枯草芽孢桿菌木聚糖酶的克隆表達及其酶解兩種木聚糖的產(chǎn)物分析

韋露莎，吳一飛，陳 輝（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

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枯草芽孢桿菌木聚糖酶的克隆表達及其酶解兩種木聚糖的產(chǎn)物分析

韋露莎，吳一飛，陳 輝*
（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

摘 要：通過基因克隆方法獲得枯草芽孢桿菌木聚糖酶XynA，考察經(jīng)鎳離子親和柱純化后的XynA分別在樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖中的酶解情況，利用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）及基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）法鑒定木聚糖酶XynA的酶解產(chǎn)物。運用MALDI-TOF/MS分析枯草芽孢桿菌木聚糖酶XynA酶解樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖產(chǎn)物不同的聚合度寡糖的分布情況。結(jié)果表明：在樺木木聚糖酶解液中，產(chǎn)生的中性木寡糖主要為木二糖（X2）和木三糖（X3），酸性木寡糖聚合度為4～12，并且每一個酸性木寡糖上僅連接著一個甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈（MeG）。在毛櫸木木聚糖酶解液中，產(chǎn)生的中性木寡糖與在樺木木聚糖酶解液中相同，酸性木寡糖的結(jié)構(gòu)相似，聚合度為4～16。因此木聚糖酶XynA具有生產(chǎn)木二糖（X2）和木三糖（X3）以及酸性木寡糖（MeGXn）的功能。

關(guān)鍵詞：木聚糖內(nèi)切酶；低聚木糖；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜

引文格式：

韋露莎,吳一飛,陳輝.枯草芽孢桿菌木聚糖酶的克隆表達及其酶解兩種木聚糖的產(chǎn)物分析[J].食品科學(xué),2016,37(5):108-113.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605020.http://www.spkx.net.cn

WEI Lusha,WU Yifei,CHEN Hui.Cloning and expression of Bacillus subtilis xylanase and determination of hydrolysis products of two different xylans by it[J].Food Science,2016,37(5):108-113.(in Chinese with English abstract)

β-1,4-木聚糖內(nèi)切酶（endo-1,4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8）在降解木聚糖過程中發(fā)揮著重要的作用，它通常通過內(nèi)切方式水解木聚糖主鏈中的β-1,4-木糖苷鍵，從而將長鏈的木聚糖降解為低聚木糖，并常帶有甲基葡萄糖醛酸、阿拉伯呋喃糖等側(cè)鏈基團，在食品、農(nóng)業(yè)和紙漿制造工業(yè)中有著潛在的用途[1-2]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為一種非致病性的革蘭氏陽性菌，其分泌的木聚糖酶XynA歸屬于GH11（glycoside hydrolasesfamily 11）家族[3]，該酶在烘焙及釀造工業(yè)的應(yīng)用中能有效減少反應(yīng)處理時間并提高產(chǎn)物的質(zhì)量[4-5]。而通過研究該酶在木聚糖中酶解特性，能使其更好地利用半纖維資源來用于食品、藥品及保健品的生產(chǎn)[6-8]。

