漆酶降解煙梗木質(zhì)素的條件優(yōu)化

李 曉，顧小燕，丁美宙，王海濱，周利軍

（1．鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450000；2．河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州450000）

漆酶降解煙梗木質(zhì)素的條件優(yōu)化

李 曉1，顧小燕1，丁美宙2，王海濱2，周利軍1

（1．鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450000；2．河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州450000）

為提高梗絲的吸味品質(zhì)、將梗絲木質(zhì)素降解成小分子化合物，采用單因素試驗(yàn)和多因素試驗(yàn)相結(jié)合的方法研究酶解溫度、酶解時(shí)間和漆酶用量對梗絲木質(zhì)素降解效率的影響及酶解最適條件優(yōu)化。結(jié)果表明：1）梗絲木質(zhì)素的降解率隨酶解溫度的升高呈先升后降趨勢，在62℃時(shí)降解率較高，為48．16%，與其他溫度處理差異顯著；2）隨酶解時(shí)間的增長梗絲木質(zhì)素的降解率呈上升趨勢，在7h、8h和9h時(shí)降解率較高，三者均超過60%，與其他處理差異顯著；3）隨漆酶用量的增加梗絲木質(zhì)素的降解率逐漸增大，在用量為0．55μL／g和0．65μL／g時(shí)降解率較高，分別為41．76%和46．80%，顯著高于其他處理，但二者之間無顯著差異。4）在酶解條件分別為62℃、8h、0．55μL／g時(shí)，漆酶降解梗絲木質(zhì)素的降解效果最好，降解率為66．52%。

梗絲；木質(zhì)素；漆酶；降解率

煙梗是煙葉的重要組成部分，約占煙葉總重的25%［1］。由煙梗制成的梗絲具有較強(qiáng)的支撐作用，不僅能提高梗絲的填充能力，還能增加燃吸時(shí)空氣的透過量、提高煙支的燃燒性［2］，但梗絲在吸食過程中往往使人感到雜氣和木質(zhì)氣重、灼喉等不適，其所含木質(zhì)素被認(rèn)為是造成該感官缺陷的主要原因［3－8］。纖維素是梗絲中木質(zhì)素含量較低且對梗絲形態(tài)完整性具有重要維持作用的組成部分［9］。因此，對梗絲木質(zhì)素進(jìn)行降解，既不會(huì)破壞梗絲的高填充性，還能大幅度提高其感官品質(zhì)。

對木質(zhì)素的降解，有理化方法、生物方法等多種途徑。關(guān)于生物方法降解木質(zhì)素，國內(nèi)外已有大量的研究報(bào)道［10－17］，與理化方法相比，生物方法具有使用方便、污染小，使用后不需特殊處理工藝等生態(tài)優(yōu)勢［1822］。但在煙草行業(yè)關(guān)于采用生物方法降解梗絲木質(zhì)素的研究很少。為此，筆者采用生物酶對梗絲木質(zhì)素進(jìn)行降解，重點(diǎn)研究酶解溫度、酶解時(shí)間和漆酶用量對梗絲木質(zhì)素降解效率的影響，并擬通過多因素試驗(yàn)確定梗絲木質(zhì)素酶解的最適條件，以提高梗絲感官質(zhì)量為重點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，以期為解決煙梗原料使用率低，梗絲難以在中高檔卷煙中有效利用及增大梗絲在卷煙配方中的使用比例，降低生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1．1供試材料

1）原料。煙草梗絲，貴州地區(qū)生產(chǎn)；漆酶，諾維信公司生產(chǎn)。

2）儀器與設(shè)備。索氏提取器，冷凝回流裝置，金壇市新航儀器廠生產(chǎn)；DHG－9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，落地恒溫振蕩器，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；PL203型電子天平（感量0．001g），梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

1．2單因素降解試驗(yàn)

試驗(yàn)選取酶解溫度、酶解時(shí)間和漆酶用量3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其中：1）酶解溫度分別為60℃、61℃、62℃、63℃和64℃，酶解時(shí)間為3h，漆酶添加量為0．45μL／g。2）酶解時(shí)間分別為1h、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h和9h，漆酶添加量為0．45μL／g，溫度為60℃。3）漆酶添加量分別為0．25μL／g、0．35μL／g、0．45μL／g、0．55μL／g和0．65μL／g，酶解溫度為60℃，時(shí)間為3h。

1．3降解條件的優(yōu)化

以木質(zhì)素降解率為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取2個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行多因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，最終確定漆酶降解梗絲木質(zhì)素的最佳工藝條件。

