一株降解嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的篩選與鑒定

余祖華，丁 軻,*，劉賽寶，李亞菲，李 旺，李元曉，曹平華，劉一塵，孫二剛（.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 4700；.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 4700；.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500）

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一株降解嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的篩選與鑒定

余祖華1,2，丁 軻1,2,*，劉賽寶1，李亞菲2，李 旺1，李元曉1，曹平華1，劉一塵2，孫二剛3
（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；3.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500）

摘 要：目的：分離篩選能夠降解嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）的芽孢桿菌，以用于該毒素的生物降解。方法：采集霉變秸稈、土壤和糞便樣品，先將樣品加熱80 ℃后，取上清液接種到以DON為唯一碳源的分離培養(yǎng)基富集DON降解菌。以LB培養(yǎng)基分離純化富集菌，然后對分離到的菌株進行DON毒素降解能力檢測。對降解能力最強的菌株進行形態(tài)學觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列鑒定。結(jié)果：從16 株分離菌中篩選得到一株對DON降解能力最強的菌株B.JG05，降解率最高可達80.61%，且對含DON飼料的降解率為82.68%。該菌株呈短桿狀，能形成芽孢；生理生化特性符合蠟樣芽孢桿菌的基本特征；16S rDNA序列進化樹分析表明該菌株與蠟樣芽孢桿菌的親緣關系最近。結(jié)論：篩選獲得了一株高效降解DON的蠟樣芽孢桿菌B.JG05，為飼料和食品中DON毒素的生物降解提供了可能。

關鍵詞：嘔吐毒素；蠟樣芽孢桿菌；降解；篩選；鑒定

河南科技大學大學生研究訓練計劃（SRTP）項目（2013251）

引文格式：

余祖華,丁軻,劉賽寶,等.一株降解嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的篩選與鑒定[J].食品科學,2016,37(5):121-125.

YU Zuhua,DING Ke,LIU Saibao,et al.Screening and identification of a Bacillus cereus strain able to degradate deoxynivalenol[J].Food Science,2016,37(5):121-125.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605022.http://www.spkx.net.cn

嘔吐毒素，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化學名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[1]。該毒素在糧谷類原料中污染較為普遍，可嚴重影響谷物的產(chǎn)量和質(zhì)量，進入食物鏈后可對消化道黏膜產(chǎn)生強烈的刺激反射而作用于嘔吐中樞，從而引起食欲減退，影響生產(chǎn)性能[2-3]；DON可影響免疫細胞的增殖、凋亡和免疫細胞因子的生成，從而降低機體的免疫力[4]；DON具有細胞毒性，能夠抑制mRNA的翻譯、p38和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶活性，從而加速細胞死亡[5-6]。畜禽對DON比較敏感，尤其是豬，飼料中DON超過5 mg/kg時就會拒食，超過14 mg/kg時就會出現(xiàn)嘔吐，種畜服用后會引起流產(chǎn)[7]。因此，國家標準規(guī)定家禽飼料中DON的限量應＜5 mg/kg，豬飼料中DON的限量應＜1 mg/kg[8]。所以降解谷物等原料中的DON對于人和畜禽的健康非常重要。

微生物作為大自然的分解者，可以分解自然界的任何物質(zhì)，因此，開發(fā)微生物降解DON具有非常重要的意義。前人也曾在這方面做過一些研究探討[9-10]，但對于芽孢桿菌降解DON的報道還很少。因為芽孢桿菌作為一種抗逆性最好的菌株，又可產(chǎn)各種消化酶以及抗菌物質(zhì)，所以在人畜上是應用最廣泛的益生菌之一。篩選具有降解DON的芽孢桿菌將會獲得多功能菌株，將可利用單一菌株發(fā)酵獲得多種功能產(chǎn)物。所以本實驗的目的是分離一株能夠高效降解DON的芽孢桿菌，為利用該菌株去除禾谷原料中或發(fā)酵產(chǎn)品中的DON毒素奠定基礎，從而保證人畜的食品和飼料安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

從河南不同地方采集霉變的禾谷秸稈及其下層土壤、不同動物的糞便等樣品85 份。

DON（純度99%） 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；DON酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 北京華安麥科生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、基因組抽提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；微量生化發(fā)酵管 杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 1 g、KH2PO41 g、葡萄糖1 g、DON 0.05 g，加水至1 L，調(diào)pH值至7.0。

基礎鹽培養(yǎng)基：K2HPO42.5 g、KH2PO41.2 g、NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、Ca(NO3)2·4H2O 0.4 g、NaCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.001 g，加水至1 L，pH 7.0。

