短短芽孢桿菌DFG對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

劉紅美，胡 越，李玉權(quán)，陶小買(mǎi)，任建國(guó)

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室，貴州貴陽(yáng)550004）

短短芽孢桿菌DFG對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

劉紅美，胡 越，李玉權(quán)，陶小買(mǎi)，任建國(guó)＊

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室，貴州貴陽(yáng)550004）

為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DFG菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考，采用不同化學(xué)物質(zhì)處理方法結(jié)合瓊脂打孔法研究不同培養(yǎng)基、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)其發(fā)酵液抑菌活性的影響，并在此基礎(chǔ)上研究溫度、蛋白酶、酸堿、紫外線照射和反復(fù)凍融等因素對(duì)其抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：NA培養(yǎng)基培養(yǎng)的DFG菌株其發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)2．4cm；發(fā)酵液經(jīng)100℃處理30min，抑菌率仍達(dá)65%；對(duì)酸堿也具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性；經(jīng)紫外線照射和反復(fù)凍融后性質(zhì)穩(wěn)定；對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感，可用有機(jī)溶劑對(duì)短短芽孢桿菌DFG菌株抑菌物質(zhì)進(jìn)行部分萃取。

短短芽孢桿菌；金黃色葡萄球菌；發(fā)酵液；抑菌物質(zhì)；抑菌特性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬葡萄球菌屬（Staphylococcus），是人類(lèi)的一種重要致病病原菌，臨床上可引起肺炎、骨髓炎和敗血癥等全身性感染，以及毛囊炎、甲溝炎和外科切口、創(chuàng)傷等局部化膿性感染［1］。目前，該菌是醫(yī)院和社區(qū)最常見(jiàn)的感染病原菌之一［2］。金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，因此，食品受其污染的機(jī)會(huì)較多。值得重視的是，隨著臨床上抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，而且出現(xiàn)多重耐藥性，已經(jīng)成為全球醫(yī)院首要的致病菌［3－5］，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌的出現(xiàn)，以多重耐藥、高感染率及高致死率等特點(diǎn)使金黃色葡萄球菌成為名副其實(shí)的超級(jí)細(xì)菌［6－7］。近年來(lái)，篩選對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑制或殺滅作用的拮抗菌、分離抗菌成分、解析結(jié)構(gòu)并探索其作用機(jī)理已成為研究熱點(diǎn)。

短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）屬短短芽胞桿菌屬，能分泌幾丁質(zhì)酶和短桿菌肽［8－10］等多種活性物質(zhì)，其中，短桿菌肽可與細(xì)胞膜發(fā)生作用導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞內(nèi)含物釋放而死亡，其對(duì)很多病原真菌，尤其對(duì)G＋菌有較強(qiáng)的抑制作用［11－12］。短短芽孢桿菌目前在生物防治上已得到廣泛應(yīng)用［13］，但由于短桿菌肽作用專(zhuān)一性小，具有溶血細(xì)胞毒性和肝、腎的細(xì)胞毒性，所以限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)，有關(guān)以短桿菌肽結(jié)構(gòu)合成毒性小或無(wú)毒性類(lèi)似物的研究已取得新進(jìn)展［14］。筆者從貴州省大方縣半夏根際土壤中分離、篩選、鑒定得到短短芽孢桿菌DFG菌株［15］，前期研究發(fā)現(xiàn)，該DFG菌株對(duì)金黃色葡萄球菌以及白色念株菌等臨床致病菌均有抑制作用。為此，筆者在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用及其抑菌特性，以期為該菌株抑菌成分分離鑒定、結(jié)構(gòu)解析和作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，并為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1．1供試材料

1．1．1菌株 短短芽孢桿菌DFG菌株，由貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室分離、鑒定、保存。受試菌為金黃色葡萄球菌，系貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1．1．2試劑 有機(jī)試劑乙醚、異丁醇、乙酸乙酯和氯仿（上海沃凱生物技術(shù)有限公司）。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、脫脂奶粉、酵母提取物、胰蛋白胨、酵母粉、3．7mmol／L KH2PO4、2．9mmol／L K2HPO4、2．0mmol／L MgSO4·7H2O、0．7mmol／L NaCl、0．05mmol／L MnCl2·4H2O、0．036mmol／L FeSO4· 7H2O、0．15mmol／L CaCl2、72%農(nóng)用硫酸鏈霉素及蒸餾水。

