4 種鄰苯二甲酸酯塑化劑人工抗原的合成及免疫檢測(cè)

賴 丹，鄭盛武，趙肅清（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

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4 種鄰苯二甲酸酯塑化劑人工抗原的合成及免疫檢測(cè)

賴 丹，鄭盛武，趙肅清*
（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

摘 要：以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，衍生合成4 種結(jié)構(gòu)類似物，并分別通過重氮化法和活潑酯法與載體蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯(lián)制得人工抗原。利用紫外光譜掃描和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）檢測(cè)鑒定人工抗原，并用4 種與BSA偶聯(lián)的人工抗原作免疫原免疫新西蘭大白兔。利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)抗體靈敏度和特異性。經(jīng)紫外光譜和SDS-PAGE證實(shí)人工抗原偶聯(lián)成功，經(jīng)免疫分析法檢測(cè)抗體效價(jià)，4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA，DBAP-BSA）抗體效價(jià)達(dá)到1∶64 000，4-戊二單酰鄰苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA，DBCP-BSA）、4-氨基鄰苯二甲酸二異丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA，DiBAP-BSA）和4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA，DCHAP-BSA）抗體效價(jià)均達(dá)到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分別對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、DBP、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）和鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）4 種抗體的IC50值為0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之間交叉反應(yīng)率低，反應(yīng)特異性較好。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯；人工抗原；抗體

引文格式：

賴丹,鄭盛武,趙肅清.4 種鄰苯二甲酸酯塑化劑人工抗原的合成及免疫檢測(cè)[J].食品科學(xué),2016,37(5):114-120.

LAI Dan,ZHENG Shengwu,ZHAO Suqing.Synthesis of artificial antigens for immunoassay of four phthalate esters[J].Food Science,2016,37(5):114-120.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605021.http://www.spkx.net.cn

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）又稱鈦酸酯、塑化劑，該類化合物一般為無色油狀黏稠液體，易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水，凝固點(diǎn)低，常溫不易揮發(fā)[1]。鄰苯二甲酸酯是重要的有機(jī)化工產(chǎn)品，目前在工業(yè)上主要用作聚氯乙烯等橡膠材料的增塑劑和軟化劑，使用量約占全部增塑劑消費(fèi)量的70%左右[2]。鄰苯二甲酸酯與產(chǎn)品基質(zhì)間通過氫鍵和范德華力結(jié)合，容易隨著時(shí)間的推移，慢慢從塑料中遷移到周圍環(huán)境，特別是在高溫環(huán)境下更易向牛奶、肉類等含油脂性食品中遷移[3]。研究表明，PAEs是一種具有生殖毒性和遺傳毒性的環(huán)境激素，對(duì)人體有致畸形、致癌、致突變等影響[4]。Pogribny 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，給飼養(yǎng)中的雄性大鼠喂食鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）后，會(huì)導(dǎo)致大鼠體內(nèi)過氧化物酶體的增生，新陳代謝改變等，誘導(dǎo)腫瘤形成和肝細(xì)胞發(fā)生癌變。O’brien等[6]對(duì)聚丙烯（polypropylene，PP）塑料中鄰苯二甲酸酯向橄欖油中的遷移進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高鄰苯二甲酸酯的遷移量增大，時(shí)間延長(zhǎng)遷移也逐漸增加。

目前對(duì)鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）[10]等。但這些方法需要昂貴的儀器，復(fù)雜的操作，樣品前處理復(fù)雜，不適用于大量樣品的快速檢測(cè)[11]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)免疫分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸酯的報(bào)道較少。免疫分析法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、分析容量大、檢測(cè)成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足簡(jiǎn)單、快速、靈敏檢測(cè)鄰苯二甲酸酯的要求[12]。國(guó)外研究者利用免疫分析法主要側(cè)重于鄰苯二甲酸酯塑化劑對(duì)動(dòng)物體毒理性質(zhì)的研究。如Shea[13]研究了DEHP和鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DINP）對(duì)兒童健康的影響。國(guó)內(nèi)工作者利用免疫分析法主要側(cè)重于塑化劑抗原抗體的制備及樣品中塑化劑含量的測(cè)定。如Wei Chenxi等[14]采用將半抗原直接包被于聚苯乙烯微量滴定板上的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法來檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）。目前還未有從塑化劑的空間結(jié)構(gòu)來探討對(duì)抗體靈敏度的影響的研究。