低聚木糖也稱為木寡糖，是一種新型的功能性的食品添加劑，在提高食物的質(zhì)量上有很大的潛能。作為一種非消化糖，它不會被唾液、胃液、胰液、腸液中的酶類所分解，可直達大腸被腸道內(nèi)的細菌所利用，因而被視為高效的雙歧桿菌增殖因子。它還可以改善食物本身的味道，其甜度與砂糖相似卻具有低致齲性及熱量較低的優(yōu)勢。一般認為低聚木糖（Xn）是由木二糖至木十糖等成分組成，糖鏈上不帶有側(cè)鏈基團，以木二糖和木三糖為主要功能因子的低聚糖[9-10]。而帶有甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈（MeG）的木寡糖則為酸性木寡糖（MeGXn），可應(yīng)用于治療膀胱炎的抗炎藥物和治療黏多糖貯積癥藥物的制備[11-13]。由于木寡糖或木多糖結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，或有各種不同支鏈的存在，無揮發(fā)性，無顯色基團，且具有熱不穩(wěn)定性，因此在結(jié)構(gòu)鑒定方面一直存在很大的難度，而基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）作為一種新型的分析糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，與傳統(tǒng)的凝膠排阻色譜法相比，可以迅速給出糖類物質(zhì)的準(zhǔn)確分子質(zhì)量，且由于所需樣品的量極少，靈敏度較高[14-15]，目前該技術(shù)已被成功應(yīng)用于大蒜寡糖與多糖、藻類多糖等的測定[16-17]。本實驗首先通過基因克隆的方法獲得木聚糖酶XynA，再利用該酶分別酶解樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖，最終利用MALDI-TOF/MS法確定酶解出的低聚木糖產(chǎn)物的聚合度分布情況。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）Rosetta 2、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168、質(zhì)粒（pET15b）為西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林微生物實驗室保存。

1.1.2試劑

限制性內(nèi)切酶、修飾酶、T4 DNA和LaTaqDNA聚合酶連接酶 美國NEB公司；酵母粉、蛋白胨和牛肉膏 英國Oxoid公司；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化回收試劑盒德國Qiagen公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA標(biāo)樣 美國Fermentas公司；PD-10除鹽柱 美國GE公司；鎳離子親和色譜柱 美國Bio-Rad公司；二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic）、樺木木聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和毛櫸木木聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）公布的枯草芽孢桿菌xynA基因序列設(shè)計1 對引物：上游引物：5’-ATGTCCCTC GAGAGCACAGACTACTGGCAAAATT-3’；下游引物：5’-CGATAAGGATCCCCTACCTCCAGCAATTCCAA-3’；上下游引物中下劃線部分分別為XhoI和BamHI酶切位點，引物由Sangon公司合成。

1.1.4儀器與設(shè)備

4700MALDI-TOF質(zhì)譜儀（配置氮激光器，激光波長為337 nm，加速電壓20 kV，反射電壓19.5 kV，掃描速率1 s/scan，正離子模式檢測，分子質(zhì)量掃描范圍為m/z 400～3 000 u） 美國 AB Sciex公司。

1.2方法

1.2.1xynA基因的擴增

以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板，用引物對xynA基因進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系為：枯草芽孢桿菌168基因組DNA （100 ng/μL）0.5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2.5 μL，5×La Taq DNA聚合酶Buffer 10 μL，La Taq DNA聚合酶（2 U/μL）2.5 μL，dNTPs （2 mmol/L）2.0 μL，ddH2O 32.5 μL。PCR擴增條件為：98 ℃變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.2pET15b-xynA表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達

回收擴增的xynA基因片段，用限制性內(nèi)切酶XhoI 和BamHI進行雙酶切，回收目的片段，與經(jīng)同樣雙酶切處理的大腸桿菌表達載體pET15b連接，構(gòu)建表達載體pET15b-xynA。將表達載體pET15b-xynA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta 2感受態(tài)細胞中，構(gòu)建重組菌Rosetta 2（pET15bxynA）。將重組菌接入到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板中，篩選出陽性重組菌。挑選陽性菌落接入到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度為100 μmol/L，30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，用5 mL 50 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖溶液（含20 mmol/L咪唑、0.5 mmol/L NaCl）懸浮細胞，超聲波破碎細胞，于4 ℃條件下10 000×g離心15 min，收集上清液為進一步的純化備用。

1.2.3木聚糖酶XynA的純化回收及酶活力測定

Ni-IDA Agarose預(yù)裝柱（1 cm×5 cm）用平衡緩沖液（20 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，0.5 mmol/L NaCl）平衡后，將粗酶液以1 mL/min速率上樣，然后用平衡緩沖液以相同速率洗去未吸附的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)，用50 mmol/L咪唑緩沖液進行洗脫，收集目標(biāo)蛋白。將收集到的蛋白用10 kD的離心膜濃縮至2.5 mL，上樣到PD-10除鹽柱中，用3.5 mL磷酸鹽緩沖液洗脫得到除鹽后的蛋白。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析純化及除鹽后的蛋白樣品。

