不同短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析

侯愛月,李 軍,卞 偉,王 盟,鄭林雪,張彥灼,趙昕燕 (北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124)

?

不同短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析

侯愛月,李 軍*,卞 偉,王 盟,鄭林雪,張彥灼,趙昕燕 (北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100124)

摘要：為探討有機(jī)碳源對(duì)短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,采用構(gòu)建克隆文庫的方法對(duì)模擬無機(jī)城市生活污水和模擬實(shí)際城市生活污水短程硝化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,變形菌門(Proteobacteria)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)是兩系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群.兩系統(tǒng)中的菌群結(jié)構(gòu)存在差異,但優(yōu)勢(shì)菌群及其所占比例相似.兩系統(tǒng)中的主要脫氮菌類群也相似,但由于有機(jī)碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.無機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的脫氮菌群包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和Denitratisoma,其中自養(yǎng)硝化菌的比例高于其在有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的比例,但仍低于異養(yǎng)菌在該系統(tǒng)中的比例.有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的脫氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化細(xì)菌和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),其中亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的含量很少.

關(guān)鍵詞：有機(jī)碳源；短程硝化；克隆文庫；微生物群落結(jié)構(gòu)

* 責(zé)任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

與全程硝化相比,短程硝化可減少25％的硝化需氧量和40％的反硝化碳源,具有較低的污泥產(chǎn)量,并且可減少反硝化池容積[1-4],成為近幾年新型生物脫氮工藝的研究熱點(diǎn).國內(nèi)外有關(guān)短程硝化的研究多用于處理污泥消化液、垃圾滲濾液等高氨氮廢水[5-6],并已有工程應(yīng)用,而基于城市生活污水的短程硝化研究則多局限于實(shí)驗(yàn)室水平,有待于進(jìn)一步深入.硝化過程是由氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)這兩種菌群的生化作用完成,可以通過控制各種影響因素促進(jìn)AOB的生長繁殖而抑制NOB的生長實(shí)現(xiàn)短程硝化[7-8].微生物在硝化過程中起著至關(guān)重要的作用,深入研究污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)有助于加強(qiáng)對(duì)硝化過程機(jī)理的理解,進(jìn)而為工藝的優(yōu)化控制和穩(wěn)定運(yùn)行提供更加全面的參考和依據(jù).

目前國內(nèi)外關(guān)于短程硝化的研究多集中在短程硝化的工藝運(yùn)行及優(yōu)化方面,李凌云等[9]對(duì)短程硝化的啟動(dòng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,蘇東霞等[10]進(jìn)行了不同曝氣方式SBR短程硝化試驗(yàn).有關(guān)進(jìn)水水質(zhì)對(duì)短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少,趙志瑞等[11]為探討短程硝化系統(tǒng)中的微生物對(duì)不同污水的適應(yīng)性,利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)高氨氮廢水和城市生活污水短程系統(tǒng)中活性污泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較.C、N是生活污水中最主要的兩大污染元素,目前運(yùn)用比較多的污水處理工藝(AO、AAO等)均是將硝化系統(tǒng)與反硝化系統(tǒng)分開,這樣硝化系統(tǒng)中主要以N源為主,反硝化系統(tǒng)中以C源為主.但是,隨著短程硝化技術(shù)的成熟以及對(duì)高脫氮率的追求而設(shè)置的高回流比,使得有機(jī)碳源可能進(jìn)入硝化系統(tǒng).另外,許多脫氮新工藝的出現(xiàn),使得硝化系統(tǒng)與反硝化系統(tǒng)合二為一,比如,同步硝化反硝化(SND)和同步亞硝化-厭氧氨氧化-反硝化(SNAD)等,即C、N共存于同一系統(tǒng)中.因此,探討有機(jī)碳源對(duì)短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有很大的現(xiàn)實(shí)意義.本研究考察了有機(jī)碳源的存在對(duì)短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,并著重考察了有機(jī)碳源對(duì)常見自養(yǎng)硝化菌群的影響,以期為SND、SNAD等C、N共存一個(gè)系統(tǒng)的新工藝提供微生物基礎(chǔ),利于污染去除效果的提高.

