黔產(chǎn)吳茱萸的UPLC－MS／MS指紋圖譜分析

張建鋒，劉 文，吳增光，張石宇，王鈺樂(lè)，楊道斌

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002）

黔產(chǎn)吳茱萸的UPLC－MS／MS指紋圖譜分析

張建鋒，劉 文＊，吳增光，張石宇，王鈺樂(lè)，楊道斌

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002）

為了對(duì)吳茱萸的質(zhì)量控制、研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1．7μm，100mm×2．1mm），以水（A，含0．05%甲酸）－乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫；柱溫40℃，流速0．4mL／min，進(jìn)樣量2μL，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：建立了吳茱萸UPLC－MS／MS指紋圖譜的共有模式，確定了27個(gè)共有峰，并根據(jù)對(duì)照品和參考文獻(xiàn)指認(rèn)了11個(gè)共有峰，對(duì)20批不同產(chǎn)地和品種的吳茱萸藥材相似度進(jìn)行分析，其相似度在0．90以上。結(jié)論：首次建立了吳茱萸藥材UPLC－MS／MS指紋圖譜分析方法，該分析方法快速、靈敏、簡(jiǎn)便，可為吳茱萸藥材各品種的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

吳茱萸；UPLC－MS／MS；指紋圖譜；質(zhì)量控制；聚類(lèi)分析

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)，主產(chǎn)于貴州、廣西、湖南、云南等省區(qū)，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉的功效［12］。近年來(lái)，吳茱萸新的藥理作用、化學(xué)成分和利用新指標(biāo)控制其提取純化工藝已得到深入研究［36］。黔產(chǎn)吳茱萸一直以來(lái)被認(rèn)為是吳茱萸的道地藥材，且產(chǎn)量大品質(zhì)好，藥效穩(wěn)定，為臨床常用藥。吳茱萸由于生長(zhǎng)環(huán)境、氣候條件等因素影響，其物質(zhì)基礎(chǔ)存有差異。指紋圖譜分析方法作為控制吳茱萸藥材的質(zhì)量方法之一，目前在吳茱萸研究過(guò)程中已有應(yīng)用［7－9］，但有關(guān)UPLC－MS／MS方法對(duì)黔產(chǎn)吳茱萸化學(xué)成分進(jìn)行定性分析研究尚無(wú)報(bào)道。因此，筆者應(yīng)用UPLC－MS／MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)黔產(chǎn)吳茱萸進(jìn)行研究，為吳茱萸藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

1．1．1儀器及試劑CQUITY UPLC（美國(guó)Waters公司），質(zhì)譜檢測(cè)器（Waters－Xevo TQ），MassL－ynx TM質(zhì)譜工作站軟件（Waters公司），科導(dǎo)SK8210HP型臺(tái)式超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），Auy220型電子天平（日本島津）。乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司），甲酸（色譜純，CNW公司），屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），0．22μm微孔濾膜（廣州泛宏貿(mào)易有限公司），吳茱萸堿（Evodiamine）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110802—201409），吳茱萸次堿（Rutecarpine）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110801—201207）；吳茱萸內(nèi)酯（Limonin）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110800—201205），乙腈、甲酸為色譜醇，水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1．1．2吳茱萸及其來(lái)源 吳茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．］分別來(lái)自貴州省印江縣（S1）、石阡縣（S2）、松桃縣（S3）、思南縣（S4）、玉屏縣（S5）、榕江縣（S6）、德江縣（S7）、江口縣（S8）和黔西縣（S9），疏毛吳茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）］分別來(lái)自貴州省威寧縣（S10）、金沙縣（S11）、大方縣（S12）、萬(wàn)江縣（S13）、德江縣（S14）、石阡縣（S15）和綏陽(yáng)縣（S16），石虎［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．var．bodinieri（Dode）Huang］分別來(lái)自貴州省石阡縣（S17）、沿河縣（S18）、思南縣（S19）和天柱縣（S20）。不同產(chǎn)地及品種吳茱萸樣品經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院周漢華教授鑒定為正品。