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[18]測定純化后木聚糖酶XynA的活性，產(chǎn)物以D-木糖作為標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)體系為0.9 mL 0.5%預(yù)熱的底物中加入0.1 mL酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入1.5 mL DNS混勻，沸水中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，冷卻后在540 nm波長處測其吸光度。不同pH值緩沖液（50 mmol/L）使用范圍：pH 4.0～7.5為磷酸-檸檬酸緩沖液，pH 7.5～9.0為Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～10.0為甘氨酸-NaOH緩沖液。

1.2.4 酶解產(chǎn)物的薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）及MALDI-TOF/MS分析

配制樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖酶解反應(yīng)溶液，底物分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%樺木木聚糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%毛櫸木木聚糖溶液，緩沖液為pH 6.5，50 mmol/L醋酸鹽緩沖液，XynA酶量為40 μg/mL，37 ℃條件下反應(yīng)18 h，所得的酶解產(chǎn)物用薄層色譜及基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜法進行分析。經(jīng)過除鹽處理后的樣品與二羥基苯甲酸基質(zhì)溶液分別以1∶1、1∶5、1∶10的體積比混勻，取0.75 μL的混勻的樣品點在樣品靶上，室溫下晾干。質(zhì)譜數(shù)據(jù)由4700 MALDI-TOF/TOF分析器獲得，運用4000 Explorer v3.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。內(nèi)標(biāo)物為2 mg/mL α-環(huán)糊精（摩爾質(zhì)量為972.86 g/mol）。

2　結(jié)果與分析

2.1木聚糖水解酶基因的克隆、鑒定與表達載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的xynA基因序列設(shè)計特異性引物，從枯草芽孢桿菌168基因組DNA中PCR擴增出721 bp的xynA基因片段，該基因片段編碼207 個氨基酸，信號肽基因已被剔除，并添加有6聚組氨酸標(biāo)簽（6×His-tag）。將xynA基因片段連接到大腸桿菌表達質(zhì)粒pET15b中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET15b-xynA（圖1），載體轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta 2，篩選獲得陽性克隆菌。

圖1　表達載體pET155bb--xxyynnAA的構(gòu)建Fig.1 Construction of the expression vector pET15b-xynA

2.2木聚糖水解酶的誘導(dǎo)表達、純化及酶活力鑒定

圖2　重組菌表達產(chǎn)物及純化后蛋白SDS-PAGGEE圖Fig.2 SDS-PAGE of crude and purified proteins expressed by recombinant strain

將篩選出的重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中，采用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體超聲破碎，經(jīng)過鎳離子親和柱一步純化后獲得電泳純的木聚糖酶XynA，純化蛋白經(jīng)濃縮除鹽步驟后進行SDS-PAGE分析和木聚糖酶活力的檢測。SDS-PAGE分析表明，誘導(dǎo)的重組菌有明顯的重組蛋白表達帶（圖2A），經(jīng)分離純化后得到一條清晰高純度的XynA蛋白條帶，分子質(zhì)量約為22.9 kD（圖2B）。經(jīng)酶活力測定分析，木聚糖酶XynA最適溫度為50 ℃，最適pH值為6.5。

2.3酶解產(chǎn)物的TLC分析

圖3　XynA水解樺木和毛櫸木木聚糖產(chǎn)物的TLCC分析Fig.3 TLC analysis of hydrolysis products from birchwood xylan and beechwood xylan digested by XynA

