青天葵DXR基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

黃瓊林，何 瑞，詹若挺

（1．廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023；2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州510006；3．嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東廣州510006）

青天葵DXR基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

黃瓊林1，何 瑞2，3＊，詹若挺2，3

（1．廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023；2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州510006；3．嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東廣州510006）

為后期青天葵DXR基因的全長克隆、功能鑒定和調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)方法對前期通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的青天葵DXR基因編碼蛋白序列進行分析。結(jié)果表明：NfDXR序列包含457個氨基酸，分子量約為49．72Ku，為親水性、混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。NfDXR屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶超級家族，含有DXR功能域、2個NAPDH結(jié)合基序和2個DXR活性位點基序，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽結(jié)構(gòu)。NfDXR與其他單子葉植物DXR同源性高，其中與鐵皮石斛DXR的序列相似度達(dá)90%。

1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶；青天葵；生物信息學(xué)

1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase，DXR）是植物萜類生物合成途徑——MEP途徑的關(guān)鍵酶基因之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)［2－3］，過表達(dá)DXR基因可以提高植物萜類化合物的含量，表明DXR基因是調(diào)控萜類生物合成的有效靶點。目前，DXR基因已經(jīng)從陽春砂［4］、高良姜［5］、秦艽［6］、雷公藤［7］、滇龍膽［8］等藥用植物中成功克隆。

嶺南地區(qū)名貴中藥青天葵為蘭科多年生草木植物毛唇芋蘭（Nervilia fordii（Hance）Schltr．）的全株或葉片，在臨床上常用于治療小兒呼吸道和肺部疾?。?］。目前，青天葵野生資源已經(jīng)基本枯竭，而人工栽培青天葵由于面臨萌發(fā)條件苛刻、種苗稀缺等瓶頸問題，無法生產(chǎn)足夠的青天葵滿足臨床和市場需求。青天葵植物研究表明，萜類成分是青天葵的主要有效成分之一［10－11］。在化學(xué)成分比較明確的情況下，利用植物基因工程技術(shù)調(diào)控DXR等萜類生物合成功能基因的表達(dá)，從而提高青天葵萜類有效成分的含量，進而在整體上提高青天葵藥效，是當(dāng)前緩解青天葵資源緊缺的途徑之一。

在前期研究中，廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心課題組完成了青天葵全轉(zhuǎn)錄組RNA－seq測序，共獲得142 220條青天葵功能基因，其中包括1條長度為1 731bp的青天葵DXR基因cDNA序列［12］。本研究采用生物信息學(xué)方法對DXR基因編碼的氨基酸進行理化特征、保守功能域、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)組成等分析，明確青天葵DXR基因的分子功能和特點，為后續(xù)青天葵DXR基因全長的克隆以及利用其促進青天葵萜類有效成分的積累奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1DXR氨基酸序列來源

將在青天葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的DXR基因序列，翻譯成氨基酸序列，并結(jié)合青天葵的拉丁名，命名為NfDXR。另外，在Genbank數(shù)據(jù)庫下載鐵皮石斛、陽春砂、高良姜等植物DXR氨基酸序列，用于DXR序列多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1．2生物信息學(xué)分析

采用表中的在線或離線軟件對NfDXR進行理化特征、保守功能域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)發(fā)育分析等生物信息學(xué)分析。

表NfDXR生物信息學(xué)分析所用的主要軟件Table Bioinformatics software used in this study

2結(jié)果與分析

2．1NfDXR的理化特征

ExPASY ProtParam在線工具分析表明，NfDXR包含457個氨基酸，相對分子量為49．72Ku，等電點為6．22。脂溶性指數(shù)為98．01，總平均親水性指數(shù)為－0．024。ExPASY Protscale分析結(jié)果顯示，NfDXR無明顯疏水區(qū)域，多肽鏈整體呈親水性，為親水性蛋白。

2．2NfDXR的保守功能域

如圖1所示，NfDXR在63～191、205～288和320～443位氨基酸分別存在DXP＿reductoisom、DXP＿redisom＿C和DXPR＿C等3個特異性保守功能域，歸屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶超級家族；NfDXR在13～457位氨基酸間具有1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase）功能域，說明其具有1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶的功能。

圖1 NfDXR的保守功能域Fig．1 Conserved domain of NfDXR

圖2 NfDXR的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig．2 Putative transmembrane region of NfDXR

2．3NfDXR的跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽

如圖2所示，NfDXR整體多肽鏈不含跨膜結(jié)構(gòu)域，均位于細(xì)胞膜外。SignalP分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，NfDXR不含信號肽結(jié)構(gòu)。由此推測，NfDXR是不與膜脂結(jié)合的非分泌性蛋白。

2．4NfDXR的二級結(jié)構(gòu)

SOPMA分析結(jié)果（圖3）表明，NfDXR的二級結(jié)構(gòu)由α－螺旋、延伸鏈、β－轉(zhuǎn)角和不規(guī)則盤繞構(gòu)成，其中α－螺旋和不規(guī)則盤繞是主要的組成元件，在多肽鏈中分布比較集中，而另外2種元件延伸鏈和β－轉(zhuǎn)角則分布情況相對分散。因此，從整體二級結(jié)構(gòu)來看，NfDXR屬于混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。

圖3 NfDXR的二級結(jié)構(gòu)Fig．3 Secondary structure prediction of NfDXR

2．5NfDXR的多重序列比對

NfDXR與其他植物DXR的氨基酸序列多重比對（圖4）顯示，不同DXR在70位氨基酸后的序列具有較高的連續(xù)相似性，說明DXR在不同植物中存在序列和功能的高度保守性。其中，在其N－端含有2個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）結(jié)合基序GSTGSIGT和LAAGANV，在多肽鏈中部含有2個DXR活性位點基序PADSEHSA和NKGLEVIEAHY。