1．2溶液制備

1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素對(duì)照品適量，用100%甲醇溶解并稀釋制成0．662g／L、0．512g／L和0．204g／L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2）樣品溶液的制備：取樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0．2g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加入100%甲醇50mL，浸泡1h，超聲處理30min，放冷，搖勻，用微孔濾膜（0．22μm）濾過(guò)，備用。

1．3色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（1．7 μm，100mm×2．1mm），柱溫40℃，樣品溫度10℃，流速0．4mL／min，進(jìn)樣量2μL；以含0．05%甲酸的水（A）－乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

離子源為ESI源，正離子掃描模式，毛細(xì)管電壓3．0kV，取樣錐孔電壓30V，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量600L／h，錐孔氣流量50L／h。

1．4提取條件的選擇

分別以25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、90%甲醇、甲醇、乙醇、水作為提取溶劑，以微波提取、加熱回流提取、超聲提取作為提取方法，以30min、45min、60min、90min、120min作為提取時(shí)間，經(jīng)UPLC－MS／MS檢測(cè)，把色譜峰數(shù)、峰面積、分離度、基線、峰形等因素作為指標(biāo)，選擇最佳提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間。經(jīng)比較，最佳提取方案為以甲醇為提取溶劑、超聲波作為提取方法，提取時(shí)間30min。

1．5色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

比較水－乙腈、0．05%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－乙腈、0．20%甲酸水－乙腈、0．50%甲酸水－乙腈、1．00%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－0．10%甲酸乙腈、水－甲醇、0．10%甲酸水－甲醇、0．10%甲酸水－0．10%甲酸甲醇等流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜峰峰形，以0．05%甲酸水－乙腈系統(tǒng)得到的色譜峰峰形較好且穩(wěn)定。比較0．35mL／min、0．40mL／min、0．45mL／min、0．50mL／min的流速，以0．40mL／min的最佳；比較0．5μL、1．0μL、2．0μL、5．0μL的進(jìn)樣量，以2．0μL的進(jìn)樣量色譜峰峰形較好，各成分分離較好；比較100～1 000和200～800質(zhì)荷比，以100～1 000范圍內(nèi)色譜峰數(shù)相對(duì)較多，信息量豐富，響應(yīng)值高。

2結(jié)果與分析

2．1方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2．74%，相對(duì)峰面積RSD＜3．03%，表明進(jìn)樣和儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求（RSD＜5．0%）。重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜3．12%，相對(duì)峰面積RSD＜2．24%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求（RSD＜5．0%）。穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2．62%，相對(duì)峰面積RSD＜3．23%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求（RSD＜5．0%）。

2．2指紋圖譜及標(biāo)定

2．2．1指紋圖譜20批不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材UPLC－MS／MS指紋圖譜見(jiàn)圖1，根據(jù)色譜峰中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，選取其中27個(gè)共有峰作為特征指紋峰，建立了吳茱萸樣品的對(duì)照指紋圖譜（圖2）。

2．2．2指紋圖譜的標(biāo)定 比較20批供試品的色譜圖，確定27個(gè)共有峰，選擇保留時(shí)間適中且與相鄰色譜峰分離良好，峰面積比較穩(wěn)定的吳茱萸堿（10號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各指紋峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照峰的保留時(shí)間和峰面積比值，得到相對(duì)保留時(shí)間（表2）和相對(duì)峰面積（表3）。

2．3不同來(lái)源吳茱萸藥材相似度評(píng)價(jià)

從20批吳茱萸的相似度（表4）可知，各樣品與對(duì)照譜相比，其相似度均達(dá)0．9，表明藥材質(zhì)量穩(wěn)定，差異較小。

2．4聚類(lèi)結(jié)果

聚類(lèi)分析是根據(jù)相似程度大小把樣品分類(lèi)，目前廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評(píng)價(jià)、產(chǎn)地加工、品種分類(lèi)等方面。對(duì)20個(gè)產(chǎn)地的吳茱萸藥材進(jìn)行指紋圖譜分析，得到包括吳茱萸堿（10號(hào)峰）的27個(gè)共有色譜峰，將各個(gè)共有峰相對(duì)于參比峰的峰面積量化，得到20×27階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 16．0版軟件，采用組間連接法，選用歐氏距離對(duì)20批藥材進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果（圖3）表明，20個(gè)產(chǎn)地的吳茱萸藥材分為兩類(lèi)，來(lái)自貴州銅仁、黔東南等產(chǎn)地的藥材即樣品S1～S9和S13～S15聚為第1類(lèi)，說(shuō)明這12個(gè)產(chǎn)地的吳茱萸藥材指紋圖譜較為相似；其他8個(gè)產(chǎn)地的藥材聚為第2類(lèi)，即樣品S10～S12和S16～S20。吳茱萸和疏毛吳茱萸雖然品種不一，但具有一定的相似性；同為疏毛吳茱萸但存有一定差異性，可能與氣候條件、地質(zhì)條件、栽培條件等方面有關(guān)。

