B淋巴細胞在抗CD45RB 抗體誘導的移植免疫耐受中的作用*

鄧春艷，　張國超，　鄧紹平，　任莉莉，　蔣錦杏，　俞麗娜，　齊　暉，　李富榮

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院/深圳市人民醫(yī)院干細胞與細胞治療重點實驗室/廣東 深圳 518020)

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B淋巴細胞在抗CD45RB 抗體誘導的移植免疫耐受中的作用*

鄧春艷，張國超，鄧紹平，任莉莉，蔣錦杏，俞麗娜，齊暉，李富榮△

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院/深圳市人民醫(yī)院干細胞與細胞治療重點實驗室/廣東 深圳 518020)

[摘要]目的： 探討B(tài)淋巴細胞在抗CD45RB抗體誘導的移植免疫耐受中的作用。方法: 抗CD45RB抗體對BALB/c裸鼠進行預處理后制備脾臟單細胞懸液，與BALB/c小鼠T淋巴細胞和C57BL/6小鼠脾細胞混合培養(yǎng)，流式細胞術分析Th1、Th2、Treg和Tm淋巴細胞。以B6.μMT-/-小鼠為受體、BALB/c小鼠為供體建立皮膚移植模型，移植后向受體鼠腹腔注射抗CD45RB 單抗，監(jiān)測脾淋巴細胞 CD3+CD45RBhi細胞比例。在混合淋巴培養(yǎng)過程中加入抗 CD45RB單抗，分離 B 細胞，建立以BALB/c 小鼠為供體、B6.μMT-/-小鼠為受體的心臟移植模型，通過尾靜脈注射B 細胞給 B6.μMT-/-小鼠，觀察受體鼠生存期和B細胞分布。結果: 在裸鼠體內用抗 CD45RB 抗體處理過的 B 淋巴細胞，與 T 淋巴細胞混合培養(yǎng)時，可使Treg和Th2 淋巴細胞比例明顯升高，Th1淋巴細胞的比例明顯下降，Tm細胞無明顯變化。在體內B淋巴細胞缺失的情況下，抗 CD45RB 抗體依然能夠降低 T 細胞表面 CD45RB 的表達，與對照組B淋巴細胞存在組相比，抗 CD45RB 抗體對 T 淋巴細胞表面 CD45RB 下調更為快速，但最終CD3+CD45RBhiT 細胞比例無明顯變化。體外抗 CD45RB 抗體處理過的B淋巴細胞可以延長受體鼠的生存時間。B6.μMT-/-鼠在接受抗CD45RB抗體處理的B細胞并進行同種異體心臟移植后，B細胞可向胸腺遷移。結論: 在抗CD45RB抗體誘導的免疫耐受中，B淋巴細胞可能通過介導各T淋巴細胞亞群比例發(fā)揮著重要作用，且在中樞耐受中也起到一定作用，但是僅靠B淋巴細胞無法形成完全耐受。

[關鍵詞]CD45RB抗體； 移植； 免疫耐受

CD45分子是一種廣泛地表達在造血系細胞如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等表面的跨膜糖蛋白，是細胞膜上信號轉導的關鍵分子，在淋巴細胞的發(fā)育成熟、功能調節(jié)及信號傳遞中具有重要意義。CD45RB是CD45的一種異構體，主要表達在 T、B、DC 細胞表面。大量實驗證明針對CD45RB的單克隆抗體能夠在同種異體移植模型中誘導移植物長期存活，并在受體體內形成特異性的免疫耐受[1-5]。目前針對抗CD45RB抗體誘導的免疫耐受調節(jié)機制的研究大多集中在T細胞介導的免疫調節(jié)功能。

近年的研究發(fā)現(xiàn)在CD45RB單抗誘導的移植免疫耐受中必須有宿主B淋巴細胞的參與[6-7]，但相關作用機制尚不清楚。本實驗通過研究在B細胞存在或缺失狀態(tài)下，抗CD45RB 抗體在體內外對T細胞的作用及誘導移植免疫耐受的影響等，闡述B淋巴細胞在抗 CD45RB抗體誘導的移植免疫耐受中可能發(fā)揮的作用機制。