1．2試驗(yàn)方法

1．2．1材料預(yù)處理1）培養(yǎng)基制備。牛肉膏液體培養(yǎng)基（0．3%牛肉膏＋1%蛋白胨＋0．5%氯化鈉＋蒸餾水定容至1 000mL，pH 7．4）；NA培養(yǎng)基（1%蛋白胨＋1%牛肉膏＋0．1%氯化鈉＋蒸餾水定容至1 000mL，pH 6．8）；SY培養(yǎng)基［16］（1%脫脂奶粉＋0．1%酵母提取物＋3．7mmol／L KH2PO4＋2．9mmol／L K2HPO4＋2．0mmol／L MgSO4·7H2O＋0．7mmol／L NaCl＋0．05mmol／L MnCl2·4H2O＋0．036mmol／L FeSO4·7H2O＋0．15mmol／L CaCl2＋蒸餾水定容至1 000mL，pH 6．8）；ZS培養(yǎng)基［15］（0．5%牛肉膏＋1%胰蛋白胨＋0．5%酵母粉＋1%氯化鈉＋蒸餾水定容至1 000mL，pH 7．0）；1%脫脂牛奶培養(yǎng)基［16］（1%的脫脂奶粉＋蒸餾水定容至1 000mL，自然pH）。2）受試菌菌液制備。接種活化的金黃色葡萄球菌單菌落于30mL牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37℃200r／min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至1．2×109cfu／mL備用。

1．2．2短短芽孢桿菌DFG菌株的生長(zhǎng)曲線 用接種環(huán)挑取短短芽孢桿菌DFG菌株單菌落接種于30mL牛肉膏液體培養(yǎng)基中，28℃、200r／min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，獲得種子液。取種子液1mL接種于50mL牛肉膏液體培養(yǎng)基，28℃、200r／min恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、28h、32h、36h、48h和72h時(shí)吸取1mL培養(yǎng)液，于紫外分光光度計(jì)600nm處測(cè)定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，作DFG菌株的生長(zhǎng)曲線。通過(guò)菌液生長(zhǎng)情況確定種子液培養(yǎng)時(shí)間。每處理3次重復(fù)。

1．2．3短短芽孢桿菌DFG菌株最適發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即取DFG菌株種子液100μL分別接種于30mL NA培養(yǎng)基（P1）、30mL SY培養(yǎng)基（P2）、30mL ZS培養(yǎng)基（P3）及1%脫脂牛奶培養(yǎng)基（P4），28℃、200r／min恒溫振蕩培養(yǎng)36～48h，分別取發(fā)酵上清液用瓊脂打孔法測(cè)定其抑菌活性，篩選最適DFG分泌抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1．2．4短短芽孢桿菌DFG菌株最佳接種量與發(fā)酵時(shí)間的確定 采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即接種量（A），發(fā)酵時(shí)間（B）。將制備好的種子液分別以1% （A1）、2%（A2）、3%（A3）和4%（A4）的接種量接入50mL最適培養(yǎng)基中，28℃、200r／min恒溫振蕩培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)24h（B1）、36h（B2）、48h（B3）、60h （B4）和72h（B5）的離心上清液檢測(cè)其抑菌活性，根據(jù)抑菌圈性大小確定最佳接種量和發(fā)酵時(shí)間。以0．1mg／mL 72%農(nóng)用硫酸鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照（CK）。

1．2．5短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液的制備 按照步驟1．2．2～1．2．4所得最適條件進(jìn)行DFG菌株培養(yǎng)，12 000r／min離心10min取上清液，并用0．22μm過(guò)濾器過(guò)濾獲得無(wú)菌發(fā)酵液。

