止血帶休克后主動(dòng)脈收縮反應(yīng)性及RAS成分的變化*

王麗君，　王建輝，　王玉娟，　范素凈，　朱麗艷，　楊秀紅△

(1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室, 2唐山市第九醫(yī)院，河北 唐山 063000)

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止血帶休克后主動(dòng)脈收縮反應(yīng)性及RAS成分的變化*

王麗君1，王建輝1，王玉娟2，范素凈1，朱麗艷1，楊秀紅1△

(1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,2唐山市第九醫(yī)院，河北 唐山 063000)

[摘要]目的： 通過(guò)觀察止血帶休克(tourniquet shock，TS)后主動(dòng)脈收縮反應(yīng)性及腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的變化，探討RAS穩(wěn)態(tài)失衡在止血帶休克后主動(dòng)脈低反應(yīng)性及損傷中的作用。方法: 8月齡C57BL/6的雄性小鼠，分為對(duì)照組及6個(gè)模型組，每組6只。模型組進(jìn)行止血帶套扎雙后肢阻斷血流，2 h后解套扎進(jìn)行再灌注，分別于再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h后處死，對(duì)照組不進(jìn)行套扎與再灌注，其余操作同模型組；多普勒血流儀測(cè)定肢體血流，頸動(dòng)脈插管法測(cè)定平均動(dòng)脈壓(MAP)，離體血管張力測(cè)定儀測(cè)定主動(dòng)脈收縮反應(yīng)性，HE染色結(jié)合透射電鏡評(píng)價(jià)血管形態(tài)學(xué)損傷；Western blot檢測(cè)血管組織中血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1受體)、血管緊張素(1-7)受體(Mas受體)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和ACE2蛋白的表達(dá)。采用ELISA檢測(cè)血清中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]的含量。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，模型組出現(xiàn)下述變化：(1) 隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)血流量逐漸減少；MAP在再灌注10 min明顯升高，隨后逐漸降低；血管對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性在再灌注10 min升高隨后下降，再灌注4 h的血管反應(yīng)性最低；形態(tài)學(xué)損傷評(píng)分隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高;(2) 主動(dòng)脈AT1受體與ACE2蛋白表達(dá)逐漸下降，Mas受體與ACE蛋白表達(dá)逐漸升高;(3) 血清中AngⅡ的含量整體呈升高趨勢(shì)，Ang(1-7)的含量整體呈降低趨勢(shì)。結(jié)論: 主動(dòng)脈收縮反應(yīng)性在休克初期暫時(shí)升高，隨后降低，其發(fā)生機(jī)制可能與血管形態(tài)學(xué)損傷及 RAS失衡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]止血帶休克； 主動(dòng)脈； 血管收縮反應(yīng)性； 腎素-血管緊張素系統(tǒng)

止血帶休克是指松解結(jié)扎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的止血帶后，機(jī)體由于各種毒素刺激以及有效循環(huán)血量不足導(dǎo)致的以神經(jīng)-體液因子失調(diào)與急性循環(huán)障礙為特征的危重狀態(tài)，是創(chuàng)傷性休克的一種[1]。研究表明：在休克的代償期血管反應(yīng)性是短暫升高的；而休克晚期由于機(jī)體代償機(jī)制不足以對(duì)抗休克引起的各種損傷，血管反應(yīng)性持續(xù)降低，出現(xiàn)難治性低血壓[2]，血管對(duì)所用藥物不敏感甚至無(wú)反應(yīng)，導(dǎo)致血壓提升不良,不能進(jìn)行有效組織灌注，因此細(xì)胞缺氧和損傷進(jìn)一步加重[3]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)/血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)/血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT1受體)與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)/血管緊張素(1-7)[angiotensin(1-7)，Ang(1-7)]/血管緊張素(1-7)的受體(Mas受體)兩條作用軸，以循環(huán)RAS和局部RAS兩種作用方式調(diào)節(jié)體內(nèi)多個(gè)臟器的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)肢體缺血再灌注后，RAS穩(wěn)態(tài)明顯失衡，其可造成遠(yuǎn)隔器官如腎臟、肺臟的急性損傷[4-5]。然而，RAS穩(wěn)態(tài)失衡在止血帶休克后主動(dòng)脈低反應(yīng)性及損傷中的作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用止血帶休克模型，應(yīng)用多普勒血流測(cè)定技術(shù)、頸動(dòng)脈插管測(cè)壓法和微血管張力測(cè)定技術(shù)觀察不同再灌注時(shí)點(diǎn)動(dòng)物的主動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)及血管反應(yīng)性的改變，病理學(xué)方法評(píng)價(jià)主動(dòng)脈損傷程度，Western blot法和ELISA法測(cè)定主動(dòng)脈及血清中RAS成分的變化，研究止血帶休克后RAS失衡與血管低反應(yīng)性及損傷的關(guān)系。

