Dickkopf1在骨關(guān)節(jié)炎中作用的初步研究

李強(qiáng)，張志強(qiáng)，尚雁峰（天津市寧河縣醫(yī)院骨一科，天津301500）

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Dickkopf1在骨關(guān)節(jié)炎中作用的初步研究

李強(qiáng)，張志強(qiáng)，尚雁峰
（天津市寧河縣醫(yī)院骨一科，天津301500）

摘要：目的探討Dickkopf1（DKK1）在骨關(guān)節(jié)炎形成中的作用及臨床意義。方法選取80例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者作為OA組；從無骨關(guān)節(jié)炎病史的人群中選取80例正常人作為正常對照組。按照要求將骨關(guān)節(jié)炎（OA）組與正常對照組取樣后分別用酶聯(lián)免疫吸附法測定其血清中DKK1的水平。構(gòu)建兔膝關(guān)節(jié)炎模型，分為空白對照組、模型組和DKK1組。觀察1個月后3組的病理學(xué)表現(xiàn)并進(jìn)行對比，并進(jìn)行Mankin評分，評估DKK1干預(yù)后的效果。結(jié)果OA組血清中DKK1的水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.001）；兔膝關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功，同時，空白對照組Mankin評分為（1.08±0.35）分，模型組為（12.56±0.51）分，而DKK1組為（7.89±0.82）分。DKK1組的Mankin評分比模型組更低，但高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，P=0.001）。結(jié)論DKK1作為Wnt信號通路的抑制因子可以抑制成骨細(xì)胞分化，起到抑制OA病程的作用，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的關(guān)節(jié)疾患之一。系由于增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷等諸多因素引起的關(guān)節(jié)軟骨及滑膜退變以及骨質(zhì)增生為特征的退行性疾病，膝關(guān)節(jié)是臨床上OA累及常見的部位之一[1]。關(guān)節(jié)炎病因非常復(fù)雜，主要與炎癥、感染、自身免疫、退行性病變等因素有關(guān)[2]，具體發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。

DKKs是一組含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，至少有4種形式（DKK1、2、3、4）。Wnt信號通路異常是參與新骨形成的最主要的機(jī)制。1998年首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Dickkopf1，編碼為DKK1。眾多研究表明[3]，Wnt/β-catenin信號通路在成骨細(xì)胞分化過程當(dāng)中扮演非常重要的角色。它主要是在軟骨細(xì)胞的損傷過程中起到非常重要的修復(fù)作用，從而有效的減緩了OA的發(fā)生、發(fā)展。DKK1是Wnt信號通路的主要抑制劑，有研究報道，DKK1可能參與到OA的發(fā)生發(fā)展中，但其具體機(jī)制尚不明確[4]。因此本研究試圖通過構(gòu)建兔膝OA模型以及檢測人體血清中DKK1的水平，從臨床標(biāo)本和動物實驗兩個不同層次的研究明確DKK1是否參與了OA的發(fā)生、發(fā)展，為完善OA的發(fā)病機(jī)制提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料

選擇天津市寧河縣醫(yī)院2014年5月-2015年3月間就診并確診為膝關(guān)節(jié)OA患者80例為OA組。其中，男性37例，女性43例；年齡為47～84歲，體重指數(shù)17.2～30.3 kg/m2。OA組患者選取標(biāo)準(zhǔn)：反復(fù)膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、蹲起困難而造成生活難以自理1個月以上，膝關(guān)節(jié)活動時有骨擦音、骨擦感。膝關(guān)節(jié)X線顯示退行性改變：非對稱性關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化和（或）囊性變，關(guān)節(jié)緣骨贅形成[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除近3個月內(nèi)有嚴(yán)重感染病史或近6個月內(nèi)有過機(jī)會感染；②妊娠及哺乳期婦女；③伴發(fā)有其他風(fēng)濕性疾病如脊柱關(guān)節(jié)炎、彌漫性特發(fā)性骨質(zhì)增生癥及代謝性骨病如骨質(zhì)疏松癥患者等；④嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者。選入OA組的患者均為手術(shù)后病灶組織經(jīng)HE染色病理學(xué)確診。同時選取本院的健康體檢者（年齡、性別比例、體重指數(shù)相當(dāng)）80例為正常對照組：男性35例，女性45例；年齡為48～83歲，體重指數(shù)17.4～30.4 kg/m2。一般資料比較見表1。兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2人血清DKK1檢測方法