1．2．6發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性及最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 將DFG菌株接種于1．2．3篩選出的最適培養(yǎng)基中，按1．2．4篩選的接種量和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)后離心取上清液，經(jīng)0．22μm過(guò)濾器過(guò)濾備用。

1）抑菌活性。采用瓊脂打孔法檢測(cè)發(fā)酵液的抑菌活性，即取金黃色葡萄球菌菌液100μL均勻涂于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用8mm槍頭打孔，然后每孔加入100μL DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液，用濃度為0．1mg／mL的72%農(nóng)用硫酸鏈霉素100μL作陽(yáng)性對(duì)照，用空白發(fā)酵培養(yǎng)基100μL作陰性對(duì)照，封口，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h觀察結(jié)果，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

2）最低抑菌濃度（MIC）。采用液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法［17－20］測(cè)定。即，將無(wú)菌發(fā)酵上清液分別裝入10支試管，再將其逐步稀釋后再按照試菌∶菌液＝3∶1在試管中分別加入金黃色葡萄球菌，至金黃色葡萄球菌菌液終濃度為1．0×106cfu／mL，并設(shè)置未加入發(fā)酵上清液的同濃度受試菌液為空白對(duì)照，搖勻放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12h。用紫外分光光度計(jì)于600nm處測(cè)定初始OD值和發(fā)酵后OD值，制作抑菌曲線，抑菌率達(dá)99%的抑菌濃度為發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。DFG菌株發(fā)酵液濃度用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

式中，A為對(duì)照組OD600，A0為0h數(shù)據(jù)，A2為12h數(shù)據(jù)；B為添加發(fā)酵上清液處理組OD600，B0為0h數(shù)據(jù)，B2為12h數(shù)據(jù)。

1．2．7溫度、pH、蛋白酶、紫外線及反復(fù)凍融等因素對(duì)無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性的影響 參照文獻(xiàn)［21］的方法進(jìn)行測(cè)定。

1）溫度。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理。取4支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵液1mL，然后分別放入50℃（T1）、80℃（T2）和100℃（T3）的水浴鍋中處理30min，121℃（T4）高壓處理30min。

2）蛋白酶。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理。取3支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵液1mL，然后分別加入1mg／mL的胃蛋白酶（D1）、胰蛋白酶（D2）及蛋白酶K（D3）1μL，37℃水浴1h。

3）酸堿。取6支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵液1mL，用1mol／mL鹽酸和1mol／mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH至2、4、6、8、10和12，混勻靜置，反應(yīng)30min后調(diào)回中性。

4）紫外照射。取2支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵上清液1mL，用20W紫外燈距離80cm照射2h。

5）反復(fù)凍融。取2支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵上清液1mL，于－20℃冰箱和室溫反復(fù)凍融10次，每次凍融5min。

6）保存條件。取8支1．5mL離心管分別裝入無(wú)菌發(fā)酵上清液1mL，－20℃和－4℃冰箱各放4支，分別保存5d、10d、30d和50d后取出室溫解凍。

取處理后的無(wú)菌發(fā)酵上清液用瓊脂打孔法測(cè)定抑菌活性，以空白處理的作對(duì)照。將處理與空白處理后上清液抑菌圈直徑作百分比，以觀察溫度、pH、蛋白酶、紫外線及反復(fù)凍融、保存條件等因素對(duì)無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。

1．2．8有機(jī)溶劑萃取物制備及其抑菌活性 參照文獻(xiàn)［22］的方法，分別取6mL無(wú)菌發(fā)酵上清液加入4支50mL試管，標(biāo)記，按照等體積分別加入有機(jī)試劑乙醚、異丁醇、乙酸乙酯、氯仿，混勻振蕩15min，室溫靜置20min后再振蕩15min，4℃冰箱靜置過(guò)夜24h分層，次日分離有機(jī)相和水相，用0．22μm過(guò)濾器過(guò)濾，并測(cè)定分離后有機(jī)相和水相抑菌效果。設(shè)置相應(yīng)有機(jī)試劑即乙醚、異丁醇、乙酸乙酯、氯仿處理為空白對(duì)照。