本研究以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，通過酯化、還原反應(yīng)改造衍生，合成了4 種不同結(jié)構(gòu)的半抗原衍生物，分別經(jīng)過重氮化法和活性酯法與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯(lián)反應(yīng)，合成8 種人工抗原，為進(jìn)一步建立免疫分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸酯塑化劑提供可靠的免疫原。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

4-硝基鄰苯二甲酸（純度≥99%） 百靈威化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、鹽酸 天津大茂化學(xué)試劑有限公司；二環(huán)乙基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、牛血清白蛋白（BSA，98.6%）、卵清蛋白（OVA，98%）、弗氏完全佐劑與不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP二抗 武漢博士德生物工程有限公司；脫脂奶粉、四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 廣州威佳生物科技有限公司；SPF級(jí)雌性新西蘭大白兔 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；96孔可拆酶標(biāo)板 廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司。

包被緩沖液（0.1 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）：Na2CO30.75 g、NaHCO31.46 g，加蒸餾水至500 mL；封閉液：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer，PBS）；洗滌緩沖液（PBS containing 0.05% Tween 20，PBST）：含0.05%吐溫-20 的0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液；抗體稀釋液：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%脫脂奶粉的PBS溶液；底物緩沖液（pH 5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液）：0.2 mol/L Na2HPO425.7 mL、0.1 mol/L檸檬酸24.3 mL、蒸餾水50 mL；底物緩沖液10 mL：10 mg TMB溶于5 mL無水乙醇；終止液（2 mol/L H2SO4）：10.9 mL 98%的濃硫酸加89.1 mL蒸餾水。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1901紫外-可見分光光度儀 北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；RT-2100C型酶標(biāo)儀 雷杜生命科學(xué)股份有限公司；AUY220電子天平 日本島津公司；DF-101S型磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1半抗原衍生物的合成

稱取20 g（0.095 mol）4-硝基鄰苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，攪拌下加入3.3 mL濃H2SO4催化，120 ℃攪拌回流7 h后，蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的水。趁熱倒入冰水中，油狀粗品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% Na2CO3洗滌至水層無色（pH值為7～8）后，分離出油狀物，用無水乙醇溶解除去不溶物，加熱后除去少量乙醇，趁熱置冰箱中冷卻，得到黃色油狀液體。同理合成異丁酯和二環(huán)己酯時(shí)，只需將正丁醇用異丁醇和環(huán)己醇代替即可。

利用H2還原硝基，鈀碳催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl 4-aminophthalate，DBAP）、4-氨基鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl 4-aminophthalate，DiBAP）和4-氨基鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl 4-aminophthalate，DCHAP）。再將部分DBAP與戊二酸酐反應(yīng)，經(jīng)分離提純后得到黃色油狀液體4-戊二單酰鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl 4-carboxylphthalte，DBCP）。4 種半抗原衍生物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1　4 種半抗原衍生物結(jié)構(gòu)式圖Fig.1 Structures of hapten derivatives

1.3.2人工抗原的合成

參照參考文獻(xiàn)[15]，將DBAP、DiBAP和DCHAP利用重氮化法分別與載體蛋白BSA偶聯(lián)。參照參考文獻(xiàn)[16]，將DBCP與BSA利用DCC法進(jìn)行偶聯(lián)。由此得到免疫原偶聯(lián)物DBAP-BSA、DiBAP-BSA、DCHAP-BSA和DBCP-BSA。