材料和方法

1動(dòng)物

隨機(jī)選取野生型C57BL/6小鼠，雄性，體重26～30 g，8月齡；所用動(dòng)物均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，所有動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)在SPF微生物學(xué)控制的條件下進(jìn)行。

2主要試劑

K-H液[成分(mmol/L)：NaCl 11.8,KCl 4.7,MgSO4·7H2O 1.2,CaCl22.5,NaHCO324.7,葡萄糖11.0;均購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠]；重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司；氯化乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western blot蛋白Marker、封閉液、 Ⅱ 抗、抗體稀釋液、TEMED和GAPDH抗體均為碧云天試劑公司產(chǎn)品；AT1受體和ACE2抗體均購(gòu)自Santa Cruz；ACE抗體購(gòu)自Epitomics；Mas受體抗體購(gòu)自Alomone Labs；AngⅡ和Ang(1-7)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

3主要方法

3.1動(dòng)物分組與模型制備隨機(jī)分為7組，每組各6只動(dòng)物，即對(duì)照組以及缺血2 h再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h組。對(duì)照組除結(jié)扎、再灌注操作外，其余操作同模型組。模型組10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，采用套扎鉗及橡皮圈結(jié)扎雙后肢根部使雙后肢缺血2 h，然后剪斷橡皮圈并對(duì)小鼠雙側(cè)后肢進(jìn)行按摩，進(jìn)行血流灌注。分別于再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h后進(jìn)行心臟取血及主動(dòng)脈的剝離，留取血清及主動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。

3.2激光多普勒血流儀測(cè)定血流值動(dòng)物麻醉后將其仰臥固定于37 ℃恒溫操作臺(tái)上，將激光多普勒血流儀的探頭固定于右后肢腳掌上，PSW軟件記錄并分析各組小鼠肢體血流變化情況。

3.3頸動(dòng)脈插管法監(jiān)測(cè)血壓動(dòng)物麻醉后將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，沿氣管作頸正中切口，在體視顯微鏡下沿胸鎖乳突肌鈍性分離一側(cè)頸總動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用手術(shù)縫線結(jié)扎，近心段用頸動(dòng)脈夾夾閉。在頸總動(dòng)脈上剪一“V”型切口，將充滿濃度為15 IU/mL的肝素溶液的自制動(dòng)脈導(dǎo)管插入頸總動(dòng)脈并固定。松開(kāi)頸動(dòng)脈夾，待動(dòng)物穩(wěn)定10 min后，開(kāi)始進(jìn)行血壓實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

3.4離體組織灌流系統(tǒng)測(cè)定血管收縮反應(yīng)性小鼠處死后，分離主動(dòng)脈，置入預(yù)冷K-H液中沖洗，將其于培養(yǎng)皿中固定。顯微鏡下去除主動(dòng)脈周圍結(jié)締組織，選取4個(gè)位置，制成長(zhǎng)約2 mm的動(dòng)脈環(huán)標(biāo)本。在離體微血管張力測(cè)定儀的浴槽中注入5 mL的K-H液，用直徑約40 μm、長(zhǎng)度3 cm左右的金屬絲固定血管環(huán)于傳感器的鉗口內(nèi)，鋼絲平直并使血管保持一定的張力，持續(xù)通入95%的氧氣與5%的CO2混合氣體，維持溫度在37 ℃。對(duì)儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，調(diào)節(jié)最適初張力至PowerLab Chart自動(dòng)給定的數(shù)值。血管環(huán)休息30 min，期間每15 min更換1次K-H液。用60 mmol/L的KCl溶液刺激血管環(huán)收縮，其達(dá)到平值后記錄收縮幅度，重復(fù)上述步驟3次，若所得收縮幅度大于1 mN，且兩次數(shù)值相差小于10%，說(shuō)明血管活性保持良好，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用10-6mol/L的ACh檢測(cè)內(nèi)皮功能，若舒張幅度大于80%，說(shuō)明內(nèi)皮完整性保持良好，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。血管于K-H中平衡1 h后，分別以10-9mol/L、3×10-9mol/L、10-8mol/L、3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L、3×10-6mol/L、10-5mol/L和3×10-5mol/L的NE每2 min刺激主動(dòng)脈血管環(huán)，期間不洗脫，記錄血管環(huán)的收縮情況并制作收縮反應(yīng)曲線。