1．3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析、作圖。

2結(jié)果與分析

2．1短短芽孢桿菌DFG菌株的生長(zhǎng)曲線

從圖1可知，短短芽孢桿菌DFG菌株培養(yǎng)0～4h為延遲期，4～20h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值≤1．15；20h之后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，OD值為1．18～1．26。菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，生長(zhǎng)迅速，生命力強(qiáng)，代謝旺盛，適合做種子液。所以，選擇培養(yǎng)時(shí)間為20h的菌液做種子液。

圖1 短短芽孢桿菌DFG菌株的生長(zhǎng)曲線Fig．1 Growth curve of B．brevis DFG strain in beef extract liquid medium

2．2不同發(fā)酵培養(yǎng)基短短芽孢桿菌DFG菌株的抑菌活性

由圖2可知，P1發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1．97cm；其次是P2和P3，抑菌圈直徑分別為1．48cm和1．33cm，SY強(qiáng)于ZS，二者差異達(dá)顯著水平；P4發(fā)酵液的抑菌活性最低，抑菌圈直徑為1．14cm。P1的抑菌活性與P2和P3達(dá)顯著差異，與P4達(dá)極顯著差異。所以，確定NA培養(yǎng)基為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖2 4種發(fā)酵培養(yǎng)基短短芽孢桿菌DFG菌株的抑菌活性Fig．2 Bacteriostatic activity of Brevibacillus brevis DFG strain in four fermentation media

2．3不同接種量與發(fā)酵時(shí)間短短芽孢桿菌DFG菌株的抑菌活性

由圖3可知，接種量對(duì)DFG菌株發(fā)酵液的抑菌活性有影響，以接種量為2%時(shí)的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)（22±1）mm，接種量＞2%或者＜2%，DFG菌株發(fā)酵液的抑菌效果均下降。不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)DFG菌株發(fā)酵液的抑菌效果也有影響，其中，24h時(shí)最低，之后隨培養(yǎng)時(shí)間增加抑菌活性呈上升趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)36h時(shí)其抑菌活性最高；超過(guò)36h后，發(fā)酵液的抑菌效果呈波動(dòng)變化，但均低于2%接種量發(fā)酵時(shí)間36h時(shí)的抑菌效果。所以，確定接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為36h。

圖3 不同接種量與培養(yǎng)時(shí)間短短芽孢桿菌DFG菌株的抑菌活性Fig．3 Bacteriostatic activity of Brevibacillus brevis DFG strain under different inoculum size and incubation time

2．4DFG菌株發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

從圖4可知，DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，其抑菌圈直徑達(dá)2．4cm，與陽(yáng)性對(duì)照（濃度為0．1mg／mL的72%農(nóng)用硫酸鏈霉素）的抑菌圈大小相同（dCK＝2．4cm）。

通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)得DFG菌株作用最強(qiáng)時(shí)菌液濃度為1．46×107cfu／mL。從圖5可知，不同稀釋濃度無(wú)菌發(fā)酵液中加入金黃色葡萄球菌液培養(yǎng)12h后，隨著稀釋菌液的濃度升高，其抑菌率呈上升趨勢(shì)。其中，當(dāng)DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液濃度達(dá)5．41×105cfu／mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率最高，達(dá)99%，培養(yǎng)液澄清；當(dāng)濃度低于5．41×105cfu／mL時(shí)其抑菌率低，培養(yǎng)液渾濁。所以，確定無(wú)菌發(fā)酵液濃度5．41×105cfu／mL為最低抑菌濃度（MIC）。

圖4 短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig．4 Inhibition effect of B．brevis DFG strain against S．a(chǎn)ureus in sterile fermentation broth

圖5 短短芽孢桿菌DFG菌株的抑菌曲線Fig．5 Bacteriostatic curve of B．brevis DFG strain

2．5溫度、pH、蛋白酶、紫外線及反復(fù)凍融和不同保存條件下短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵上清液的抑菌穩(wěn)定性