材料和方法

1實驗動物

近交系BABL/c小鼠(6～8周齡)，雌雄不限，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心；近交系雌性C57BL/6小鼠(6～8周齡)及雄性BABL/c裸鼠購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心； B6.μMT-/-鼠(B細胞缺失，C57BL/6同源, 6～8周齡)，雌雄各半，購自Jackson實驗室。動物實驗均在深圳市疾病控制中心 (SPF級動物實驗中心)完成，所用動物實驗符合動物倫理學要求。

2主要試劑

抗CD45RB單克隆抗體購自BioXcell；尼龍柱購自Wako；抗CD3-PECY5、CD19-PE、CD4-PECY5、CD25-Alexa Fluro、CD127-PE、 CD8-FITC、CD44-PE、CD62L-FITC、CD45RB-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-PE及相應的同型對照等流式抗體購自eBioscience；流式破膜劑購自Beckman；淋巴細胞分離液購自達科為生物技術有限公司；絲裂霉素、PMA、ionomycin等購自Sigma；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Thermo;胎牛血清購自HyClone。

3主要方法

3.1抗CD45RB抗體對BALB/c裸鼠進行預處理將BALB/c裸鼠分為2組，每組各5只。 A 組(n=5)在 0、1、3、5、7 d分別腹腔注射100 μL濃度為1 g/L的抗CD45RB單抗;B組(n=5)在0、1、3、5、7 d腹腔注射 100 μL 生理鹽水，7 d后待用。

3.2抗CD45RB抗體預處理的B淋巴細胞對T淋巴細胞亞群的作用預處理的BALB/c裸鼠，無菌取脾臟制備脾淋巴細胞懸液，采用尼龍柱分離法分離B淋巴細胞備用。分別以抗CD3-PEcy和CD19-PE標記，流式細胞術檢測CD3+T細胞純度>90%,CD19+B細胞>90%，將提取的C57BL/6小鼠脾淋巴細胞與絲裂霉素C共孵育后作為刺激細胞。將3 種細胞按1∶2∶1的比例加至6孔板混合培養(yǎng)，實驗分為實驗組：BALB/c小鼠T淋巴細胞+B淋巴細胞(來自抗CD45RB抗體預處理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴細胞；對照組：BALB/c小鼠T淋巴細胞+B淋巴細胞(來自生理鹽水預處理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴細胞。

共培養(yǎng)0、1、3、5、7 d時每組取3個復孔分別收獲懸浮細胞，流式細胞術檢測T細胞亞群包括Treg(CD4+CD25+CD127-)、Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)和Tm(CD4+CD62L-CD44hi)。取待檢測細胞(1×106)于試管中，分別加入抗體及相應同型對照進行細胞免疫熒光染色。IL-4、IFN-γ等細胞內細胞因子的檢測需先經(jīng)過PMA及BFA刺激，染色前采用破膜劑進行破膜處理。孵育后流式細胞儀(FACSC Canto Ⅱ，Beckton Dickinson)分別進行檢測。

3.3抗CD45RB抗體對B細胞缺餡鼠CD3+CD45RBhiT細胞的影響取BALB/c小鼠耳背部皮膚移植到B6.μMT-/-或C57BL/6小鼠背部，移植方法參照文獻進行[8]。實驗按照隨機對照原則分為4組，每組受體鼠24只。A組(實驗組)和B組均為B6.μMT-/-鼠移植 BALB/c 鼠耳背皮膚； C組和D組均為C57BL/6鼠移植 BALB/c鼠耳背皮膚。移植后0、1、3、5、7 d，分別向 A、C 組受體鼠腹腔注射100 μL濃度為1 g/L的抗 CD45RB 單抗，B、D 組腹腔注射 100 μL 生理鹽水。每組分別在腹腔注射后0、1、3、5、7、9 d取4只受體鼠脾臟，制備單細胞懸液，同上方法，流式細胞術檢測CD3+CD45RBhi的百分率。