3.5血管HE染色及超微結(jié)構(gòu)的觀察小鼠處死后將主動(dòng)脈置于10%中性甲醛固定液中固定24 h，常規(guī)組織學(xué)切片處理。采用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，高倍鏡下(×400)每組切片隨機(jī)選取20個(gè)視野，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行血管損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[6]：0分，內(nèi)彈力膜完整；1分，內(nèi)彈力膜破裂；2分，中層彈力膜破裂；3分，外彈力膜破裂。各組另取3只小鼠主動(dòng)脈制成長(zhǎng)約1.5 mm的血管環(huán)標(biāo)本，置于預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，常規(guī)電鏡切片處理，用枸櫞酸鉛及醋酸鈾染色，H-7650透射電子顯微鏡(HITACHI)下觀察組織。

3.6蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)AT1受體、Mas受體、ACE和ACE2的蛋白水平 每組稱取50 mg的血管，剪碎后加入300 μL組織裂解液，冰上電動(dòng)勻漿。12 000 r/min低溫離心15 min，取上清分裝。采用BCA法測(cè)定血管勻漿的蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度至3 g/L。取20 μL蛋白溶液與5×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后SDS-PAGE電泳，醋酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h后于提前配好的 I 抗內(nèi)孵育過(guò)夜(AT1受體 1∶200，Mas受體 1∶200，ACE 1∶500，ACE2 1∶500，GAPDH 1∶1 000)。TBST洗膜3次，每次10 min。放入相應(yīng)的Ⅱ抗溶液(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。將條帶涂抹ECL發(fā)光劑后置于全自動(dòng)圖像分析儀暗盒內(nèi)，設(shè)置曝光時(shí)間，自動(dòng)成像。采用ImageJ軟件分析條帶。

3.7ELISA法測(cè)定血清中AngⅡ和Ang(1-7)的含量將所取血液室溫靜置2 h，4 ℃離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，取上清。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，選用Dunnett-t檢驗(yàn)比較時(shí)間組與對(duì)照組間差異；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1激光多普勒血流儀測(cè)定的血流值

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肢體結(jié)扎后血流值大幅度下降，幾乎全部被阻斷(P<0.05)；肢體解套扎后，血流值有所回升，當(dāng)再灌注2 h與再灌注4 h時(shí)血流值緩慢回升，與對(duì)照組無(wú)顯著差異；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，再灌注6 h后血流值下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2頸動(dòng)脈血壓測(cè)定結(jié)果

因?qū)φ战M未經(jīng)缺血處理，血壓保持穩(wěn)定；模型組在缺血期間，血壓雖有所下降但程度不明顯；再灌注10 min血壓出現(xiàn)明顯回升，基本達(dá)到缺血前水平；再灌注10 min后，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組血壓逐漸下降，且下降程度明顯(P<0.05),見(jiàn)圖1。

Figure 1.The changes of blood flow ratio and mean arterial pressure (MAP) at different time points. TS: tourniquet shock.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同時(shí)點(diǎn)血流和血壓變化

3血管反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果

各血管在10-9mol/L、3×10-9mol/L和10-8mol/L濃度NE刺激下均無(wú)明顯收縮；對(duì)照組的血管在3×10-8mol/L濃度以上NE刺激下隨著NE的濃度升高，其收縮百分比逐漸升高；而模型組在3×10-8mol/L和10-7mol/LNE刺激的下血管收縮百分比隨著去甲腎上腺素的濃度的升高而升高，超過(guò)3×10-7mol/L濃度后，血管收縮百分比反而隨著NE濃度的升高而降低；再灌注10 min組對(duì)于NE的收縮反應(yīng)性高于其它模型組，甚至在10-7mol/L和3×10-7mol/L 濃度NE的刺激下，其收縮幅度高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；其余各模型組對(duì)于NE的反應(yīng)性在各個(gè)濃度均低于對(duì)照組(P<0.05)，再灌注4 h組的血管反應(yīng)性最低，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The changes of vascular reactivity at different time points. Mean±SD.n=6.