圖1 吳茱萸20批樣品的指紋圖譜Fig．1 Fingerprint of 20 E．fructus samples

圖2 吳茱萸樣品的對(duì)照指紋圖譜Fig．2 CK fingerprints of E．fructus samples

2．5指紋圖譜共有峰的UPLC－MS結(jié)構(gòu)鑒定及各成分

對(duì)27個(gè)共有峰中的11個(gè)主要峰的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，其中3個(gè)色譜峰與對(duì)照品比較，通過(guò)對(duì)保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜信息與對(duì)照品一致，鑒定為吳茱萸內(nèi)酯（8號(hào)峰）、吳茱萸堿（10號(hào)峰）、吳茱萸次堿（11號(hào)峰）。其他結(jié)構(gòu)成分見(jiàn)表5。

表2 吳茱萸藥材指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time of common peaks in fingerprint of 20 Euodiae Fructus samples

表3 吳茱萸藥材指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks in fingerprint of 20 E．Fructus samples

表4 不同批次吳茱萸藥材樣品相似度Table 4 Similarity among 20 Euodiae Fructus samples

圖3 20批吳茱萸藥材的聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig．3 Cluster analysis of 20 E．Fructus samples

表5 吳茱萸質(zhì)譜數(shù)據(jù)和相關(guān)成分的化學(xué)鑒定Table 5 Mass spectrometric data and relative chemical components of E．Fructus

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)首次建立了黔產(chǎn)吳茱萸UPLC－MS／MS指紋圖譜，該圖譜信息量豐富、出峰數(shù)目多、分離效果好，全面反映了黔產(chǎn)吳茱萸化學(xué)成分的信息，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求，結(jié)合相似度計(jì)算和聚類(lèi)分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，使得結(jié)果科學(xué)、可靠、準(zhǔn)確、全面，為吳茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

《貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)》常用法定計(jì)量單位及其符號(hào)

加工貯藏·農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality

Fingerprint Analysis of Euodiae fructus by UPLC－MS／MS

ZHANG Jianfeng，LiIU Wen＊，WU Zengguang，ZHANG Shiyu，WANG Yule，YANG Daobin
（1．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas was evaluated by the evaluation system of fingerprint similarity in traditional Chinese medicine（2004A）under the test conditions of ACQUITY UPLC BEH C18chromatographic column（1．7μm，100mm×2．1mm），mobile phase of water with 0．05%methanoic acid（A）－acetonitrile（B）for gradient elution，40℃，0．4mL／min flow velocity and 2μL injection volume to provide the scientific basis for quality control，research，development and application of E．fructus．Results：The common model of E．fructus UPLC－MS／MS fingerprint is established and 27common peaks are determined．11common peaks are identified according to the reference substance and reference list．The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas is above 0．90．In conclusion，the PLC－MS／MS fingerprint analysis method with rapidity，high sensitivity and simplicity can be used in quality control of E．fructus medicinal materials．

Euodiae fructus；UPLC－MS／MS；fingerprint；quality control；clustering analysis

S567

A

1001－3601（2016）02－0084－0137－06

2015－08－05；2016－02－05修回

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“基于‘譜效’關(guān)聯(lián)的戊己胃內(nèi)漂浮釋藥系統(tǒng)制備工藝環(huán)節(jié)評(píng)價(jià)研究”（81460609）

張建鋒（1981－），男，在讀碩士，研究方向：中藥新技術(shù)與新制劑。E－mail：286911082＠qq．com

＊通訊作者：劉 文（1968－），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新技術(shù)與新制劑研究。E－mail：642771631＠qq．com