包被抗原的制備步驟與上同，只是用OVA代替BSA作載體蛋白。

1.3.34種分子與BSA偶聯(lián)物的鑒定

1.3.3.1紫外分光光度計(jì)法鑒定

利用PBS調(diào)零，分別將稀釋到一定濃度的半抗原衍生物、BSA、OVA、4 種免疫原和4 種包被原在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。并以紫外分光光度法估算偶聯(lián)物的結(jié)合比[17]。

1.3.3.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）鑒定[18-19]

配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，取10 μL樣品溶液與上樣緩沖液的混合液上樣。濃縮膠電壓60 V，待指示劑移動(dòng)到分離膠后，將電壓升至120 V，待指示劑接近分離膠下端邊緣后關(guān)閉電源。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色20 min，用乙酸-甲醇水溶液脫色，直至背景脫凈，期間換液數(shù)次。

1.3.4動(dòng)物免疫

以BSA偶聯(lián)物作免疫原，用PBS（pH 7.4）溶液稀釋至1 mg/mL，稀釋液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，對(duì)8 只成年健康雌性新西蘭大白兔進(jìn)行背部多點(diǎn)注射和肌肉注射。用DBAP-BSA免疫1號(hào)和2號(hào)兔子，DBCP-BSA免疫3號(hào)和4號(hào)兔子，DiBAP-BSA免疫5號(hào)和6號(hào)兔子，DCHAP-BSA免疫7號(hào)和8號(hào)兔子。3 周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐劑，以后每隔兩周免疫一次，免疫后第7～10天耳緣靜脈取血。

1.3.5間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）條件的優(yōu)化

為建立高性能的icELISA分析法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫分析實(shí)驗(yàn)中部分重要反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要有包被抗原、抗體、二抗的反應(yīng)濃度，包被抗原的包被時(shí)間，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間，二抗反應(yīng)時(shí)間，緩沖溶液的pH值以及離子強(qiáng)度等。

1.3.6血清抗體的間接ELISA（indirect ELISA，iELISA）檢測(cè)

采用i ELISA檢測(cè)血清的效價(jià)，當(dāng)陽性血清的OD450 nm值≥陰性對(duì)照孔的2.1 倍并且陽性血清的OD450 nm值大于0.1時(shí)，此時(shí)血清的稀釋倍數(shù)即為血清的效價(jià)。采用條件優(yōu)化后的icELISA[20]檢測(cè)抗體靈敏度。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。

1.3.7交叉反應(yīng)

與半抗原有著共同結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì)也有可能與抗體反應(yīng)結(jié)合，造成假陽性的現(xiàn)象，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為解決這個(gè)問題，可以通過抗體與抗原類似物交叉反應(yīng)的大小來表征該酶聯(lián)免疫反應(yīng)的特異性。采用icELISA法測(cè)定8 種塑化劑結(jié)構(gòu)類似物IC50的濃度，計(jì)算各類似物與多克隆抗體的交叉反應(yīng)率[21-22]。

2　結(jié)果與分析

2.1人工抗原的紫外光譜鑒定

經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)掃描，得到半抗原衍生物、載體蛋白和人工抗原的紫外光譜圖，結(jié)果見圖2。偶聯(lián)的每個(gè)人工抗原的特征吸收峰均有位移和峰增強(qiáng)的現(xiàn)象，與相應(yīng)的半抗原衍生物和蛋白的特征吸收峰既有區(qū)別又有聯(lián)系，由此可以說明人工抗原偶聯(lián)成功。根據(jù)紫外分光光度法估算人工抗原的偶聯(lián)比分別為DBAPBSA（15∶1）、DBAP-OVA（19∶1）、DBCP-BSA （14∶1）、DBCP-OVA（19∶1）、DiBAP-BSA （16∶1）、DiBAP-OVA（21∶1）、DCHAP-BSA （16∶1）、DCHAP-OVA（19∶1）。

圖2　人工抗原紫外光譜分析鑒定Fig.2 Ultraviolet scanning of artificial antigens

2.2SDS-PAGE分析鑒定

人工抗原及蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，人工抗原的條帶均與載體蛋白的不同，相比于載體蛋白的條帶發(fā)生滯后的現(xiàn)象，這說明人工抗原的分子質(zhì)量均比載體蛋白的分子質(zhì)量大。由此可推斷，半抗原衍生物與載體蛋白偶聯(lián)成功。