1．4數(shù)據(jù)處理

梗絲木質(zhì)素的含量用Klason法測定。試驗(yàn)前測定原梗絲木質(zhì)素的含量，酶解試驗(yàn)完成后測定剩余量，最后計(jì)算梗絲木質(zhì)素的降解率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。

2結(jié)果與分析

2．1不同降解因素?zé)煵莨＝z木質(zhì)素的降解率

不同降解條件下漆酶對梗絲木質(zhì)素的降解率結(jié)果見圖1。

圖1 不同降解因素（溫度、時(shí)間和添加量）漆酶對煙草梗絲木質(zhì)素的降解率Fig．1 Degradation rate of laccase on lignin in the tobacco cut at different temperatures

2．1．1溫度 酶的催化作用受溫度的影響很大，不同溫度條件下漆酶的活性有所不同，對梗絲木質(zhì)素的降解效果也不同。60～62℃時(shí)，隨溫度的升高，梗絲木質(zhì)素的降解率逐漸增大，在61℃和62℃時(shí)降解率較高，分別為43．88%和48．16%；超過62℃時(shí)，隨溫度的升高，酶的活性降低，降解率逐漸下降；在64℃時(shí)降解率最低，僅為29．82%。方差分析表明：溫度為61℃和62℃的處理，梗絲木質(zhì)素的降解率較高，二者與其他處理間的差異達(dá)極顯著水平（P＜0．01），但61℃和62℃處理間差異顯著（P＜0．05），故選取該2個(gè)水平進(jìn)行多因素試驗(yàn)。

2．1．2酶解時(shí)間 隨時(shí)間延長梗絲木質(zhì)素的降解率明顯增加，在7h時(shí)達(dá)較高水平，為62．41%；超過7h，梗絲木質(zhì)素的降解率增加減緩。方差分析表明，酶解時(shí)間7h、8h和9h的降解率相差不大，分別為62．41%、63．45%和64．03%，其中，處理9h、8h與7h之間的差異顯著（P＜0．05），但未達(dá)極顯著水平，三者與其他處理間的差異達(dá)極顯著水平（P＜0．01）。酶解時(shí)間延長直接影響生產(chǎn)產(chǎn)量，綜合試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和實(shí)際生產(chǎn)情況等因素，選取酶解時(shí)間為7h和8h進(jìn)行多因素試驗(yàn)。

2．1．3漆酶用量 在漆酶添加量為0．25～0．45μL／g時(shí)，隨著漆酶用量的增加，梗絲木質(zhì)素的降解率呈上升趨勢；當(dāng)漆酶用量高于0．55μL／g后降解率趨于平緩。因此，加酶量繼續(xù)增加，梗絲木質(zhì)素的降解率不再明顯增加。方差分析表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)漆酶用量越多，梗絲木質(zhì)素的降解率越高。漆酶用量為0．55μL／g和0．65μL／g時(shí)，梗絲木質(zhì)素的降解率較高，分別為41．76%和46．80%，二者間差異不顯著（P＞0．05），但與其他處理間的差異達(dá)極顯著水平（P＜0．01），故選取漆酶用量為0．55μL／g和0．65μL／g進(jìn)行多因素試驗(yàn)。

2．2降解條件的優(yōu)化

經(jīng)過單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選出酶解溫度61℃（A1）和62℃（A2），漆酶用量0．55μL／g（B1）和0．65μL／g（B2），酶解時(shí)間7h（C1）和8h（C2）等進(jìn)行三因素兩水平的多因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。由圖2可知，試驗(yàn)條件不同，梗絲木質(zhì)素的降解率也不同。其中，A1B1C2、A1B2C1、A2B1C1和A2B1C2處理梗絲木質(zhì)素的降解率較低，且差異不大；A2B2C1處理梗絲木質(zhì)素的降解率最高，為66．52%，且極顯著（P＜0．01）高于其他處理。表明，A2B2C1處理為最佳參數(shù)組合，即在62℃、8h和0．55μL／g的條件下，漆酶降解梗絲木質(zhì)素的效果最好。通過3個(gè)因素對梗絲木質(zhì)素降解率影響大小的方差分析可以得出，酶解溫度對梗絲木質(zhì)素降解率的均方最大，為578．92，其次是酶解時(shí)間（為185．88），最后是漆酶用量（為11．89），即酶解溫度對梗絲木質(zhì)素降解率的影響最大，其次是酶解時(shí)間，而漆酶用量的影響最小。