利用重組表達木聚糖酶XynA分別水解樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖，酶解得到的產(chǎn)物用薄層析色譜進行分析。圖3A結(jié)果表明XynA水解樺木木聚糖生成的產(chǎn)物有中性木寡糖和酸性木寡糖，中性木寡糖為不含有支鏈的低聚木糖（Xn），而酸性木寡糖為含有甲基葡萄糖醛酸（MeG）側(cè)鏈的低聚木糖（MeGXn）[19]。中性木寡糖主要為木二糖（X2）和木三糖（X3），沒有檢測到游離單糖成分；酸性木寡糖有甲基葡萄糖醛酸木四糖（MeGX4），更長鏈的酸性木寡糖將由MALDI-TOF/MS進行進一步的鑒定。由圖3B可觀察到相似的產(chǎn)物生成，含有中性木寡糖X2和X3以及酸性木寡糖MeGX4。因此推測XynA木聚糖水解酶在無論何種來源的甲基葡萄糖醛酸木聚糖中，酶解出來的產(chǎn)物均含有為X2、X3和MeGX4。由于TLC在檢測分子質(zhì)量較大的木寡糖上存在局限性，因此酶解液里生成產(chǎn)物的分子質(zhì)量將由MALDI-TOF/MS法來確定。

2.4酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF/MS法分析

MALDI-TOF/MS是目前測定生物大分子分子質(zhì)量、純度和結(jié)構(gòu)的最有效的方法之一[20]，采用該法可以對酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進行進一步的測定。由于基質(zhì)的濃度能影響其與樣品形成的結(jié)晶的均勻性以及樣品的分散性，最終會影響出峰的質(zhì)量以及靈敏度[21-22]，因此首先考察樣品/基質(zhì)比率條件，取樺木木聚糖酶解液樣品與基質(zhì)（二羥基苯甲酸）分別以1∶1、1∶5和1∶10的體積比混勻，由圖4A、4B可知，樣品與基質(zhì)分別以1∶1和1∶5體積比混勻后，出峰的質(zhì)量較差，在m/z大于1 000時樣品峰信號弱甚至不出峰。而當(dāng)樣品與基質(zhì)體積比為1∶10時（圖4C），樣品能被有效地離子化，形成陽離子化分子離子峰[M＋Na]＋、[M＋K]＋和[M＋Na＋K]＋，其質(zhì)譜峰信噪比高、分辨率高，且背景和干擾峰少，因此確定樣品與基質(zhì)的混合比例為1∶10。圖4C中，譜圖的離子峰峰值大約以132 u遞增，與木聚糖的明顯特征糖元木糖殘基m/z 132吻合，m/z 1 011.2對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物環(huán)糊精的[M＋K]＋峰，根據(jù)表1對圖中的離子峰進行歸屬，發(fā)現(xiàn)在樺木木聚糖酶解液中，木寡糖分子質(zhì)量分布在m/z 750～1 965之間，聚合度為4～12，其中聚合度為11的峰信號較弱，并且在聚合度為4以上的木寡糖上，均只連接著一個甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈。

圖4　樺木木聚糖酶解液與不同比例基質(zhì)的MALDI-TOF/MS峰譜圖Fig.4 MALDI-TOF/MS analysis of mixtures of birchwood xylan hydrolysate with matrix at various ratios

圖5　XynA水解毛櫸木木聚糖產(chǎn)物的MALDI-TOF/MSS分析Fig.5 MALDI-　TOF/MS analysis of hydrolysates from beechwood xylan digested by XynA

表1　酸性木寡糖離子峰理論分子質(zhì)量（m/z）Table 1 Theoretic molecular weight of MeGXn(m/z)

按照之前優(yōu)化的樣品/基質(zhì)條件對毛櫸木木聚糖酶解液進行測定，如圖5所示，樣品能被有效的離子化，出峰好且峰信號強。同樣根據(jù)表1對圖中的離子峰進行歸屬，發(fā)現(xiàn)在毛櫸木木聚糖酶解液中，木寡糖分子質(zhì)量分布在m/z 850～2 500之間，聚合度為5～16，產(chǎn)物與樺木木聚糖中的酶解產(chǎn)物相似，在聚合度為5以上的木寡糖上均只連接著一個甲基葡萄糖醛酸基團，而兩者聚合度的差異可能是由于樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖上連接著的甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈出現(xiàn)頻率的差異所致。由于低分子質(zhì)量區(qū)域受到木聚糖酶及基質(zhì)影響，聚合度在4～5以下的木寡糖難以在圖譜上辨認，因此可結(jié)合之前TLC結(jié)果對低分子質(zhì)量的產(chǎn)物進行鑒定。