抽取OA組與正常對照組研究對象的靜脈血，真空離心處理（2 000 r/min，10 min）提取血清。將提取的血清存放于-80℃低溫環(huán)境下保存。按生產(chǎn)廠商的使用說明，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，測定血清DKK1水平。比較OA組與正常對照組人群血清中DKK1含量的差異。

表1　兩組患者一般資料比較

1.3兔膝OA模型的構(gòu)建

本研究中兔膝OA模型的構(gòu)建采用改良Hulth 法[5]。選用新西蘭白兔常規(guī)全身麻醉、消毒、鋪單后，暴露膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，并行長約3 cm縱行切口，顯露兔膝關(guān)節(jié)腔，然后用尖刀切斷前后交叉韌帶以及內(nèi)側(cè)副韌帶，并切除內(nèi)側(cè)半月板的前1/3部分，保留關(guān)節(jié)軟骨面（輔助檢查抽屜試驗陽性）。飼養(yǎng)1個月后取兔關(guān)節(jié)軟骨組織。

1.4兔膝OA模型分組與處理

使用DKK1干預(yù)兔膝OA的研究，總共分為3組：空白對照組、模型組和DKK1組。其中，空白對照組的新西蘭白兔不做任何處理只于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水，模型組用改良Hulth法構(gòu)建兔膝OA模型，并于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水，DKK1組在構(gòu)建膝OA的基礎(chǔ)上，于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射DKK1（150 ng/ml）[6]。從顯微鏡下根據(jù)Mankin評分體系評估兔膝軟骨細(xì)胞的病理形態(tài)。

1.5組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

按照Mankin評分體系[7]，對各組兔膝軟骨組織的病理形態(tài)進(jìn)行評分。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)進(jìn)行描述，組間比較用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1OA組與正常對照組血清DKK1水平比較

OA組DKK1濃度為（4 356±1 275）pg/ml；正常對照組DKK1濃度為（5 421±1 085）pg/ml，正常對照組的DKK1濃度顯著高于OA組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2和圖1。

2.2兔膝OA模型的成功構(gòu)建

如圖2所示空白對照組（A）：軟骨細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間排列整齊，HE染色非常均勻；模型組（B）示：軟骨細(xì)胞非常少，且排列明顯紊亂，HE染色弱，基質(zhì)失染現(xiàn)象明顯；DKK1組（C）示：軟骨細(xì)胞較多，排列較為整齊，HE染色尚可?？梢奃KK1組相對于空白對照組的正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有一定程度的退變，但較模型組有較明顯的好轉(zhuǎn)。

2.3Mankin評分結(jié)果比較

HE染色Mankin評分結(jié)果：空白對照組（1.08± 0.35）分。模型組（12.56±0.51）分，而DKK1組（7.89 ±0.82）分，相比較而言，DKK1組評分高于空白對照組，但明顯低于模型組評分。3組評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3和圖3。