本實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)SBR反應(yīng)器,接種相同的活性污泥,進(jìn)水分別為模擬無機(jī)城市生活污水和模擬實(shí)際城市生活污水,通過控制溶解氧(DO)和曝氣時(shí)間,實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的短程硝化.采用構(gòu)建克隆文庫的方法,對(duì)兩種短程硝化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析,考察有機(jī)碳源對(duì)基于城市生活污水短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,確定優(yōu)勢(shì)菌群,以期為實(shí)現(xiàn)可控短程硝化提供微生物群落調(diào)控方面的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)構(gòu)造相同由有機(jī)玻璃制成的SBR反應(yīng)器,內(nèi)部設(shè)置定時(shí)攪拌裝置和精確曝氣裝置.反應(yīng)器1的進(jìn)水采用模擬無機(jī)城市生活污水,反應(yīng)器2的進(jìn)水為模擬實(shí)際城市生活污水,兩個(gè)反應(yīng)器中的具體水質(zhì)指標(biāo)(mg/L)為:COD (CH3COONa) 200(只有反應(yīng)器2中添加), NH4+-N(NH4Cl) 70,堿度(CaCO3計(jì)) 500,磷(KH2PO4) 2; 鐵(FeSO4?7H2O) 1,硼(H3BO3) 0.2,錳(MnCl2?4H2O) 0.2,鋅(ZnSO4?7H2O) 0.2,銅(CuSO4?5H2O) 0.1,鎂(MgSO4?7H2O) 0.1,鎳(NiCl2?6H2O) 0.2,鈷(CoCl2?6H2O) 0.3.兩個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的接種污泥均取自北京某污水處理廠曝氣池,其硝化性能良好,f值在0.7左右,污泥指數(shù)(SVI)值在90mL/g左右,污泥濃度(MLSS)在3500mg/L左右.實(shí)驗(yàn)過程中控制溫度在20～22℃,pH值在7.2～7.9,溶解氧在0.5～1mg/L,經(jīng)過80個(gè)周期的運(yùn)行,兩個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的NO2--N積累率均達(dá)到90％以上,繼續(xù)運(yùn)行30個(gè)周期, NO2--N積累率維持穩(wěn)定,成功實(shí)現(xiàn)了短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.在兩反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期(第110個(gè)周期),進(jìn)行污泥樣品采集,對(duì)應(yīng)編號(hào)樣品為R1和R2,樣品采集后在-20℃下保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌總DNA提取 泥樣在1.5mL離心管中靜沉30min后去除上清液,15000r/min高速離心5min后,去除上層清液,取0.3g泥樣用于總DNA提取,剩余污泥冷凍備用.采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取后,取5μL用1.2％瓊脂糖凝膠檢測(cè).其余置于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 將提取的細(xì)菌總DNA作為PCR的模板,采用針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物對(duì)27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(50μL):10×PCR Buffer 5μL,dNTP(各2.5mmol/L) 1μL,27f(20μmol/L) 1μL,1492r(20μmol/L) 1μL, Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板0.5μL,加ddH2O至50μL.PCR采用降落式擴(kuò)增程序,具體反應(yīng)條件為:首先95℃預(yù)變性1.5min;其次95℃變性0.5min,60℃退火0.5min,72℃延伸2min,5個(gè)循環(huán);之后95℃變性0.5min,55℃退火0.5min, 72℃延伸2min,5個(gè)循環(huán);之后95℃變性0.5min, 50℃退火0.5min,72℃延伸2min,15個(gè)循環(huán);最后60℃延伸10min.

將提取的細(xì)菌總DNA作為PCR的模板,采用針對(duì)AOB功能基因amoA的引物對(duì)amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer 5μL,dNTP(各2.5mmol/L) 2μL,amoA-1F (20μmol/L)1μL,amoA-2R(20μmol/L) 1μL,Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板2μL,加ddH2O 至50μL.PCR反應(yīng)條件為:首先94℃預(yù)變性5min;其次94℃變性30S,55℃退火1min,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.

1.2.3 克隆、轉(zhuǎn)化和文庫的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物用上海生工提供的“SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒”進(jìn)行純化后,與pMD18-T載體(Takara)連接.之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中,涂布在含Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,37℃下培養(yǎng)15h左右后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.藍(lán)色菌落為陰性菌落,白色菌落為陽性菌落.隨機(jī)挑選一定量的白斑,用載體通用引物對(duì)RV-M(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-47(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)做菌落PCR進(jìn)行假陽性的驗(yàn)證,篩選出插入的片段大小正確的克隆子.