3.4抗CD45RB抗體處理的B淋巴細胞在同種異體心臟移植中誘導耐受的作用取8周齡雌性C57BL/6小鼠和8周齡雌性BALB/c小鼠，無菌取脾制成單細胞懸液。將C57BL/6小鼠脾淋巴細胞作為反應細胞，BALB/c小鼠脾淋巴細胞用絲裂霉素C處理后作為刺激細胞進行混合培養(yǎng)。實驗組細胞在0、1、3、5、7 d分別加入1 g/L的抗CD45RB抗體10 μg，對照組加入PBS 10 μL。將混合培養(yǎng)淋巴細胞在第9天經(jīng)尼龍柱法分離B淋巴細胞，調整細胞濃度2.5×1010/L。B6.μMT-/-鼠經(jīng)尾靜脈注射分別來自實驗組和對照組的5×106B細胞后作為受體，BALB/c小鼠作為供體開始行同種異體的心臟移植，移植方法見文獻[9]。每組小鼠各6只，每天通過視、觸診觀察供心的搏動情況。以供心搏動有力，且小鼠存活72 h以上視為移植成功，記錄移植小鼠的生存時間。

3.5B細胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況的檢測按照隨機數(shù)字表法將60只B6.μMT-/-分為3組，每組20只。正常的B6小鼠 B細胞約5×106經(jīng)抗CD45RB抗體10 μg處理，CFSE標記上述細胞后通過尾靜脈向實驗組和 B6.μMT-/-鼠注射，將 BALB/c 小鼠心臟移植到B6.μMT-/-鼠，方法同前。以接受不經(jīng)抗CD45RB抗體處理組的B細胞移植受體鼠作為對照組1，接受抗CD45RB抗體處理組的B細胞但不做心臟移植的 B6.μMT-/-鼠為對照組2。在1、3、5、7、10 d每組取4只小鼠胸腺制備單細胞懸液，通過流式細胞儀監(jiān)控CD19+CFSE+B細胞遷移到胸腺的程度。

4統(tǒng)計學處理

所有結果以 SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計方法使用兩樣本t檢驗和析因設計的方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗,生存期采取log-rank檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1抗CD45RB抗體處理過的B細胞在體外對T 細胞亞群的影響

為了觀察B淋巴細胞在抗CD45RB抗體誘導免疫耐受中對 T 細胞亞群的影響，我們將來自抗CD45RB抗體注射后BALB/c裸鼠的B細胞與BALB/c小鼠的T細胞一起作為反應細胞進行混合淋巴細胞培養(yǎng)?；旌狭馨团囵B(yǎng)7 d內，2組調節(jié)性Treg細胞比例均呈逐漸上升趨勢，但實驗組中上升幅度明顯高于對照組(P<0.05)；2組Tm細胞比例呈逐漸上升趨勢，但上升幅度無明顯差別；2組Th1細胞陽性率均呈逐漸上升趨勢，實驗組升幅明顯低于對照組；Th2細胞陽性率也呈逐漸上升趨勢，但實驗組升幅明顯高于對照組；實驗組Th1/Th2較對照組降低(P<0.05),見圖1。

2抗CD45RB抗體對B細胞缺陷鼠外周成熟T細胞的影響

為了解抗CD45RB抗體在B細胞缺失的情況下，對同種異體移植模型外周T細胞的影響，我們選取體內B細胞缺陷小鼠B6.μMT-/-鼠作為受體進行同種異體皮膚移植，并與非B細胞缺陷鼠進行比較。A 組B6.μMT-/-鼠注射抗CD45RB抗體后，第1天的CD3+CD45RBhi細胞在CD3+細胞中的比例即降到 40%左右，繼續(xù)注射抗體無法使其比例再降低。B組B6.μMT-/-鼠未使用抗CD45RB抗體，CD3+CD45RBhi的比例隨時間幾乎沒有變化。C 組 C57BL/6 鼠在注射抗 CD45RB抗體后，CD3+CD45RBhi的比例隨時間逐漸降低，在第9天降到了和B細胞缺陷鼠A組相同的水平(P<0.05)。D組C57BL/6鼠在移植皮膚之后注射生理鹽水，隨時間的延長，CD3+CD45RBhi的比例呈明顯升高，見圖1。

