流減少，復(fù)極時間延長，整個動作電位時程(action potential duration，APD)延長。而編碼IKr通道的基因是hERG(human ether-a-go-go-related gene，hERG)。依托咪酯是一種人工合成的咪唑類衍生物，因其粒子小和分布均勻而具有一定的靶向性，可聯(lián)合應(yīng)用多種靜脈類或吸入類麻醉藥。依托咪酯對QT間期影響的報道不一：有研究認(rèn)為依托咪酯不影響QT間期[3]甚至縮短QT 間期[4]，但也有文獻[5]報道依托咪酯可延長QT間期。在這些報道中，依托咪酯一般都和其他藥物同時使用，對機體作用復(fù)雜，很難了解依托咪酯單獨對QT間期的作用。因此，為全面了解依托咪酯對心臟不良反應(yīng)的機制，作者采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察依托咪酯對人胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney，HEK-293)上的hERG鉀通道電流的影響及其機制，為臨床麻醉醫(yī)師圍手術(shù)期合理用藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株與質(zhì)粒HEK-293細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心并由課題組凍存后保存。野生型pcgi-EGFP-WT-hERG質(zhì)粒由南京師范大學(xué)生命科學(xué)院張朝教授饋贈，突變型pcgi-EGFP-Y652A-hERG和pcgi-EGFP-F656C-hERG質(zhì)粒由課題組經(jīng)PCR定點突變技術(shù)而得并保存。

1.2藥品、試劑及相關(guān)溶液電極內(nèi)液：MgCl2·6H2O 1 mmol/L，KCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L；用1 mol/L KOH調(diào)pH值至7.2。細(xì)胞外液：KCl 5.4 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L， MgCl2·6H2O 1 mmol/L；用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.3～7.4。高K+的細(xì)胞外液：KCl 95 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L；用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.3～7.4。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素購自HyClone公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司，2.5 g/L的胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物技有限公司，依托咪酯購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司(溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，使用時用細(xì)胞外液稀釋配成實驗所需濃度)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器IX-71倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；EPC-10膜片鉗放大器(HEKA公司，德國)；Model P-97電極控制儀(Sutter公司，美國)；PCS-5000三維微電極操縱器(Buleigh公司，美國)等。

1.4HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞。選用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法將野生型(WT)和突變型(Y652A和F656C)hERG基因分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36～48 h后取出細(xì)胞做全細(xì)胞膜片鉗記錄。

1.5hERG鉀通道電流的記錄將表達有綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK-293細(xì)胞置于倒置顯微鏡載物臺上，使用的微電極尖端直徑一般0.5～1.0 μm，充以電極內(nèi)液后阻抗達2～3 MΩ。高阻封接形成后進行串聯(lián)電阻和電容電流補償，形成全細(xì)胞記錄模型。當(dāng)細(xì)胞破膜穩(wěn)定后，給予細(xì)胞維持電位-80 mV，去極化電位-40～+70 mV，持續(xù)3 s，復(fù)極電位至-40 mV，持續(xù)2 s，刺激間隔為15 s，采樣頻率0.25 kHz。實驗過程由計算機軟件Pulse 8.67完成刺激信號的產(chǎn)生、反饋信號的采集以及數(shù)據(jù)分析。用電壓鉗模式進行刺激和記錄hERG鉀通道電流。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0進行分析。應(yīng)用配對t檢驗比較加藥前后WT-hERG鉀通道電流的相關(guān)參數(shù)V1/2和k的變化，應(yīng)用兩獨立樣本的t檢驗比較野生型和突變型hERG鉀通道電流抑制率的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1不同濃度依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的抑制作用依托咪酯采用5個濃度(0.001、0.01、0.1、1.0、10和100 μmol/L)，以依托咪酯的對數(shù)濃度(Log μmol/L)為橫坐標(biāo)，加藥前后的相應(yīng)電流比值為縱坐標(biāo)，得藥物抑制WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的量-效關(guān)系曲線(圖1)。用Hill公式計算依托咪酯抑制WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的IC50值。Idrug/Icontrol=1/[1+(D/IC50)n]，其中D為藥物的濃度值，IC50值為藥物抑制hERG鉀電流一半時的藥物濃度(IC50)，n為Hill系數(shù)。經(jīng)Hill公式得出依托咪酯抑制WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的IC50值為(6.41±2.43)μmol/L，Hill系數(shù)為0.37±0.06。

2.2依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的抑制作用見圖2、表1和2。圖2A顯示，加入10 μmol/L依托咪酯4～5 min時電流基本趨于穩(wěn)定，故該實驗均以加藥5 min后作為觀察藥物作用效果的時間點。圖2B顯示的是10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的抑制作用。表1和表2分別顯示了相應(yīng)電壓下依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞的時間依賴性電流和尾電流的I-V曲線的影響。

圖1　依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的量效關(guān)系曲線

A：同一細(xì)胞應(yīng)用10 μmol/L依托咪酯5 min內(nèi)鉀通道電流的變化；B：10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的抑制作用。圖2　10 μmol/L依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的抑制作用

電壓/mV加藥前電流密度(pA/pF)加藥后電流密度(pA/pF)tP-303.70±1.193.47±1.400.2760.791-208.30±2.2316.60±2.120.2760.423-1016.17±3.5811.35±3.190.8380.191024.66±3.9115.89±3.331.4490.0451031.21±3.8019.68±3.322.4400.0022032.52±4.9019.47±3.094.5290.0013029.09±6.5117.45±4.095.1400.0044022.05±7.2214.78±4.244.0550.1615016.08±6.1212.93±4.671.5600.5126010.44±4.757.37±3.960.6840.117706.56±3.894.76±3.361.7770.081