圖2 多因素試驗(yàn)漆酶對木質(zhì)素的降解率Fig．2 Degradation rate of laccase on lignin in the multi－factor test

3結(jié)論與討論

1）煙草梗絲木質(zhì)素的降解率隨溫度升高呈先升高后下降趨勢，在酶解溫度為61℃和62℃條件下梗絲木質(zhì)素的降解率較高，分別為43．88%和48．16%，顯著高于其他處理。因此，漆酶的最適溫度為61～62℃。

2）隨酶解時(shí)間的延長，梗絲木質(zhì)素的降解率逐漸增大，在酶解溫度為7h和8h條件下梗絲木質(zhì)素的降解率較高，分別為62．41%和63．45%，與其他處理存在顯著差異。但是在9h條件下，梗絲木質(zhì)素的降解率與8h無顯著差異。因此，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，對增加梗絲木質(zhì)素降解率的影響不明顯。

3）隨著漆酶用量的增加，梗絲木質(zhì)素的降解率呈上升趨勢，當(dāng)加酶量高于0．55μL／g后，降解率變化不明顯。在加酶量為0．55μL／g和0．65μL／g時(shí)，梗絲木質(zhì)素的降解率較高，分別為41．76%和46．80%，且二者與其他處理間差異顯著，但二者之間無顯著差異。因此，繼續(xù)增加漆酶用量，對增加梗絲木質(zhì)素的降解率影響不明顯。

4）多因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在酶解條件為62℃、8h、0．55μL／g時(shí)，漆酶降解梗絲木質(zhì)素的效果最好，降解率為66．52%。3個(gè)因素中以酶解溫度對梗絲木質(zhì)素降解率的影響最大。

5）本研究主要是以提高梗絲感官質(zhì)量為重點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，利用生物酶對梗絲木質(zhì)素進(jìn)行降解具有使用方便、安全無污染和使用后不需特殊處理工藝等生態(tài)優(yōu)勢。在最優(yōu)條件下處理后梗絲木質(zhì)素的降解率可達(dá)66．52%，梗絲木質(zhì)素含量明顯降低。因此，由梗絲木質(zhì)素造成的感官缺陷也可明顯改善，這為解決梗絲難以在高檔卷煙中有效利用的問題、降低生產(chǎn)成本提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。本研究結(jié)果僅為實(shí)驗(yàn)室條件下所得，若在生產(chǎn)上應(yīng)用還需進(jìn)一步調(diào)整參數(shù)；另外，沒有對酶解后梗絲的感官質(zhì)量進(jìn)行評定和化學(xué)成分測定，此后可進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：王 海）

Optimization on Degradation Conditions of Laccase on Lignin in the Tobacco Cut

LI Xiao1，GU Xiaoyan1，DING Meizhou2，WANG Haibin2，ZHOU Lijun1
（1．Institute of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan 450000；2．Technology Center，China Tobacco Henan Industrial Co．，Ltd，Zhengzhou，Henan 450000，China）

In order to improve the smoking quality of cut stem and degrade the lignin into small molecular compounds，the method of single factor and multi－factor experiments were combined to study the influence of enzyme hydrolysis temperature，hydrolysis time and the amount of laccase on the stem silk lignin degradation efficiency and the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of lignin．Results：1）With the reaction temperature increasing，the degradation rate of lignin in cut stem increased first and then decreased．At 62℃，the degradation rate was high，48．16%，and difference was significant compared with other temperature treatments．2）Along with the growth of the enzymatic hydrolysis time，lignin，degradation rate in stems silk was on the rise．In 7h，8h，9h，the degradation rate was higher，and the three were more than 60%．Compared with other temperature treatments，the difference was significant．3）With the increase of dosage of laccase，the degradation rate increased gradually．When the dosage of laccase were respectively 0．55μL／g and 0．65μL／g，degradation rate were higher，41．76%and 46．80% respectively．And significantly higher than other treatment，but there was no significant difference between the two．4）The three－factor test，reaction temperature，reaction time and enzyme dosage paint，results show that the best enzymatic hydrolysis conditions were 62℃，8h，0．55μL／g，and the degradation rate is 66．52%．

cut stem；lignin；laccase；degradation efficiency

S509．2

A

1001－3601（2016）02－0086－0149－03

2015－06－07；2016－01－07修回

河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“黃金葉中高檔煙用梗絲加工技術(shù)研究”（ZW2014034）

李 曉（1967－），女，教授，碩士，從事煙草科學(xué)教學(xué)與研究。E－mail：Lixiao6712＠126．com