表2　兩組人體血清DKK1濃度比較（±s）

表2　兩組人體血清DKK1濃度比較（±s）

組別例數(shù)　DKK-1/（pg/ml）　P值OA組　80　4 356±1 275　0.001正常對照組　80　5 421±1 085

圖1　兩組人體血清DKK1濃度比較

圖2　兔關(guān)節(jié)軟骨HE染色

表3　3組Mankin評分結(jié)果（±s）

表3　3組Mankin評分結(jié)果（±s）

注：1）空白對照組與模型組比較，P=0.001；2）空白對照組與DKK1組比較，P=0.003

組別例數(shù)　　評分（分）空白對照組　15　1.08±0.35模型組　15　12.56±0.511）DKK1組　15　7.89±0.822）

圖3　3組Mankin評分結(jié)果

3　討論

OA是一種慢性進(jìn)行性退行性病變[8]，顯著影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的喪失[9]。但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)明確骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，使得對骨關(guān)節(jié)炎的治療常是無的放矢、事倍功半。眾多研究表明：aggrecanases、MMPs等蛋白酶[10-12]以及蛋白多糖的降解在骨關(guān)節(jié)炎形成過程中發(fā)揮重要的作用。但是，針對這些蛋白酶及蛋白多糖的生物治療方法來治療骨關(guān)節(jié)炎的效果不盡人意。然而近來對軟骨細(xì)胞中這些蛋白酶的上游信號通路Wnt信號通路的研究逐漸成為新的熱點[13-14]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的各個功能，諸如生長、分化和死亡，其產(chǎn)生的糖蛋白對于細(xì)胞生長和存活的調(diào)控極為關(guān)鍵[15]。在Wnt/β-catenin信號通路中，DKK1激活使β-catenin聚集并轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，激活相應(yīng)靶基因，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖活化[16]。OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)研究表明Wnt信號通路下調(diào)與關(guān)節(jié)疾病有一定的相關(guān)性。DKK是Wnt信號通路的主要抑制劑[17]。DKK1是DKK家族4大成員之一，是一種分泌性糖蛋白，也是Wnt信號通路傳導(dǎo)的關(guān)鍵拮抗因子之一，DKK1在關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等疾病中都存在著異常表達(dá)[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，通過酶聯(lián)免疫吸附法比較OA組與空白對照組血清中DKK1的濃度，發(fā)現(xiàn)OA組人體血清中DKK1的濃度顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清中DKK1水平越低，就越可能獲得骨關(guān)節(jié)炎癥。正常人血清的DKK1含量高于有骨關(guān)節(jié)炎癥人群，提示DKK1有預(yù)防或者緩解骨關(guān)節(jié)炎癥的作用。為了證實這一結(jié)論，本研究通過成功構(gòu)建膝關(guān)節(jié)炎的兔動物模型，通過空白對照組、模型組、DKK1組3組結(jié)果互相比較，發(fā)現(xiàn)DKK1組兔膝軟組織Mankin評分顯著低于模型組，但高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明DKK1的干預(yù)使兔子的軟骨細(xì)胞得到部分修復(fù)、凋亡及壞死減少，骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程到控制，表明其對骨關(guān)節(jié)炎有積極的緩解作用。這可能是DKK1通過作用于LRP5/6抑制Wnt/β-catenin信號通路，參與關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生。DKK1作為Wnt通路的主要抑制蛋白，在骨代謝進(jìn)程中起著抑制骨形成和促進(jìn)骨破壞的作用，已被眾多研究證實為骨代謝平衡的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白之一。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[17，20]。

綜上所述，DKK1作為Wnt信號通路的抑制因子可以抑制成骨細(xì)胞分化，從而起到抑制OA進(jìn)展的作用。本研究為表明DKK1在抑制OA進(jìn)程中的作用，提供了一定的參考依據(jù)。但這一結(jié)論還需要嚴(yán)謹(jǐn)完整、擴(kuò)大樣本量的研究來進(jìn)一步驗證本實驗結(jié)果。其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會.骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）[J].中國矯形外科雜志,2014,22(3):287-288.

[2] Pereira D,Ramos E,Branco J.Osteoarthritis[J].Acta Medica Portuguesa,2014,28(1):99-106.

[3] Chen M,Qiao H,Su Z,et al.Emerging therapeutic targets for osteoporosis treatment[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets,2014,18(7):817-831.

[4] Guanabens N,Gifre L,Peris P.The role of Wnt signaling and sclerostin in the pathogenesis of glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Current Osteoporosis Reports,2014,12(1):90-97.

[5]熊元,趙振國,李傳郡,等.兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的制備及鑒定[J].實驗動物科學(xué),2013,30(3):31-34.

[6]李書琴,楊珊,任嬡姝,等.張應(yīng)力刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質(zhì)細(xì)胞Runx2表達(dá)調(diào)控的體外研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,1:35-39.

[7] Van Der Sluijs JA,Geesink RG,Van Der Linden AJ,et al.The reliability of the Mankin score for osteoarthritis[J].Journal of Orthopaedic Research:Official Publication of the Orthopaedic Research Society,1992,10(1):58-61.

[8] Howell R,Kumar N S,Patel N,et al.Degenerative meniscus:pathogenesis,diagnosis,and treatment options[J].World Journal of Orthopedics,2014,5(5):597-602.