圖4 不同植物DXR氨基酸序列的多重比對Fig．4 Multiple alignment of DXR sequences from various plants

2．6系統(tǒng)發(fā)育樹

10種不同植物DXR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，青天葵、鐵皮石斛、高良姜、陽春砂等單子葉植物來源DXR聚集在一起，其中NfDXR與同為蘭科的鐵皮石斛DXR同源性最高，序列相似度可達(dá)90%；而擬南芥等雙子葉植物來源DXR則聚成另外一個分支。

圖5 不同DXR的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．5 Phylogenetic tree of different DXRs

圖6 NfDXR的三級結(jié)構(gòu)Fig．6 Tertiary structure prediction of NfDXR

2．7NfDXR的三級結(jié)構(gòu)

Swiss－model三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖6）顯示，NfDXR的功能結(jié)構(gòu)域在空間結(jié)構(gòu)上折疊成V形，V形的兩臂由N端與C端構(gòu)成。N端臂內(nèi)含有2個NADPH結(jié)合基序；V形的底部，即N端臂與C端臂結(jié)合域內(nèi)藏有2個DXR活性位點基序。

3結(jié)論與討論

DXR作為植物萜類生物合成MEP途徑的第2個酶，將DXP催化生成MEP這一萜類合成重要前體，由于DXR也是硫胺素（VB1）和吡哆醇（VB6）生物合成的前體物質(zhì)。因此，DXR主導(dǎo)的催化反應(yīng)是MEP途徑的碳流分支點，DXR也被認(rèn)為是MEP途徑的關(guān)鍵酶之一。Mahmoud等［2］在胡椒薄荷中過量表達(dá)DXR基因，可促進葉片中薄荷油等單萜的合成，使薄荷精油量提高50%。Wu等［3］從丹參發(fā)根中克隆得到DXR基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與高滲透壓和酵母真菌激發(fā)子呈正相關(guān)，并與二萜類成分丹參酮的積累相關(guān)。DXR突變還影響植物葉綠素、赤霉素和脫落酸等物質(zhì)的合成，導(dǎo)致植株出現(xiàn)白化、矮化等異常表型［13］。因此，DXR不僅是植物萜類生物合成的重要調(diào)控靶點，還對植物的生長發(fā)育有重要的影響。

本研究在青天葵轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)方法對青天葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶進行理化特征及分子功能研究得出，NfDXR以α－螺旋和不規(guī)則盤繞為主要二級結(jié)構(gòu)組成元件的親水性、非膜脂結(jié)合、非分泌性蛋白。NfDXR具有1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase功能域，歸屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶超級家族。多重序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測也表明，NfDXR與其他植物DXR蛋白存在高度的同源性，氨基酸序列中均含有共有的結(jié)合域（2個NADPH結(jié)合基序和2 個DXR活性位點基序），提示NfDXR具有與其他植物DXR類似的功能，即催化前體DXP發(fā)生分子重排并在NADPH和二價金屬離子參與下還原生成MEP。

［1］Takahashi S，Kuzuyama T，Watanabe H，et al．1－deoxy－D－xylubose－5－phosphate reductoisomerase catalyzing formation of 2－C－Methyl－D－erythritol－4phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for treenpenoid biosynthesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）：9879－9884．

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［3］Wu S J，Shi M，Wu J Y．Cloning and characterization of 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase gene for diterpenoid tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza（Chinese sage）hairy roots［J］．Biotechnol Appl Biochem，2009，52（Pt1）：89－95．

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［8］張曉東，趙 靜，李彩霞，等．滇龍膽葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶基因GrDXR的克隆、序列分析和原核表達(dá)［J］．中草藥，2014，45（16）：2378－2784．

［9］陳蔚文．嶺南本草（二）［M］．廣州：廣東科技出版社，2010：326－351．

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Bioinformatics Analysis of Gene DXRfrom Nervilia fordii

HUANG Qionglin1，HE Rui2，3＊，ZHAN Ruoting2，3
（1．Guangdong Medical University，Zhanjiang，Guangdong524023；2．Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006；3．Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Ministry of Education，Guangzhou，Guangdong510006，China）

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase is one of the rate－limiting key enzymes of plant MEP terpenoids biosynthesis pathway．Enhancing DXR expression could promote the synthesis of terpenoid．In order to lay the foundation for overall length coloning，functional identification and regulation of gene DXRfrom N．fordii，in later period，bioinformatics methods were employed to analyze DXR protein sequence acquired from N．fordii transcriptome data．Results：NfDXR，containing 457 amino acids，was a hydrophilic and structurally hybrid protein with a molecular weight at 49．72Ku．NfDXR contained a 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase functional domain，two NAPDH binding motifs，two DXR active motifs and none signal peptide and transmembrane region．NfDXR shared high homology with othrer DXR from monocotyledons，in which the similarity with DXR from Dendrobiumofficinalereached 90%．

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase；Nervilia fordii；bioinformatics analysis

S567．23＋9

A

1001－3601（2016）02－0082－0129－04

2015－07－10；2016－01－10修回

國家自然科學(xué)基金項目“中藥青天葵分枝發(fā)育相關(guān)基因的研究”（30701090）；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目“中藥青天葵黃酮類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因CHS和FLS的功能和調(diào)控研究”（2015A030310519）

黃瓊林（1986－），男，講師，博士，從事醫(yī)學(xué)生物化學(xué)研究。E－mail：perfecthql＠163．com

＊通訊作者：何 瑞（1972－），女，研究員，博士，從事中藥資源可持續(xù)利用研究。E－mail：ruihe＠gzucm．edu．cn