圖3　人工抗原的SDS-PAGEE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE patterns of artificial antigens

2.3icELISA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果分析

4 種包被抗原經(jīng)方陣滴定法確定最佳包被質(zhì)量濃度除DCHAP-OVA為1 μg/mL外，其他均為2 μg/mL，DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA、DCHAP-BSA血清稀釋度分別為1∶4 000、1∶32 000、1∶8 000、1∶6 000。二抗加入量的優(yōu)化如圖4所示，二抗的稀釋度除DBAP-BSA （1∶3 000）外，其他均為1∶4 000時(shí)最佳。包被抗原包被時(shí)間經(jīng)優(yōu)化后均為37 ℃反應(yīng)1 h較好?？乖贵w反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果見圖4，DBAP-BSA為3 h，DiBAP-BSA為2.5 h，DBCP-BSA和DCHAP-BSA均為2 h。由二抗反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果得知均為3 h最佳。緩沖溶液的pH值均為7.5，即反應(yīng)在中性條件下進(jìn)行較好，如圖4所示。PBS緩沖溶液的濃度均為0.01 mol/L較好。

圖4　icELISA中重要反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of important icELISA conditions

2.4血清效價(jià)檢測(cè)

對(duì)每只兔子進(jìn)行5 次免疫后耳緣靜脈取血，經(jīng)過離心得到抗血清，采用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果見表1。注射DBAP-BSA抗原的兩只兔子血清效價(jià)均達(dá)到1∶64 000，而注射DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA抗原的6 只兔子的血清效價(jià)均達(dá)到1∶128 000。

表1　血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Detection results of serum titers(n　=　3)

2.5抑制曲線的繪制

根據(jù)上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，利用icELISA法測(cè)定加入一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后的OD450 nm值，標(biāo)準(zhǔn)品分別為DBP、DBP、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）和鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP），測(cè)定半抑制濃度（IC50），繪制線性工作曲線，結(jié)果如圖5所示，4 種抗體的IC50值分別為：DBAP-BSA（0.305 μg/mL）、D B C P - B S A（0 .2 6 8 μ g/m L）、D i BA P - B S A （0.104 μg/mL）、DCHAP-BSA（0.247 μg/mL）。最低檢測(cè)限分別為：DBAP-BSA（52.9 ng/mL）、DBCP-BSA （35.5 ng/mL）、DiBAP-BSA（8.7 ng/mL）、DCHAP-BSA（11.9 ng/mL）。最佳工作范圍分別為：DBAP-BSA（81.960～1 138.037 ng/mL）、DBCPBSA（55.720～832.945 ng/mL）、DiBAP-BSA （16.753～857.328 ng/m L）、DCHAP-BSA （63.997～1 222.221 ng/mL）。

圖5　4 種抗體的線性工作曲線Fig.5 Linear working curves

2.6交叉反應(yīng)結(jié)果

通過交叉反應(yīng)檢測(cè)抗體特異性，其交叉反應(yīng)率見表2。4 種抗體除與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)外，其他的塑化劑結(jié)構(gòu)類似物與對(duì)應(yīng)抗體的交叉反應(yīng)率均小于5%。可能是由于DBP和DBAP有著共同的結(jié)構(gòu)，即苯環(huán)均連接了兩個(gè)丁酯，這個(gè)結(jié)構(gòu)起著抗原決定簇的功能，所以兩者均容易被抗體DBAP-BSA和DBCP-BSA識(shí)別，以至于DBP與抗體DBAP-BSA的交叉反應(yīng)率為90.5%，DBAP與抗體DBCP-BSA的交叉反應(yīng)率為82.6%，兩者與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于5%。由此說明得到的4 種抗體的特異性較好。

表2　塑化劑抗體與相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross-reactivity of the antibodies against related compounds %