營養(yǎng)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.3儀器與設備

Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo公司；9700型PCR儀 美國ABI公司；GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1樣品的處理

每個樣品各取1 g左右加入到3 mL生理鹽水中，80 ℃加熱10 min，除去不耐熱菌。

1.4.2降解DON菌株的富集

將處理過的樣品各取0.1 mL加入到5 mL的富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。

1.4.3降解DON菌株的篩選

取富集培養(yǎng)液200 μL，于3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL生理鹽水混勻后涂于含100 μg/mL DON的基礎鹽培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基進行純化。純化的菌株進行革蘭氏染色，篩選能形成芽孢的菌株。

1.4.4不同菌株DON降解率的測定

1.4.4.1菌株DON降解實驗

取上述純化的菌株，分別按1%接種于含0.1 mg/mL DON的基礎鹽培養(yǎng)基，每株菌培養(yǎng)3 管，37 ℃振蕩培養(yǎng)，于72 h取樣檢測。

1.4.4.2發(fā)酵液中DON的殘留量及降解率計算

各取培養(yǎng)液1 mL，3 000 r/min離心5 min，分離上清液為待測液。然后按照DON ELISA檢測試劑盒說明書檢測上清液中DON的殘余量，同時以未接菌的含0.1 mg/mL DON的基礎鹽培養(yǎng)基為陽性對照，培養(yǎng)條件與實驗組相同。每個菌株做3 個重復，計算平均值。按照下列公式計算DON的降解率。

式中：ρ0為陽性對照組的DON殘留量/（mg/mL）；ρn為每個菌株發(fā)酵液中的DON殘留量/（mg/mL）。

1.4.5分離菌株的鑒定

取上述降解率最高的菌株，分別通過生理生化和分子生物學進行鑒定。

1.4.5.1菌株的生理生化實驗

參照文獻[11]對菌株進行生理生化實驗，包括硝酸鹽還原、明膠液化、硫化氫產(chǎn)生各種糖利用等。

1.4.5.2菌株16S rDNA序列擴增與分析

根據(jù)桿菌科的16S rDNA序列設計一對引物，P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，P2：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。按照基因組抽提試劑盒提取的菌體基因組為模板，PCR反應體系如下：上下游引物（10 mol/L）各1.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（10 mol/L）1 μL，MgCl22 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 1 μL，加超純水至50 μL。反應參數(shù)：95 ℃預熱3 min；95 ℃解鏈50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min，于4 ℃保存。取5 μL產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，與預期大小相符的PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果提交到GenBank中進行BLAST比對，選取相似性較高的序列，利用MEGA4.0軟件包中的Kimura2-parameter法計算遺傳距離，用鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.6菌株B.JG05對飼料中DON的降解

稱取常規(guī)飼料600 g，高壓滅菌后向其中加入DON毒素至終水平20 mg/kg，充分混勻后平均分成6 份，設兩個處理，每個處理3 個重復，第1個處理為對照組，每個重復加入90 mL 水＋10 mL LB培養(yǎng)基；第2個處理為實驗組，每個重復加入90 mL水＋10 mL LB培養(yǎng)基（含B.JG05菌濃度為107CFU/mL），同時放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24、36、48、60、72、84、96 h各取樣0.2 g，按照DON ELISA檢測試劑盒說明書利用甲醇提取飼料中的DON，檢測DON的殘留量。

2　結(jié)果與分析

2.1降解DON菌株的分離篩選

樣品中的特異性菌株富集后，在以DON為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)基上進行分離，再通過劃線純化培養(yǎng)，最終初步分離出16 株菌。將這些菌進行革蘭氏染色，均為G＋菌，篩選出能產(chǎn)芽孢的菌株14 株，且均呈短桿狀，單個或鏈狀排列，芽孢有的中生，有的端生（部分顯微形態(tài)見圖1）。分離自秸稈的編號為B.JG01、B.JG02、 B.JG03、B.JG04、B.JG05、B.JG06、B.JG07；分離自土壤的編號為B.TR01、B.TR02、B.TR03；分離自豬糞便的編號為B.ZF01、B.ZF02、B.ZF03；分離自牛糞便的編號為B.NF01。這些菌株能夠在以DON為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)基上生長，說明這些菌株均能以DON為營養(yǎng)進行分解利用，即均具有DON降解能力。