圖2不同時(shí)點(diǎn)血管反應(yīng)性變化

4血管損傷的形態(tài)學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組血管內(nèi)壁光滑，管腔規(guī)整，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，各層彈力膜薄厚均勻，連續(xù)性好；再灌注10 min組血管未見(jiàn)明顯損傷；其余各模型組血管均有不同程度的損傷，表現(xiàn)為血管管腔不規(guī)整，內(nèi)膜粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞不完整，彈力纖維斷裂，各彈力纖維間排列疏松，薄厚不均，部分甚至形成團(tuán)塊狀凸向管腔。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷評(píng)分逐漸升高,見(jiàn)圖3。

Figure 3.Vascular injury at different time points (HE staining，×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3不同時(shí)點(diǎn)血管損傷情況

電子顯微鏡下，對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞扁平，細(xì)胞之間排列緊密，細(xì)胞核呈橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，內(nèi)彈力膜排列規(guī)整，膜下可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞及排列整齊的彈力纖維；再灌注10 min組血管損傷不明顯；其余模型組損傷較明顯，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞呈柱狀，排列不規(guī)則，胞間部分緊密連接消失，胞內(nèi)胞質(zhì)深染，細(xì)胞器模糊，線粒體腫脹，可見(jiàn)空泡或嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，內(nèi)彈力膜粗細(xì)不均，平滑肌細(xì)胞、纖維組織增生,見(jiàn)圖4。

Figure 4.The images of transmission electron microscopy at different time points.

圖4不同時(shí)點(diǎn)透射電鏡的觀察結(jié)果

5RAS成分測(cè)定結(jié)果

5.1AT1受體/Mas受體和ACE/ACE2測(cè)定結(jié)果AT1受體在對(duì)照組表達(dá)最高，再灌注10 min開(kāi)始降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，AT1受體蛋白的表達(dá)逐漸降低(P<0.05)；而Mas受體在對(duì)照組表達(dá)最低，再灌注10 min組雖然有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Mas受體蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，再灌注12 h時(shí)表達(dá)最高,見(jiàn)圖5。

Figure 5.The protein expression of vascular AT1 receptor/Mas receptor at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group (0 h).

圖5不同時(shí)點(diǎn)血管AT1受體/Mas受體的蛋白表達(dá)

ACE在對(duì)照組表達(dá)最低，在模型組中隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸升高，再灌注10 min組與再灌注1 h組升高不明顯，其余模型組升高顯著(P<0.05)；ACE2在對(duì)照組表達(dá)最高，在模型組中隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低，差異顯著(P<0.05)，再灌注12 h組表達(dá)最低,見(jiàn)圖6。

5.2AngⅡ和Ang(1-7)測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組AngⅡ的含量增高，除再灌注10 min模型組外，其余模型組增高均比較明顯(P<0.05)，12 h組含量最高；而Ang(1-7)的含量在對(duì)照組表達(dá)最高，在模型組各組表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，12 h組含量最低,見(jiàn)圖7。

Figure 6.The protein expression of vascular ACE/ACE2 at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group (0 h).

圖6不同時(shí)點(diǎn)血管ACE/ACE2的蛋白表達(dá)

Figure 7.The content of serum AngⅡ/Ang(1-7) at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group (0 h).

圖7不同時(shí)點(diǎn)血清AngⅡ/Ang(1-7)的含量變化

討論

對(duì)于血管低反應(yīng)性發(fā)生的機(jī)制，現(xiàn)有多種學(xué)說(shuō)，例如一氧化氮及其繼發(fā)性產(chǎn)物大量生成刺激血管引起血管舒張并通過(guò)激活多種機(jī)制介導(dǎo)血管低反應(yīng)性的發(fā)生[7]；腎上腺素受體失敏及下調(diào)，即受體與配體親和力下降或受體表達(dá)減少以及受體偶聯(lián)酶活性降低或脫偶聯(lián)等；鈣超載及鈣失敏，即血管平滑肌細(xì)胞肌肉收縮蛋白對(duì)鈣的敏感性降低等。眾多研究表明，休克后血管反應(yīng)性呈雙向變化，例如在膿毒性休克的代償期血管反應(yīng)性是短暫升高的，而失代償期血管反應(yīng)性下降明顯，本實(shí)驗(yàn)采用的是離體組織灌流系統(tǒng)觀察主動(dòng)脈環(huán)對(duì)NE的反應(yīng)性，其結(jié)果與膿毒性、失血性休克研究結(jié)果一致[8]。

失血性休克后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)被激活，引起循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)大量的兒茶酚胺及血管緊張素Ⅱ的釋放[10]。本實(shí)驗(yàn)研究提示，止血帶休克后同樣存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活，且RAS系統(tǒng)表達(dá)明顯失衡，推測(cè)其可能與血管低反應(yīng)性的發(fā)生有關(guān)。