片段大小正確的PCR產(chǎn)物用Hha I(Takara, Japan)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切.酶切反應(yīng)于37℃進(jìn)行4h,酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),然后在凝膠成像系統(tǒng)中成像,并根據(jù)凝膠成像結(jié)果中的酶切帶型分型,每個(gè)酶切類型挑取1～2個(gè)代表菌株送往上海生工生物公司測(cè)序.

將測(cè)序所得基因序列,去除載體片段,并利用Bellerophon軟件進(jìn)行chimerae的剔除(http:// comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl).將處理后的測(cè)序基因序列輸入到NCBI網(wǎng)站,利用blast程序與數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對(duì)鑒定,將序列比對(duì)結(jié)果相同的克隆子定義為一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU),并下載每個(gè)OTU代表序列的同源性序列,利用MEGA5.0軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行狀況分析

兩個(gè)SBR反應(yīng)器內(nèi)短程硝化工藝啟動(dòng)馴化和穩(wěn)定運(yùn)行過程中NO2--N積累率隨周期的變化情況如圖1所示.

圖1　兩個(gè)反應(yīng)器中NO2--N積累率的變化Fig.1 The change of nitrogen accumulation rate in two reactors

由圖1可見,兩個(gè)反應(yīng)器中NO2--N積累率均隨周期數(shù)增加而逐漸升高,運(yùn)行至第80個(gè)周期, NO2--N積累率都達(dá)到90％以上,繼續(xù)運(yùn)行30個(gè)周期, NO2--N積累率維持穩(wěn)定,成功實(shí)現(xiàn)了模擬無機(jī)城市生活污水短程硝化和模擬實(shí)際城市生活污水短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.

兩個(gè)SBR反應(yīng)器中各個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)的曝氣時(shí)間如表1所示.由表1可見,兩個(gè)反應(yīng)器中各個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)的曝氣時(shí)間均隨周期數(shù)增加而逐漸減少,但反應(yīng)器2中各個(gè)周期內(nèi)的曝氣時(shí)間都多于反應(yīng)器1內(nèi)的曝氣時(shí)間.

由圖1和表1可見,針對(duì)SBR工藝,有機(jī)碳源對(duì)短程硝化啟動(dòng)所需的周期數(shù)沒有太大影響,但是會(huì)增加每個(gè)周期的運(yùn)行時(shí)間,進(jìn)而增加短程硝化啟動(dòng)并維持穩(wěn)定所需的總時(shí)間.進(jìn)水中添加有機(jī)碳源,促進(jìn)異養(yǎng)菌的生長,抑制自養(yǎng)硝化菌的生長,短程硝化的實(shí)現(xiàn)相對(duì)緩慢,在兩反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期(第110個(gè)周期),進(jìn)行污泥取樣,檢測(cè)微生物種群,考察有機(jī)碳源對(duì)短程硝化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.

表1　兩個(gè)反應(yīng)器中各個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)的曝氣時(shí)間Table 1 Aeration time of each operation cycle in two reactors

2.2 總DNA提取與PCR擴(kuò)增

污泥樣品提取的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè),得到的總DNA片段大小約為23kb.以樣品總DNA為模板,通過引物分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因和AOB amoA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所得到的片段大小約為1500bp和500bp,與目的基因片段長度相當(dāng),滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.

2.3 短程硝化系統(tǒng)中總細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析

反應(yīng)器1中細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示.R1樣品的16S rDNA克隆文庫中,80個(gè)克隆子分類為24個(gè)OTUs.根據(jù)莫旭華[12]的群落結(jié)構(gòu)計(jì)算方法和系統(tǒng)學(xué)分析,該文庫的覆蓋率為93.75％,Shannon–Weiner指數(shù)為4.25, Simpson指數(shù)為93.50％,均勻度為0.93.由圖2可以看出所有OTUs分別屬于細(xì)菌域的7個(gè)主要類群,其中,變形菌門(Proteobacteria)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)在文庫中所占比例最大,分別為35％和31.25％;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria),分別占17.5％和7.5％;硝化螺旋菌門(Nitrospira)、螺旋體門(Spirochaetes)、和綠彎菌門(Chloroflexi)所占比例相對(duì)較小,分別為3.75％、3.75％、3.75％、1.25％.