3體外誘導耐受的B細胞對心臟移植受體鼠生存期的影響

為了觀察抗CD45RB抗體對外周耐受的誘導是否僅僅依靠B細胞就可以完成，我們在體外用抗CD45RB抗體誘導B細胞的耐受，將誘導耐受后的B細胞靜脈注入B細胞缺陷鼠體內，觀察心臟移植的生存期。在體外混合培養(yǎng)6 h后觀察細胞形態(tài)，可見未加抗體組的淋巴細胞分布較均勻，無細胞成團現(xiàn)象。而加入抗體組的細胞大部分形成大小不等的團狀分布，散在單個分布細胞較少。將抗CD45RB抗體處理過的C57BL/6小鼠B細胞分離出來，經(jīng)尾靜脈注射給同種異體心臟移植受體B細胞缺陷B6.μMT-/-鼠能延長移植物存活時間。實驗組移植心臟平均存活時間為(14.3±3.5)d，對照組移植心臟平均存活時間為(4.2±1.2)d。經(jīng)log-rank檢驗，實驗組移植心臟存活時間較對照組明顯延長(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The influence of anti-CD45RB mAb-disposed B cells on T-cell subgroups. Mean±SD.n=3～4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsgroup C.

圖1抗CD45RB抗體處理過的B細胞對T細胞亞群的影響

Figure 2.The influence ofinvitroinduced tolerance B cells on the lifetime of rats after allogeneic heart transplantation. A: the cells in mixed lymphocyte culture without anti-CD45RB mAb (×200); B: the cells in mixed lymphocyte culture with anti-CD45RB mAb (×200); C: the survival curve after transplantation (n=6).

圖2體外誘導耐受的 B 細胞對同種異體心臟移植受體鼠生存期的影響

4B細胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

實驗組于第5天在胸腺中開始檢測到少量經(jīng) CFSE 標記過的B細胞[(3.13±0.53) %]，隨后逐漸增多，第10天達到約(8.32±1.21) %；對照組1中B細胞未經(jīng)過抗CD45RB抗體處理，胸腺中未出現(xiàn)明顯的CD19+CFSE+B細胞；對照組2雖然接受了抗CD45RB抗體處理的B細胞，但未進行移植，前期胸腺中未能檢測到CD19+CFSE+B細胞，直到第10天，在胸腺中僅檢測到微量B細胞[(2.22±0.13) %],見圖3、表1。

Figure 3.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus.Control 1: B cells was untreated with anti-CD45RB mAb in the transplantion model; control 2: B cells was treated with anti-CD45RB mAb but without transplantation.

圖3B細胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

討論

B 細胞是體內數(shù)目最多的抗原提呈細胞，也是體內惟一能產(chǎn)生抗體的細胞，但是它在免疫耐受中發(fā)揮的作用仍然是有爭議的，它可能對免疫排斥具有兩種決然不同的作用。在某些情況下B細胞會加速排斥反應、促進細胞免疫，清除B細胞可能延長移植物存活[10-12]。而在另一些研究中，B 細胞在抗CD45RB抗體耐誘導的耐受中被證明是必須的[6-7, 13]。

表1B細胞經(jīng)CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

Table 1.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus (%. Mean±SD.n=4)

Time(d)Control1Control2Experimental10.91±0.360.88±0.610.86±0.1830.89±0.170.93±0.230.93±0.4151.21±0.260.81±0.183.13±0.53*#71.53±0.230.79±0.336.26±0.71*#100.95±0.112.22±0.138.32±1.21*#

*P<0.05vscontrol 1;#P<0.05vscontrol 2.