2.2不同菌株DON降解率測定結(jié)果

將14 株分離菌接種到含有DON的培養(yǎng)基中進行過培養(yǎng)發(fā)酵，取發(fā)酵后的培養(yǎng)液測定其中DON的殘留量。由表1可知，所分離的菌株對DON均有不同程度的降解能力，但不同樣品來源的菌株對DON的降解率差異較大，來源于秸稈和土壤樣品中的分離菌株對DON的降解效果較好，其中分離自秸稈的菌株B.JG05對培養(yǎng)基中DON的降解率最高可達80.61%，因此選擇該菌株做進一步鑒定。

表1　不同菌株對DON降解率Table 1 Degradation efficiencies of different isolates for DON

2.3菌株B.JG05生理生化特性

菌株B.JG05的生理生化特性見表2，該菌株能夠分解淀粉，明膠液化、接觸酶、硝酸鹽還原、H2S產(chǎn)生等實驗均為陽性，可利用葡萄糖、乳糖、果糖、鼠李糖、木糖等，不能利用纖維素、棉子糖。參照文獻[11]可以發(fā)現(xiàn)，以上特征與芽孢桿菌屬極為相似。

表2　菌株B.JG05生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain B.JG05

2.4菌株B.JG05的16S rDNA序列擴增結(jié)果

以菌株B.JG05基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物電泳，在約1 500 bp處有一條特異性條帶，與預期大小相符，見圖2。測序結(jié)果也表明該菌株的16S rDNA序列長度為1 436 bp。將該序列提交到GenBank獲得登錄號為KR078342。

圖2　菌株B.JG05 的16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA sequence from B.JG05

2.5基于16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分析

圖3　基于Neighbor-Joining 法構(gòu)建B.JG05的 16S rDNA序列遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on 16S rDNA sequences from B.JG05 and other 17 reference strains by Neighbor-Joining method

將2.4節(jié)序列提交到GenBank進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與芽孢桿菌屬具有較高的同源性，選取序列同源性在98%以上具有代表性的菌株17 株，通過MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示菌株B.JG05與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides）和球形芽孢桿菌（Bacillus sp.）處于同一主分支，但從遺傳距離分析與蠟樣芽孢桿菌的親緣關系更近，因此，將菌株B.JG05鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

2.6菌株B.JG05對飼料中DON的降解

圖4　菌株B.JG05不同發(fā)酵時間對飼料中DON的降解Fig.4 Degradation of DON in feed by B.JG05 strain at different fermentation time

采用ELISA法檢測各處理組飼料中DON的殘留量，結(jié)果如圖4所示，對照組樣品中DON的量基本上沒有變化，而加入菌株B.JG05的樣品，隨著發(fā)酵時間的延長DON的量逐漸減少，0～48 h，樣品中DON的量呈直線下降，48～60 h，DON的量緩慢下降，60 h以后DON的量基本沒有變化。所以，從飼料樣品中的DON的降解曲線看，樣品在60 h時即可達最大降解率82.68%。

3 討論與結(jié)論

嘔吐毒素是食品和飼料原料中僅次于黃曲霉毒素的最常見的真菌毒素之一，在小麥、玉米和大豆等常規(guī)糧食中普遍存在，嚴重影響了人畜安全。歐洲4 000 例樣品中DON檢出率為57%，且含量為0.91～5 mg/kg[12]；2012年對中國飼料和原料調(diào)查發(fā)現(xiàn)DON陽性率高達93%[13]。2007年Binder等[14]對亞太地區(qū)釆集的1 290 份代表性樣品分析發(fā)現(xiàn)，DON的檢出率達71%，其中毒素含量最高的樣品來自中國的小麥，其DON含量為18.99 mg/kg，超標近18 倍。2009年樊平聲等[15]對南京市場上隨機抽取的74 份小麥食品（包括方便面、餅干、面包和蛋糕等）中DON的含量進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有37 份樣品中DON的含量高于1 mg/kg的限量標準。而且由于DON比較穩(wěn)定，食品和飼料的加工過程不僅不能破壞DON，而且還存在毒素濃縮效應[16-17]。目前還有許多研究者正在研究將玉米秸稈發(fā)酵后作為粗飼料原料，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)曝曬過的秸稈中的DON含量最高可達20 mg/kg，即使能將纖維素降到可用階段，而由于DON含量遠遠超標也無法應用。因此，DON已嚴重威脅了食品安全和人畜健康，必須采用合適的方法將其中的DON降解或去除才能消除其危害。