反應(yīng)器2中細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示.R2樣品的16S rDNA克隆文庫中,100個(gè)克隆子分類為30個(gè)OTUs.該文庫的覆蓋率為90％,Shannon–Weiner指數(shù)為4.42, Simpson指數(shù)為93.76％,均勻度為0.90.由圖3可以看出所有OTUs分別屬于細(xì)菌域的5個(gè)主要類群,其中,未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)和變形菌門(Proteobacteria)在文庫中所占比例最大,分別為43％和30％;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),占17％;此外還含有少量的疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes),在文庫中各占比例為8％和2％.

這一結(jié)果與Snaidr等[13]的研究結(jié)果一致,即變形菌門(Proteobacteria)一直是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)類群.R1樣品中Proteobacteria又分為α-Proteobacteria (1.25％);β-Proteobacteria (32.5％); δ-Proteobacteria (1.25％).R2樣品中Proteobacteria又分為α-Proteobacteria (2％);β-Proteobacteria (18％); γ-Proteobacteria (7％); δ-Proteobacteria (3％).

兩系統(tǒng)中的另一優(yōu)勢(shì)菌群為未培養(yǎng)菌,表明短程硝化系統(tǒng)中的細(xì)菌多樣性豐富,并潛藏著許多未被人們認(rèn)識(shí)的微生物新資源,有待于進(jìn)一步深入研究.R1樣品中未培養(yǎng)菌所占比例為31.25％, R2樣品中未培養(yǎng)菌所占比例高達(dá)40％,表明有機(jī)碳源存在的短程硝化系統(tǒng)中,細(xì)菌多樣性更豐富,潛藏著更多還無法估量的微生物資源,在未來的研究中還需結(jié)合純分離培養(yǎng)方法和其它分子生物學(xué)手段,以驗(yàn)證和完善本研究的16S rDNA克隆文庫菌群結(jié)構(gòu)研究.

擬桿菌門(Bacteroidetes)是兩系統(tǒng)中共同存在的第三大類菌群,且在兩克隆文庫中所占比例相近,表明Bacteroidetes對(duì)有機(jī)碳源的適應(yīng)性較強(qiáng).擬桿菌是化能有機(jī)營養(yǎng)菌,能夠代謝碳水化合物,降解許多復(fù)雜有機(jī)物[14].

R1樣品中特有的微生物類群為硝化螺旋菌門(Nitrospira)、酸桿菌門(Acidobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和綠彎菌門(Chloroflexi). Nitrospira是到目前為止,很多文獻(xiàn)中報(bào)道的在生物脫氮過程中占主導(dǎo)地位的亞硝酸鹽氧化菌(NOB)[15-16].Nitrospira是自養(yǎng)型細(xì)菌,在與異養(yǎng)菌共同生存時(shí),其自身生長周期長,沒有時(shí)空方面的競(jìng)爭優(yōu)勢(shì),因而受到抑制.Tank 等[17]的研究指出Acidobacteria廣泛存在于貧營養(yǎng)環(huán)境中.

圖2　反應(yīng)器1中細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on comparison of bacteria 16S rRNA gene in reactor 1

圖3　反應(yīng)器2中細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on comparison of bacteria 16S rRNA gene in reactor 2

R2樣品中特有的微生物類群為疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes). Verrucomicrobia是新劃分出的一門細(xì)菌,含有為數(shù)不多的一些被辨別出的種類,多數(shù)在土壤和水中生存,能夠降解有機(jī)物[18].Planctomycetes是一類重要的環(huán)境微生物,對(duì)全球氮循環(huán)具有重要意義,包括化能自養(yǎng)型的厭氧氨氧化菌,但多數(shù)浮霉菌是化能異養(yǎng)型的,如Planctomyces、Pirellula、Gemmata、Isosphaera,在厭氧條件下利用有機(jī)物進(jìn)行發(fā)酵作用[19].該反應(yīng)器為立方體結(jié)構(gòu),空間上可能存在缺氧區(qū)域,且反應(yīng)器為間歇運(yùn)行,閑置時(shí)反應(yīng)器為缺氧狀態(tài),因此形成了適合此類細(xì)菌生長的環(huán)境.