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在體內用抗CD45RB抗體對裸鼠 B 細胞進行處理，處理后的 B 細胞在體外能上調裸鼠體內缺少的T細胞。用抗CD45RB 抗體進行處理時，體內B細胞在缺少胸腺、無T細胞和沒有抗原刺激的情況下，一方面抗CD45RB抗體可能通過競爭性結合B細胞表面CD45RB，從而阻斷活化信號的傳導，起到抑制增殖的作用；另一方面抗CD45RB抗體可能改變B細胞表面某些分子的表達，使B細胞轉變成介于靜息狀態(tài)B細胞和耐受狀態(tài)B細胞之間的一種狀態(tài)。當把此種B細胞取出體外，在混合淋巴細胞培養(yǎng)中與T細胞、抗原刺激相混合時，這種中間狀態(tài)可能改變B細胞提呈抗原、與 T 細胞共刺激等作用，從而使 Th2、Treg 細胞比率升高，Th1 細胞比率下降，T 細胞反應朝向耐受的方向發(fā)展。對Tm細胞無明顯影響可能是因為T 細胞第一次遇到外界抗原刺激，記憶T細胞增殖作用占主導地位，而抗CD45RB 抗體處理過的 B 細胞對其增殖的抑制影響被忽略所致。

Blaylock等[14]實驗證實， 抗CD45RB抗體的免疫調節(jié)作用與清除外周血中某種特異性 T 細胞亞群有關。有研究[15-16]證明抗 CD45RB抗體可改變受體外周血CD45RBhiT細胞和CD45RBloT細胞的比值來誘導耐受，CD45RBloCD4+T能夠表達調節(jié)性轉錄因子Foxp3，分泌細胞因子IL-4，且具有調節(jié)作用，而CD45RBhiCD4+T低表達Foxp3，分泌介導排斥反應的Th1類細胞因子，且具有效應細胞的作用。因此，調節(jié)性CD45RBloT和效應性CD45RBhiT之間平衡的改變對于CD45RB單抗的免疫功能是至關重要的。本實驗發(fā)現(xiàn)，在B細胞缺失的情況下，抗CD45RB抗體對脾內CD45RBhiT的減少作用依然存在，只是減少的方式與B細胞存在的情況下有所不同。B細胞缺陷鼠皮膚移植注射抗CD45RB抗體后，第1天CD3+CD45RBhi細胞在CD3+陽性細胞中的比例就降到40%左右，以后再注射抗體都無法使其比例再降低。而C57BL/6皮膚移植鼠在注射抗CD45RB 抗體后，CD3+CD45RB+的比例隨時間逐漸降低，在第9天降到了和 B 細胞缺陷鼠實驗組相同的水平。原因可能是CD45RB廣泛表達在T、B細胞表面，在B細胞存在的情況下，B細胞能夠和 T 細胞競爭抗CD45RB的結合位點，不至于使CD45RBhiT細胞降低過快。C57BL/6小鼠生理鹽水組CD45RBhiT 細胞比例稍有增加，而B6.μMT-/-鼠生理鹽水組基本沒有變化，可能是因為在接受抗原刺激時，作為抗原提呈細胞的B細胞可上調 T細胞表面CD45RB分子的表達，CD45RBhiT細胞具有效應細胞的作用，從而產(chǎn)生更為強烈的免疫反應。實驗結果說明，在抗CD45RB抗體減少外周CD45RBhiT細胞的作用中，B細胞起到一定的作用，但并不是決定性的作用。B細胞可以使CD45RBhiT細胞的減少不至于過快，這也可能是抗CD45RB抗體誘導耐受后，機體仍對其它抗原保持正常免疫反應的一個原因。