3　討 論

鄰苯二甲酸酯類塑化劑是重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于生活中。因其具有生殖毒性和遺傳毒性，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害。尤其在“臺(tái)灣塑化劑事件”[23]和“白酒塑化劑食品安全風(fēng)波”[24]后，我國(guó)對(duì)塑化劑指標(biāo)也進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)管。目前，酶聯(lián)免疫分析方法已被廣泛應(yīng)用于PAEs的快速檢測(cè)，而要建立高靈敏的ELISA法關(guān)鍵在于制備特異性強(qiáng)的抗體。歸根結(jié)底，即使用的人工抗原應(yīng)充分暴露出半抗原的表征結(jié)構(gòu)[25-27]。

本實(shí)驗(yàn)分別合成了DBAP、DBCP、DiBAP和DCHAP 這4 種半抗原衍生物結(jié)構(gòu)類似物，利用偶聯(lián)制得相應(yīng)的人工抗原對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，得到4 種抗體，并對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)優(yōu)化，可知：1）DBAP-BSA抗體的最低檢測(cè)限（52.9 ng/mL）最大，但與Xu Fei等[28]的研究結(jié)果64.5 ng/mL比較相近。由此說明實(shí)驗(yàn)所獲得的4 種抗體具有可行性。2）DBAP-BSA抗體效價(jià)低于其他3 種抗體，其血清稀釋度最小，二抗使用量略高，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，最后得到的IC50值最大，其次是DBCP-BSA和DCHAP-BSA抗體，DiBAP-BSA抗體IC50最小。從結(jié)構(gòu)上分析可能原因：具有支鏈結(jié)構(gòu)的抗原更容易得到特異性強(qiáng)的抗體；DBCP特征結(jié)構(gòu)的空間位阻大，所以DCHAP-BSA抗體的IC50值比DiBAP-BSA抗體大；DBCP具有5 個(gè)碳的伸長(zhǎng)臂，比DBAP更好地將特征結(jié)構(gòu)暴露，所以DBCP-BSA抗體的特異性比DBAP-BSA抗體強(qiáng)。本研究合成的4 種塑化劑結(jié)構(gòu)類似物，對(duì)下一步抗體的制備及免疫分析檢測(cè)提供了可靠的免疫原。

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Synthesis of Artificial Antigens for Immunoassay of Four Phthalate Esters

LAI Dan,ZHENG Shengwu,ZHAO Suqing*
(School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China)

Abstract:Four hapten derivatives were obtained from 4-nitrophthalic acid through esterification and reduction.In order to prepare artificial antigens,the hapten derivatives were coupled with the carrier proteins bovine serum albumin(bovine serum albumin,BSA)and ovalbumin(OVA)by diazotization method and activated ester method respectively.The successful synthesis of artificial antigens was identified by ultraviolet spectroscopy(UV)and sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electroporesis(SDS-PAGE).New Zealand white rabbits were injected with each of the four artificial antigens coupled with BSA.The sensitivity and specificity of antibodies were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The results showed that the titer of DBAP-BSA(dibutyl 4-aminophthalate-BSA)antibody was 1:64 000 and the titers of all three other antibodies were 1:128 000.The IC50values of DBAP-BSA,DBCP-BSA(dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA),DiBAP-BSA(diisobutyl 4-aminophthalate-BSA)and DCHAP-BSA(dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA)against DBP(dibutyl phthalate),DBP,DiBP and DCHP were 0.305,0.268,0.104 and 0.247 mg/mL,respectively.The cross-reactivity with each other was small.Therefore,the antibodies had high sensitivity and specificity.The successful synthesis of four hapten derivatives made it possible to prepare polyclonal antibodies and establish immunoassay.

Key words:phthalic acid ester; artificial antigen; antibody

中圖分類號(hào)：TQ32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0114-07

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605021 10.7506/spkx1002-6630-201605021.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：趙肅清（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榭贵w制備及免疫分析。E-mail：sqzhao@gdut.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：賴丹（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：laidan820@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（41271340）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013040013021；S2013030013338）

收稿日期：2015-04-01