對于DON的降解，傳統(tǒng)的物理法，如硅鋁酸鹽（膨潤土、蒙脫石、高嶺土） 、活性炭等只是采用微顆粒吸附或螯合，并不能從根本上消除DON，吸附效率也不理想，而且經(jīng)人畜排出后會在土壤中重新分解造成二次污染[18-19]；化學反應法需要應用大量的酸或堿，不僅會破壞原料的營養(yǎng)，而且也會造成二次污染[20-21]。所以最理想的方法是通過微生物發(fā)酵降解，但關于這方面的報道并不多見。徐劍宏等[22]分離獲得了一株德沃斯氏菌DDS-1，對飼料中的DON降解率可達75.47%，程亮等[23]分離鑒定了一株假單胞桿菌對無機鹽培養(yǎng)基中的DON的降解率可達56.6%。Binder等[24]發(fā)現(xiàn)真菌DSM11789也能降解DON。Fuchs等[25]分離的真菌BBSH797后來被Biomin GmbH公司開發(fā)為降解飼料中DON的菌株。本實驗采用DON為唯一碳源對多種來源的樣品進行分離，通過平板篩選，ELISA檢測，初步分離出14 株能夠降解DON的菌株，從降解效率上分析，來自秸稈和土壤樣品的菌株的降解效果相對較好，可能是因為這類樣品中的DON的含量較高，通過自然共生或長期馴化導致其能夠大量降解樣品中的DON。分離篩選出的降解DON效果最好的菌株B.JG05，對無機鹽培養(yǎng)基中的DON降解率可高達80.61%，而對飼料中DON，采用該菌株發(fā)酵60 h后降解率可達82.68%，可能是在營養(yǎng)豐富的條件下，菌株的生長速率較快，能夠充分與DON接觸，從而能更有效地降解DON。另外本實驗還發(fā)現(xiàn)，飼料經(jīng)發(fā)酵后，總質(zhì)量損耗約5.2%，所以該菌株對DON的降解效率理論上比檢測值還要更高。從菌株B.JG05對無機鹽培養(yǎng)基和飼料中DON的降解效果來看，該菌株完全可以用于其他任何需要芽孢桿菌發(fā)酵的食品、飼料或秸稈中DON的降解。通過形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA序列鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌。下一步將對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化以更進一步提高其降解效率。同時進行毒性實驗，若無毒，則可直接將其用于食品或飼料的發(fā)酵，在獲得發(fā)酵產(chǎn)品的同時又可除去原料中的DON，而不再需要二次處理，可簡化工藝過程，節(jié)約成本，提高產(chǎn)品品質(zhì)，有望開發(fā)為一種高效的防霉菌添加劑。還將進一步分析菌株B.JG05降解DON后的分解產(chǎn)物，探討其生物降解機理。

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Screening and Identification of a Bacillus cereus Strain Able to Degradate Deoxynivalenol

YU Zuhua1,2,DING Ke1,2,*,LIU Saibao1,LI Yafei2,LI Wang1,LI Yuanxiao1,CAO Pinghua1,LIU Yichen2,SUN Ergang3
(1.Hongxiang Biological Feed Laboratory,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;
2.Animal Disease and Public Safety Academician Workstation of Henan Province,Luoyang 471003,China; 3.Henan Hongxiang Biotechnology Co.Ltd.,Ruzhou 467500,China)

Abstract:Objective:To isolate and identify a Bacillus strain used for biodegradation of deoxynivalenol(DON).Methods:Samples of moldy straw,soil and faeces were collected and heated to 80 ℃.The supernatant was inoculated into an isolation medium with DON as the sole carbon source to enrich DON-degrading strains.The enriched strains were isolated and purified on LB medium plates,and then the isolates were detected for their ability to degrade DON.The optimal strain was identified by morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequences.Results:The optimal strain B.JG05 was screened out of 16 isloates,which could degrade up to 80.61% of DON in inorganic salt medium.The degradation efficiency of DON in feed by B.JG05 was 82.68%.The strain B.JG05 was a rod-shaped and sporeforming bacterium.Its physiological and biochemical characteristics were consistent with those of Bacillus cereus,and the phylogentic tree analysis based on 16S rDNA sequence showed that it was the most close to Bacillus cereus.Conclusion:The strain B.JG05 with high DON degradation capacity was identified as Bacillus cereus,and it could off er a basis for the biodegradation of DON in feed or food.

Key words:deoxynivalenol; Bacillus cereus; degradation; screening; identification

中圖分類號：Q939.99

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0121-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605022 10.7506/spkx1002-6630-201605022.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：丁軻（1977—），男，副教授，博士，主要從事動物微生態(tài)與動物傳染病學研究。E-mail：keding19@163.com

作者簡介：余祖華（1977—），女，講師，博士，主要從事動物微生態(tài)與動物傳染病學研究。E-mail：yzhd05@163.com

基金項目：河南省科技廳重大科技攻關項目（131100110300）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B230002）；

收稿日期：2015-04-13