2.4 短程硝化系統(tǒng)中脫氮功能菌的群落結(jié)構(gòu)分析在構(gòu)建的兩個(gè)16S rDNA克隆文庫中,變形菌都是優(yōu)勢(shì)菌群,多數(shù)脫氮細(xì)菌也分布在這一類中.R2樣品中占優(yōu)勢(shì)的β-變形菌綱包括索氏菌屬(Thauera)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、德克斯氏菌屬(Derxia)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)和Denitratisoma.其中,Thauera屬細(xì)菌是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中具有反硝化及多種芳香族污染物降解能力的重要功能微生物[20];Azoarcus屬在很多的研究中被證明是反硝化條件下降解芳香族化合物的重要的微生物[21-22].該模擬實(shí)際城市生活污水實(shí)現(xiàn)的短程硝化系統(tǒng)中一些具有反硝化功能的菌群出現(xiàn),說明反應(yīng)器2中除了傳統(tǒng)的硝化途徑外,還同時(shí)存在著多種反硝化反應(yīng)作用于氨氮的去除過程中.該文庫中未檢測(cè)出常見的氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB),因系統(tǒng)中添加有機(jī)碳源,異養(yǎng)菌相對(duì)于自養(yǎng)菌繁殖速度快,世代周期短,能夠快速的生產(chǎn)繁殖并大量聚集.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在該有機(jī)碳源存在的短程硝化系統(tǒng)中,硝化細(xì)菌含量很少,異養(yǎng)菌仍然占絕對(duì)優(yōu)勢(shì).

R1樣品中占優(yōu)勢(shì)的β-變形菌綱包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和Denitratisoma,其中代表克隆子R1-T-OTU1、R1-T-OTU2和R1-TOTU3分別與Nitrosomonas sp.(AJ224941)、Nitrosococcus mobilis(AF287297)和Nitrosomonas sp.(AB079053)的同源性為99％,且并未檢出亞硝化螺菌屬(Nitrosospira).因此,該系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)自養(yǎng)型氨氧化菌(AOB)屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),所占比例為22.5％.這一結(jié)果與多數(shù)研究結(jié)果相吻合,即多數(shù)污水處理系統(tǒng)中占優(yōu)勢(shì)的AOB為Nitrosomonas[23-25].辛?xí)远琜26]的研究指出Denitratisoma具有反硝化性能.該系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化菌(NOB)屬于硝化螺菌屬(Nitrospira),所占比例為3.75％.結(jié)果表明該模擬無機(jī)城市生活污水實(shí)現(xiàn)的短程硝化系統(tǒng)中常見的自養(yǎng)硝化菌所占比例為26.25％,高于其在上述有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的比例,但仍低于異養(yǎng)菌在該系統(tǒng)中的比例.

圖4　反應(yīng)器1中AOB amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on comparison of amoA gene of AOB in reactor 1

為了更加全面的了解短程硝化系統(tǒng)中的硝化細(xì)菌,對(duì)于系統(tǒng)中數(shù)量較少的氨氧化菌(AOB),采用針對(duì)AOB功能基因amoA的引物對(duì)進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增,構(gòu)建AOB的克隆文庫.基于amoA基因建立AOB的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4和圖5.結(jié)果表明,構(gòu)建的兩個(gè)克隆文庫中所檢測(cè)出的AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas).

通過構(gòu)建克隆文庫的方法對(duì)兩個(gè)短程硝化系統(tǒng)中的脫氮菌群進(jìn)行對(duì)比分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:R1系統(tǒng)中的脫氮菌群包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和 Denitratisoma,其中自養(yǎng)硝化菌的比例為26.25％,高于其在有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的比例,但仍低于異養(yǎng)菌在該系統(tǒng)中的比例;R2系統(tǒng)中脫氮菌群主要包括β-變形菌綱中的一些反硝化細(xì)菌和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),其中亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的含量很少.兩個(gè)短程硝化系統(tǒng)中的主要脫氮菌類群相似,主要分布于β-變形菌綱,由于有機(jī)碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.