研究表明，內(nèi)毒素休克中AT1受體相關(guān)蛋白表達(dá)下降，并介導(dǎo)了血管對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性降低[11]，一項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)AT1受體的減少較其它機(jī)制(如離子通道、NO、硝酸鹽等)相比在血管低反應(yīng)性的發(fā)生中更具重要性[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AT1受體的蛋白表達(dá)量隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低，再灌注12 h組的表達(dá)量最低。受體表達(dá)量的降低，直接導(dǎo)致AngⅡ?qū)ρ艿氖湛s作用減小，推測(cè)此為血管反應(yīng)性下降的另一重要機(jī)制。

文獻(xiàn)表明，Ang(1-7)與Mas受體的結(jié)合通過(guò)nNOS作用能介導(dǎo)NO的生成。Whitaker也指出，在失血性休克中，抑制Ang(1-7)與Mas受體的結(jié)合，能減少NO的產(chǎn)生[13]，說(shuō)明Mas能誘導(dǎo)NO的生成。在血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制中，NO起重要作用，如NO可使血管平滑肌內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶激活，細(xì)胞內(nèi)的cGMP濃度升高，環(huán)鳥(niǎo)苷酸-蛋白激酶G通路介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈的去磷酸化，從而引起血管舒張。除此之外，NO還可通過(guò)激活cGMP-PKG通路進(jìn)而開(kāi)放大電導(dǎo)鈣依賴性鉀通道引起細(xì)胞膜的超極化而導(dǎo)致血管反應(yīng)性的降低，或者通過(guò)激活多聚-ADP核酶引起血管低反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)中Mas受體表達(dá)量隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，其可以更好地與血清中Ang(1-7)結(jié)合生成NO，進(jìn)而介導(dǎo)血管低反應(yīng)性的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，在止血帶休克中，隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟以及肺組織中的ACE表達(dá)含量逐漸增高，ACE2的含量逐漸減少，血清中AngⅡ增加、Ang(1-7)減少。本實(shí)驗(yàn)中，隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)主動(dòng)脈中ACE表達(dá)量逐漸增高，而ACE2的表達(dá)量逐漸降低，血清AngⅡ呈增高趨勢(shì)，Ang(1-7)呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明RAS軸失衡程度愈加明顯。這與本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)于止血帶休克后腎臟及肺的ACE/ACE2表達(dá)及血清AngⅡ、Ang(1-7)變化的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

綜上所述，止血帶休克后出現(xiàn)明顯的RAS系統(tǒng)失衡，其與血管低反應(yīng)性的發(fā)生可能有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Changes of aortic contractile reactivity and RAS components after tourniquet shock

WANG Li-jun1, WANG Jian-hui1,WANG Yu-juan2, FAN Su-jing1, ZHU Li-yan1, YANG Xiu-hong1

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，2NinthHospitalofTangshan,Tangshan063000,China.E-mail:ljkyxhljn@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of renin-angiotensin system (RAS) disequilibrium in hyporeactivity and injury of aorta after tourniquet shock (TS) by observing the changes of aortic contractile reactivity and RAS components after TS. METHODS: Male C57BL/6 mice (8 months old) were divided into 7 groups including control group and 6 model groups. The mice in model groups were sacrificed at reperfusion of 10 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h and 12 h. The mice in control group were not subjected to tourniquet ligation. The Doppler flowmetry was used to determine the limb blood flow. The carotid artery catheter was applied to detect the blood pressure. The isolated vascular tension tester was available to measure the reactivity of the aorta. HE staining combined with transmission electron microscopy was used to evaluate the morphology of injured aortas. The protein expression of AT1 receptor, Mas receptor, ACE and ACE2 was measured by Western blot. The serum contents of Ang Ⅱ and Ang (1-7) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with control group, the blood flow in model groups decreased gradually with the prolongation of reperfusion time. The blood pressure increased at 10 min after reperfusion, and then decreased gradually. Accordingly, vascular reaction to norepinephrine (NE) increased at 10 min and then descended. The vascular reactivity reached the lowest level at 4 h. Morphological injury score increased gradually. Vascular AT1 receptor and ACE2 proteins were reduced, while Mas receptor and ACE proteins were up-regulated compared with control group. The content of Ang Ⅱ in the serum elevated, while the content of Ang (1-7) was reduced. CONCLUSION: The mechanism of aortic reaction to NE increased temporarily in the early stage of shock and then decreased. It may be related to the morphological injury of aorta and the imbalance of RAS.

[KEY WORDS]Tourniquet shock; Aorta; Vascular contractile reactivity; Renin-angiotensin system

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.004

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 0315-3726387； E-mail: ljkyxhljn@163.com

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81372029)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. H2012401015)；唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(No.10150204A10； No.12130266b)

[收稿日期]2015- 06- 01[修回日期] 2015- 12- 03

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0405- 06

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