CD45RB誘導的免疫耐受中，B細胞起到重要作用，B細胞的缺失將導致誘導耐受的失敗，但抗CD45RB 抗體對耐受的誘導僅僅依靠B細胞能形成嗎？本實驗在將體外誘導耐受的B細胞注入到B細胞缺陷鼠體內重建其免疫系統(tǒng)，可延長移植物的生存期，但不能誘導完全免疫耐受。這也說明了在抗CD45RB誘導耐受中B細胞的耐受并不能誘導整個機體的耐受，還需要T、DC等細胞的參與。在體外制備耐受B細胞時，我們注意到在混合淋巴細胞培養(yǎng)中加入抗CD45RB抗體后，B細胞聚集成團生長，單個散在細胞較少。其原因一方面可能是淋巴細胞競爭性地與抗CD45RB抗體結合，導致了一個抗CD45RB分子與多個淋巴細胞結合的現(xiàn)象。另一方面可能是細胞表面的CD54即細胞間黏附分子-1的表達上調，這類分子的上調直接影響到了細胞間的接觸，導致了細胞的成團分布。本實驗還發(fā)現(xiàn)應用抗 CD45RB加速了同種異體移植模型中B細胞向胸腺的遷移，進而提呈移植物特異性抗原給胸腺，介導了胸腺對能與移植物特異性抗原結合的T細胞的克隆清除，從而導致了中樞耐受，證實了在抗CD45RB抗體所介導的中樞耐受中需要宿主B細胞的參與。

綜上所述，抗CD45RB抗體誘導的免疫耐受中，B細胞發(fā)揮著重要作用，但是，僅僅依靠B細胞無法形成完全耐受。免疫耐受的誘導是一個多種機制參與的免疫調節(jié)過程。我們需要對抗CD45RB抗體誘導的免疫耐受調節(jié)規(guī)律進行更深入的研究，才能夠更好地發(fā)掘抗CD45RB抗體作為新的免疫抑制藥物在臨床移植中的應用潛力。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance

DENG Chun-yan, ZHANG Guo-chao, DENG Shao-ping, REN Li-li, JIANG Jin-xing, YU Li-na, QI Hui, LI Fu-rong

(TheKeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,ShenzhenPeople’sHospital,TheSecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance. METHODS: Single cell suspension was made from the spleen of BALB/c nude mice disposed by CD45RB antibody, then mixed cultured with T cells of BALB/c mice and spleen cells of C57BL/6 mice. The Th1, Th2, Treg and Tm cells were monitored by flow cytometry during the culture process. The skin graft model was set up with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors. CD45RB antibody was intraperitoneally injected into the receptors after transplantation and then CD3+CD45RBhicells were detected by flow cytometry. In another mixed lymphocyte culture, CD45RB antibody was added, and then B cells were isolated and injected into B6.μMT-/-mice through the tail vein. The heart transplantation model was established with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors， and then the survival and the migration of B cells to the thymus were observed. RESULTS: When T lymphocytes were co-cultured with B lymphocytes treated with anti-CD45RB monoclonal antibody (mAb) in vivo, the percentages of Th2 and Treg cells were up-regulated and Th1 cells were down-regulated, but Tm cells were not altered as compared with the control. In vivo without B lymphocytes, anti-CD45RB mAb also down-regulated the expression of CD45RB in T lymphocytes. The reduction was faster and the percentage of CD3+CD45RBhiT cells was not altered as compared with the control. The B lymphocytes treated with anti-CD45RB mAb in vitro prolonged the lifetime of receptor in heart transplantation model but failed to induce complete tolerance. After recieving B cells treated with anti-CD45RB mAb and allogeneic heart transplantation, B cells migrated to the thymus in B6.μMT-/-mice. CONCLUSION: B lymphocytes play a definite role in the transplantation immune tolerance induced by anti-CD45RB mAb through their affection on T-cell subgroups and also in the central tolerance. However, the induction of immune tolerance can not only rely on B cells.

[KEY WORDS]CD45RB antibody; Transplantation; Immune tolerance

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.017

[中圖分類號]R392.4； R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 0755-22942450； E-mail: frli62@163.com

*[基金項目]國家973前期專項(No.2007CB516811)；國家自然科學基金資助項目(No.30772042)；深圳市科技計劃(No.201001005)

[收稿日期]2015- 09- 01[修回日期] 2016- 01- 26

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0492- 07

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