2．5．1熱穩(wěn)定性 從圖6可知，經(jīng)過(guò)30min不同溫度熱處理的無(wú)菌發(fā)酵液其抑菌活性存在差異，其活性隨溫度升高而逐漸降低，50～80℃處理抑菌效果達(dá)80%以上。其中，對(duì)照的抑菌活性最強(qiáng)，50℃處理的抑菌活性其次，達(dá)95．5%；80℃處理的抑菌活性有所下降，為87．33%；100℃處理30min后抑菌活性降至65%，而121℃處理完全喪失抑菌活性。表明，DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)在一定溫度范圍具有熱穩(wěn)定性，溫度過(guò)高會(huì)使抑菌活性喪失。所以，DFG菌株發(fā)酵液對(duì)熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖6 不同溫度下短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性Fig．6 Heat stability of B．brevis DFG strain in sterile fermentation broth at different temperature

2．5．2酸堿穩(wěn)定性 從圖7可知，DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵上清液在不同pH條件下其抑菌活性沒(méi)有明顯降低，可見(jiàn)，pH 2～12均有抑菌活性，且在80%以上，其中pH 6～8時(shí)，抑菌率為100%。說(shuō)明，DFG菌株發(fā)酵液對(duì)酸堿具有較強(qiáng)穩(wěn)定性，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下仍有抑菌活性。

圖7 不同pH條件下短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性Fig．7 pH stability of B．brevis DFG strain in sterile fermentation broth under different pH

圖8 短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性Fig．8 Protease stability of B．brevis DFG strain in sterile fermentation broth

2．5．3蛋白酶穩(wěn)定性 從圖8可知，DFG菌株發(fā)酵液對(duì)胃蛋白酶（D1）、胰蛋白酶（D2）和蛋白酶K （D3）不敏感，處理后其抑菌活性均在90%以上，且無(wú)顯著差異。說(shuō)明，DFG菌株發(fā)酵液對(duì)蛋白酶穩(wěn)定。

2．5．4紫外照射與反復(fù)凍融穩(wěn)定性 從圖9可知，DFG菌株發(fā)酵液經(jīng)紫外線照射2h，抑菌活性不受影響，表明DFG菌株發(fā)酵液活性對(duì)紫外線照射穩(wěn)定。無(wú)菌發(fā)酵上清液經(jīng)反復(fù)凍融處理后抑菌圈大小與未處理對(duì)照無(wú)顯著差異，故反復(fù)凍融也不影響其抑菌活性。

圖9 紫外照射與反復(fù)凍融下短短芽孢桿菌DFG菌株無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性Fig．9 Bacteriostatic stability of B．brevis DFG strain in sterile fermentation broth under ultraviolet irradiation and repeating freeze thawing

圖10 不同保存條件下菌株DFG發(fā)酵液的穩(wěn)定性Fig．10 Stability of B．brevis DFG fermentation broth under different preservation condition

2．5．5不同保存條件穩(wěn)定性 由圖10可知，隨著保存時(shí)間增加菌株DFG發(fā)酵上清液抑菌活性隨之降低，－20℃保存后對(duì)其抑菌活性的影響較小，在保存至50d時(shí)其抑菌活性仍達(dá)到74%，－4℃保存其抑菌活性喪失較快，保存50d后抑菌活性為52%，抑菌物質(zhì)可能發(fā)生分解。

2．6有機(jī)溶劑萃取物的抑菌活性

從圖11可知：1）乙酸乙酯萃取。以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液為對(duì)照，有機(jī)相沒(méi)有抑菌作用，水相抑菌效果與對(duì)照相比沒(méi)有差別，乙酸乙酯對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用，表明抑菌物質(zhì)不能被乙酸乙酯萃取。

2）乙醚萃取。有機(jī)相和水相均有抑菌活性，乙醚對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用。表明，抑菌物質(zhì)可以被乙醚部分萃取。

3）異丁醇萃取。水相和有機(jī)相均有抑菌活性，異丁醇本身對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用。表明，短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)能被異丁醇部分萃取。