圖5　反應(yīng)器2中AOB amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on comparison of amoA gene of AOB in reactor 2

3 結(jié)論

3.1 通過構(gòu)建系統(tǒng)16S rDNA克隆文庫,對(duì)比分析了模擬無機(jī)城市生活污水和模擬實(shí)際城市生活污水短程硝化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu),無機(jī)短程硝化系統(tǒng)中包括7個(gè)主要類群,按照優(yōu)勢(shì)類群依次為Proteobacteria(35％),uncultured bacterium (31.25％),Bacteroidetes(17.5％), Acidobacteria(7.5％), Nitrospira (3.75％), Spirochaetes (3.75％), Chloroflexi (3.75％);有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中包括5個(gè)主要類群,按照優(yōu)勢(shì)類群依次為uncultured bacterium (43％), Proteobacteria (30％), Bacteroidetes (17％), Verrucomicrobia (8％), Planctomycetes (2％).

3.2 模擬無機(jī)城市生活污水和模擬實(shí)際城市生活污水短程硝化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異,但優(yōu)勢(shì)菌群及其比例相似,Proteobacteria和 uncultured bacterium是兩系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群.

3.3 模擬無機(jī)城市生活污水和模擬實(shí)際城市生活污水短程硝化系統(tǒng)中的主要脫氮菌類群相似,由于有機(jī)碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.無機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的脫氮菌群包括Nitrosomonas、Nitrospira和Denitratisoma,其中自養(yǎng)硝化菌的比例高于其在有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的比例,但仍低于異養(yǎng)菌在該系統(tǒng)中的比例.有機(jī)短程硝化系統(tǒng)中的脫氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化細(xì)菌和Nitrosomonas,其中Nitrosomonas的含量很少.

參考文獻(xiàn)：

[1] 張功良,李 冬,張肖靜,等.延時(shí)曝氣對(duì)常溫低氨氮SBR亞硝化影響及恢復(fù) [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(8):1998-2002.

[2] Bartroli A, Carrera J, Perez J. Bioaugmentation as a tool for improving the start-up and stability of a pilot-scale partial nitrification biofilm airlift reactor [J]. Bioresource Technology,2011,102(6):4370-4375.

[3] Nittami T, Ootake H, Imai Y, et al. Partial nitrification in a continuous pre-denitrification submerged membrane bioreactor and its nitrifying bacterial activity and community dynamics [J]. Biochemical Engineering Journal, 2011,55(2):101-107.

[4] 蘇東霞,李 冬,張肖靜,等.曝停時(shí)間比對(duì)間歇曝氣SBR短程硝化的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(5):1152-1158.

[5] 張 亮.高氨氮污泥消化液生物脫氮工藝與優(yōu)化控制 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013.

[6] 何曉紅,楊 暖,陶 勇,等.高濃度氨氮廢水短程硝化及氨氧化菌群分析 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2013,19(2):313-317.

[7] Beccari M, Passino R, Ramadori R, et al. Kinetics of dissimilatory nitrate and Nitrite reduction in suspended growth culture [J]. Water Pollution Control Federation, 1983,55(1):58-64.

[8] Turk O, Mavinic D S. Benefits of using selective inhibition to remove nitrogen from highly nitrogenous wastes [J]. Environmental. Technology. Letters, 1987,8(1):419-426.

[9] 李凌云,彭永臻,楊 慶,等.SBR工藝短程硝化快速啟動(dòng)條件的優(yōu)化 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(3):312-317.

[10] 蘇東霞,李 冬,張肖靜,等.不同曝氣方式SBR短程硝化試驗(yàn)研究 [J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014,45(6):2120-2129.

[11] 趙志瑞,馬 斌,張樹軍,等.高氨氮廢水與城市生活污水短程硝化系統(tǒng)菌群比較 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2013,34(4):1448-1456.

[12] 莫旭華,麻 威,史榮久,等.氮肥對(duì)小麥田土壤nirS型反硝化細(xì)菌多樣性的影響 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2009,49(9):1203-1208.

[13] Snaidr J, Amann R, Huber I, et al. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge [J]. Applied & Environmental Microbiology, 1997,63(7):2884-2896.