表2　10 μmol/L依托咪酯對轉(zhuǎn)染的

2.3依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流激活曲線和失活曲線的影響以電壓為橫坐標(biāo)，相應(yīng)電壓下的尾電流值與尾電流最大值(一般在+30 mV)的比值為縱坐標(biāo)作圖，數(shù)據(jù)經(jīng)Boltzman方程擬合，即可得到WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線和參數(shù)。Boltzman方程為：I/Imax=1/(1+exp((V1/2-Vm)/k)，式中V1/2為通道達1/2激活時的膜電位，k是當(dāng)Vm=V1/2時的最大斜率因子。在+20 mV、4 000 ms的去極化之后，給予快速去極化脈沖的刺激，記錄-130～+20 mV電位下的電流，經(jīng)過Boltzmann方程擬合即可得出穩(wěn)態(tài)失活曲線和參數(shù)(表3)。

2.4依托咪酯對Y652A-hERG和F656C-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的作用見圖3、4和表4、5。由圖4可知，10 μmol/L的依托咪酯對

WT-hERG和Y652A-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流均有抑制作用，而Y652A的突變削弱了10 μmol/L依托咪酯對hERG電流的抑制作用。由于F656C-hERG鉀通道具有細(xì)胞膜低表達的特點，用正常細(xì)胞外液不易引出外向尾電流，實驗中采用含高鉀的細(xì)胞外液(K+95 mmol/L)，先給予細(xì)胞一個+20 mV的去極化脈沖，隨后將細(xì)胞復(fù)極至-120 mV，引出其內(nèi)向尾電流，圖4顯示了在高鉀細(xì)胞外液下10 μmol/L的依托咪酯分別作用于WT-hERG和F656C-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀通道電流的變化。

表3　依托咪酯對WT-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293

圖3　依托咪酯對Y652A-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀電流的抑制作用

圖4　依托咪酯對F656C-hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞鉀電流的抑制作用

%

表5　依托咪酯對野生型和突變型F656C-hERG

3討論

有文獻[6]報道，麻醉維持期間依托咪酯的血漿藥物濃度為1.23～2.05 μmol/L，鎮(zhèn)靜濃度為0.61～1.23 μmol/L，清醒時0.61～1.02 μmol/L。該實驗結(jié)果顯示依托咪酯能濃度依賴性的抑制hERG鉀通道電流，其IC50值為(6.41±2.43)μmol/L，高于依托咪酯正常使用劑量下的血藥濃度，這說明在正常劑量下使用依托咪酯，是比較安全的，但是當(dāng)依托咪酯使用劑量過大時，其臨床血藥濃度升高會有發(fā)生QT間期延長的潛在危險，這是值得麻醉醫(yī)生提高警惕注意的問題。

隨之，該實驗又探討了依托咪酯能夠抑制hERG鉀通道的分子機制。在hERG鉀通道的6個跨膜區(qū)域(S1-S6)中，S6區(qū)的氨基酸殘基是很多藥物保守結(jié)合位點，其中652位置的酪氨酸(Y652)和656位置的苯丙氨酸(F656)是藥物的主要結(jié)合位點[7]。為了進一步了解依托咪酯抑制WT-hERG鉀通道的機制是否與Y652和F656有關(guān)，作者觀察了依托咪酯對Y652A(第652位酪氨酸突變?yōu)楸彼?和F656C(第656位苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?突變體的阻滯作用。選用的依托咪酯的濃度為10和100 μmol/L(超過依托咪酯抑制WT-hERG鉀通道的IC50的1.5和15.0倍)，觀察高濃度的依托咪酯是否能夠抑制突變后的hERG鉀通道電流，結(jié)果顯示Y652A突變削弱了10 μmol/L依托咪酯阻斷hERG鉀通道的能力(約2倍)，而當(dāng)依托咪酯為100 μmol/L時，其對WT和Y652A抑制的程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。F656C突變后，與野生型相比，依托咪酯(10和100 μmol/L)分別抑制hERG鉀通道電流的程度減弱3.56和3.64倍，相比而言F656可能是依托咪酯阻斷hERG鉀通道的關(guān)鍵結(jié)合位點。

雖然依托咪酯以對心血管影響較小的優(yōu)勢而在臨床應(yīng)用廣泛，但是通過該實驗證實，依托咪酯能夠阻斷hERG鉀通道，在使用濃度較高時仍有發(fā)生QT間期延長的潛在危險。另一方面，圍手術(shù)期發(fā)生LQTS的因素除與麻醉藥物本身有關(guān)外，還受到很多因素的影響。QT間期是反映心肌復(fù)極時程的一個重要指標(biāo)，是一個動態(tài)的生理變數(shù)，受多種因素如年齡、性別、心率、活動狀態(tài)、藥物和電解質(zhì)濃度、患者本身疾病等的影響。手術(shù)本身也是造成QT間期延長的危險因素，如麻醉誘導(dǎo)期喉鏡和氣管插管刺激可使交感神經(jīng)興奮；引起QT間期延長；手術(shù)操作刺激和牽拉也可反射性地引起迷走神經(jīng)興奮，導(dǎo)致心率減慢，使QT間期延長。

綜上所述，患者圍手術(shù)期出現(xiàn)QT間期延長，往往是多種因素相互作用的結(jié)果，提醒麻醉醫(yī)生應(yīng)認(rèn)真分析原因，高度警惕引起QT間期延長的潛在因素，做全面的圍術(shù)期風(fēng)險評估，針對不同體質(zhì)的患者選擇合適的藥物，盡量避免心臟不良反應(yīng)的發(fā)生。

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中圖分類號R322.1；R978.1

#通信作者，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：藥物不良反應(yīng)，E-mail：zhanglirongzzu@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.017

*國家自然科學(xué)基金青年基金項目81200138