4）氯仿萃取。有機(jī)相和水相均有抑菌活性，有機(jī)相抑菌圈略大于水相抑菌圈，加入氯仿的孔可見(jiàn)微小抑菌圈，并且菌體生長(zhǎng)緩慢；氯仿本身對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用。表明，短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)能被氯仿部分萃取。

圖11 有機(jī)溶劑對(duì)短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵液的萃取效果Fig．11 Extract effect of organic solvent on fermentation broth of B．brevis DFG strain

3結(jié)論與討論

短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌有較為穩(wěn)定的抑制作用，發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件均有明顯抑菌效果，說(shuō)明其具有抗酸堿性；粗提液經(jīng)過(guò)高溫（100℃）處理仍具有部分抑菌作用，反復(fù)凍融和紫外線對(duì)其抑菌作用均無(wú)明顯影響；通過(guò)不同蛋白酶處理其抑菌物質(zhì)活性不改變，說(shuō)明對(duì)蛋白酶也具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性；在－20℃儲(chǔ)存50d仍具有較高的抑菌活性。

無(wú)菌發(fā)酵上清液用乙醚、乙酸乙酯、異丁醇及氯仿萃取后其水相部分均有抑菌活性。說(shuō)明，DFG菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有水溶性，能透過(guò)0．22μm濾過(guò)膜，且有機(jī)溶劑不能使其失活；部分抑菌物質(zhì)能被乙醚、異丁醇及氯仿萃取，推測(cè)抑菌物質(zhì)可能是小分子物質(zhì)，如小肽類(lèi)。這為下一步分離純化選擇分離條件提供了參考，也為今后深入研究抑菌活性物質(zhì)和開(kāi)發(fā)利用提供奠定了基礎(chǔ)。

該研究初步探討了短短芽孢桿菌DFG菌株發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)其具體抑菌作用物質(zhì)進(jìn)一步分離和純化，并深入研究其作用機(jī)理，以發(fā)掘該菌在醫(yī)藥上的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：王 海）

畜牧·獸醫(yī)·水產(chǎn)

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery

Antibacterial Effect of Brevibacillus brevis DFG Strain Against Staphylococcus aureus

LIU Hongmei，HU Yue，LI Yuquan，TAO Xiaomai，REN Jianguo＊
（Teaching and Research Section of Biotechnology，Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou550025，China）

The effect of different medium，inoculum size and fermentation time on the bacteriostatic activity of B．brevis DFG strain fermentation broth was studied by different chemical treatment and agar punch method and the effect of temperature，protease，pH value，ultraviolet irradiation and repeating freeze thawing on the bacteriostatic stability of B．brevis DFG strain fermentation broth to provide a reference for development and application of B．brevis DFG strain．Results：The fermentation broth of DFG strain cultured in NA medium has the maximum inhibition effect against S．a(chǎn)ureus and its bacteriostatic diameter reaches 2．4cm．The bacteriostatic rate of the fermentation broth treated for 30min at 100℃still is up to 65%．The fermentation broth is of strong stability under different pH value．The quality of the fermentation broth after ultraviolet irradiation and repeating freeze thawing is stability．The bacteriostatic substance of B．brevis DFG strain can be partially extracted with organic solvents because B．brevis DFG strain is no sensitive to pepsin，trypsin and protease K．

Brevibacillus brevis；Staphylococcus aureus；fermentation broth；antimicrobial active substance；antibacterial characteristics

S182

A

1001－3601（2016）11－0472－0098－06

2016－04－18；2016－10－13修回

貴州省中藥現(xiàn)代化項(xiàng)目“貴州半夏塊莖腐爛病防治體系關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用示范”［黔科合成字（2013）5014］；貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目“防治半夏塊莖腐爛病微生物有機(jī)肥研制與效應(yīng)”［黔科合LH字（2014）7094］

劉紅美（1975－），女，副教授，從事藥用植物生物技術(shù)及病害防治研究。E－mail：hmliu＠gmc．edu．cn

＊通訊作者：任建國(guó)（1973－），男，副教授，從事應(yīng)用微生物研究。E－mail：jianguoren2002＠126．com