3 結(jié)論與討論

近年來木聚糖酶研究和應(yīng)用已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點，木聚糖酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品，飼料甚至醫(yī)藥等行業(yè)，特別是在益生元的制備中，具有廣闊的應(yīng)用前景[23-24]。本研究以食品級安全的枯草芽孢桿菌分泌的木聚糖酶XynA為對象，通過基因克隆方法獲得木聚糖酶XynA，并確定了XynA的純化方法，結(jié)果顯示獲得電泳級純的木聚糖酶XynA，該酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適pH值為6.5。接著探索了木聚糖酶XynA在樺木木聚糖和毛櫸木木聚糖中的水解表現(xiàn)，利用TLC和MALDI-TOF/MS方法對酶解產(chǎn)物進行鑒定，結(jié)果表明在樺木木聚糖酶解液中，產(chǎn)生的中性木寡糖為主要木二糖和木三糖，酸性木寡糖的聚合度為4～12，并且側(cè)鏈都只連接著一個甲基葡萄糖醛酸基團。在毛櫸木木聚糖酶解液中，產(chǎn)生的中性木寡糖也主要為木二糖和木三糖，而酸性木寡糖的聚合度為4～16，并且側(cè)鏈也都只連接著一個甲基葡萄糖醛酸基團。根據(jù)對這兩種不同來源的木聚糖的酶解液產(chǎn)物分析，推測XynA在木聚糖上的酶解位點并不是隨機的，可能與甲基葡萄糖醛酸基團有關(guān)，導(dǎo)致酶解出只帶有一個甲基葡萄糖醛酸基團的酸性木寡糖，并且推測該酶在無論何種來源的甲基葡萄糖醛酸木聚糖中，酶解出來的中性木寡糖主要為木二糖和木三糖。而木二糖和木三糖作為一種重要的功能性的食物添加劑，可被添加在奶制品、軟飲料、茶、蛋糕等食品中，有潛在的經(jīng)濟價值[25-26]。未來運用陰離子交換色譜等方法對XynA酶解液中的中性木寡糖和酸性木寡糖進行分離，可以實現(xiàn)對木聚糖資源最大化程度的利用。

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Cloning and Expression of Bacillus subtilis Xylanase and Determination of Hydrolysis Products of Two Different Xylans by It

WEI Lusha,WU Yifei,CHEN Hui*
(College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

Abstract:Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS)was applied to analyze molecular weight distribution of hydrolysis products from birchwood xylan and beechwood xylan digested by Bacillus subtilis xylanase(XynA),obtained through recombinant expression and purified by Ni+-IDA column chromatography.The hydrolysis products were identified by thin layer c hromatography(TLC)and MALDI-TOF/MS.Results showed the enzymatic hydrolysis of birchwood xylan yielded mainly xylobiose(X2)and xylotriose(X3)as well as acidic xylooligosacchrides with a degree of polymerization(DP)of 4–12 each including a single methyl-glucuronic acid side chain.Both xylobiose and xylotriose were found in the hydrolysate of beechwood xylan as well as acidic xylooligosacchrides with a DP of 4–16 structurally similar to those from birchwood xylan.Therefore,the recombinant XynA has the potential to produce X2,X3and acidic xylooligosacchrides.

Key words:xylanase; xylooligosaccrides; matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS)

中圖分類號：Q819

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0108-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605020 10.7506/spkx1002-6630-201605020.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：陳輝（1961—），男，教授，博士，研究方向為森林保護學(xué)。E-mail：chenhui@nwsuaf.edu.cn

作者簡介：韋露莎（1987—），女，博士研究生，研究方向為半纖維素的酶解。E-mail：lusafei@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（31170607）

收稿日期：2015-04-28