[14] Hill V R, Kahler A M, Jothikumar N, et al. Multi-State evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-L tap water samples [J]. Journal of Japan Water Works Association, 2007,76(13):4218-4225.

[15] Burrell P, Keller J, Blackall L. Characterisation of the bacterial consortium involved in nit rite oxidation in activated sludge [J]. Water Science & Technology, 1999,39(6):45-52.

[16] Lee H, Lee S, Lee J, et al. Molecular characterization of microbial community in nit rate-removing activated sludge [J]. Fems Microbiology Ecology, 2002,41(2):85-94.

[17] Tank M, Bryant D A. Nutrient requirements and growth physiology of the photoheterotrophic Acidobacterium, Chloracidobacterium thermophilum [J]. Frontiers in Microbiology, DOI:10.3389/fmicb.2015.00226.

[18] 李妙婉.一體化脫氮除磷曝氣生物濾池處理生活污水的效能及微生物種群結(jié)構(gòu)研究 [D]. 濟(jì)南:濟(jì)南大學(xué), 2014.

[19] 黃佩蓓,焦念志,馮 潔,等.海洋浮霉?fàn)罹鄻有耘c生態(tài)學(xué)功能研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014,41(9):1891-1902.

[20] 鄭林雪,李 軍,胡家瑋,等.同步硝化反硝化系統(tǒng)中反硝化細(xì)菌多樣性研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(1):116-121.

[21] Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms [J]. Advances in Microbial Physiology, 1971,6(6): 1-46.

[22] Caroline S H and Rebecca E P. The β-ketoadipate pathway and the biology of self-identity [J]. Annual Review of Microbiology, 1996,50:553-590.

[23] Limpiyakorn T, Kurisu F, Sakamoto Y, et al. Effects of ammonium and nitrite on communities and populations of ammonia-oxidizing bacteria in laboratory-scale continuous-flow reactors [J]. Fems Microbiology Ecology, 2007,60(3):501-512.

[24] Lapara T M., Ghosh S. Population dynamics of the ammonia-oxidizing bacteria in a full-scale municipal wastewater treatment facility [J]. Environmental Engineering Science, 2006,23(2):309-319.

[25] Limpiyakorn T, Shinohara Y, Kurisu F, et al. Communities of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge of various sewage treatment plants in Tokyo [J]. Fems Microbiology Ecology, 2006,54(2):205-217.

[26] 辛?xí)詵|.運(yùn)行條件對(duì)MBR膜污染調(diào)控的微生物學(xué)研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013.

Analysis of microbial community structure in different partial nitrification system.

HOU Ai-yue, LI Jun*, BIAN Wei, WANG Meng, ZHENG Lin-xue, ZHANG Yan-zhuo, ZHAO Xin-yan (Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China). China Environmental Science, 2016,36(2)：428～426

Abstract：In order to study the influences of organic carbon source on the microbial community structure in partial nitrification system, the microbial diversity was investigated in two partial nitrification reactors by the construction of bacterial clone library. The influents of two reactors were artificial wastewater with and without organic carbon source, respectively. The results indicated that Proteobacteria and uncultured bacterium were the dominant bacteria of the two studied systems. The differences existed in the structure of the bacterial community of the two systems. Nonetheless, the dominant bacteria and their proportions were similar to each other in the total clones. In addition, the main denitrifer groups were also similar in the two systems. Due to the different concentrations of organic carbon source, the denitrifer genera and their proportions were distinct. The main denitrifer genera of partial nitrification reactor with inorganic wastewater were Nitrosomonas, Nitrospira and Denitratisoma. The proportion of autotrophic nitrifying bacteria in partial nitrification reactor with inorganic wastewater was higher than that with organic wastewater. But in the reactor with inorganic wastewater, the proportion of autotrophic bacteria was lower than heterotrophic bacteria. The main denitrifer genera of partial nitrification reactor with organic wastewater were some denitrifying bacteria of β-Proteobacteria and Nitrosomonas. Additionally, the proportion of the latter in this reactor was relatively low.

Key words：organic carbon；partial nitrification；clone library；microbial community structure

作者簡介：侯愛月(1990-),女,河北張家口人,北京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事污水生物處理研究.

基金項(xiàng)目：國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014ZX07201-011)

收稿日期：2015-07-10

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)02-0428-09