[9] Hunter DJ.Viscosupplementation for osteoarthritis of the knee[J].The New England Journal of Medicine,2015,372 (11):1040-1047.

[10] Zhang D,Huang B,Xiong C,et al.Pinocembrin inhibits matrix metalloproteinase expression in chondrocytes[J].IUBMB Life,2015,67(1):36-41.

[11] El-Bakali J,Gras-Masse H,Maingot L,et al.Inhibition of aggrecanases as a therapeutic strategy in osteoarthritis[J].Future Medicinal Chemistry,2014,6(12):1399-1412.

[12] Mladenovic Z,Saurel AS,Berenbaum F,et al.Potential role of hyaluronic acid on bone in osteoarthritis:matrix metalloproteinases,aggrecanases,and RANKL expression are partially prevented by hyaluronic acid in interleukin 1-stimulated osteoblasts[J].The Journal of Rheumatology,2014,41(5):945-954.

[13] Weng X,Lin P,Liu F,et al.Achyranthes bidentata polysaccharides activate the Wnt/beta-catenin signaling pathway to promote chondrocyte proliferation[J].International Journal of Molecular Medicine,2014,34(4):1045-1050.

[14] Li J,Zhou XD,Yang KH,et al.Hinokitiol reduces matrix metalloproteinase expression by inhibiting Wnt/beta-Catenin signaling in vitro and in vivo[J].International Immuno-pharmacology,2014,23(1):85-91.

[15] Peng X,Yang L,Chang H,et al.Wnt/beta-catenin signaling regulates the proliferation and differentiation of mesenchymal progenitor cells through the p53 pathway[J].PloS One,2014,9(5):e97283.

[16] Sassi N,Laadhar L,Allouche M,et al.WNT signaling and chondrocytes:from cell fate determination to osteoarthritis physiopathology[J].Journal of Receptor and Signal Transduction Research,2014,34(2):73-80.

[17] Funck-Brentano T,Bouaziz W,Marty C,et al.Dkk-1-mediated inhibition of Wnt signaling in bone ameliorates osteoarthritis in mice[J].Arthritis & Rheumatology (Hoboken,NJ),2014,66(11):3028-3039.

[18] Lin CH,Ji T,Chen CF,et al.Wnt signaling in osteosarcoma[J].Advances in Experimental Medicine and Biology,2014,804:33-45.

[19] Daoussis D,Andonopoulos AP.The emerging role of Dickkopf-1 in bone biology:is it the main switch controlling bone and joint remodeling[J].Seminars in Arthritis and Rheumatism,2011,41(2):170-177.

[20] Oh H,Chun CH,Chun JS.Dkk-1 expression in chondrocytes inhibits experimental osteoarthritic cartilage destruction in mice[J].Arthritis and Rheumatism,2012,64(8):2568-2578.

（張蕾編輯）

臨床論著

Role of Dickkopf1 in osteoarthritis

Qiang Li,Zhi-qiang Zhang,Yan-feng Shang
（The First Department of Orthopedics,Ninghe Hospital of Tianjin,Tianjin 301500,China)

Abstract:Objective To study the effect and clinical significance of DKK1 on osteoarthritis (OA).Methods In this study,80 OA cases were selected as OA group,80 patients without history of OA as normal control group.The serum level of DKK1 was measured by sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in both groups.The rabbit model of knee osteoarthritis was built.The pathological characteristics of control,model and DKK1 groups were contrasted and the Manikin score was assessed as well.The therapeutic effect of DKK1 was evaluated.Results The serum level of DKK1 in the OA group was significantly lower than that in the control group (P = 0.001).The rabbit model of knee osteoarthritis was built successfully.The Manikin score in the DKK1 group (7.89±0.82) was significantly lower than that in the model group[(12.56±0.51),P = 0.003],but was significantly higher than that in the control group[(1.08±0.35),P = 0.001].Conclusions As the Wnt signaling pathway inhibitor,DKK1 can inhibit osteoblast differentiation,restrain the course of OA; but its mechanism in the human body still needs further research.

Keywords:osteoarthritis; DKK1; Wnt pathway

收稿日期：2015-10-21

文章編號：1005-8982（2016）06-0019-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.005

中圖分類號：R684.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

關(guān)鍵字：骨關(guān)節(jié)炎；DKK1；Wnt信號通路