JAK/STAT信號通路在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷中的作用*

廖靜秋，　林佳瓊，　張偉杰，　許　翎，　智喜梅，　林　凱，　吳　文△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080)

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JAK/STAT信號通路在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷中的作用*

廖靜秋1, 2，林佳瓊1, 2，張偉杰2，許翎2，智喜梅2，林凱2，吳文2△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 探討Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路是否介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)損傷。方法: CCK-8檢測細胞存活率；Western blot法檢測內(nèi)皮細胞JAK2、STAT3、caspase-9 和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達水平；DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平；羅丹明123染色熒光顯微鏡照相法測定線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果: 高糖(40 mmol/L葡萄糖)處理HUVECs 6～12 h能上調(diào)JAK2的磷酸化，于9 h達最高峰；高糖處理HUVECs 6～12 h能上調(diào)p-STAT3水平，其中12 h表達最多；JAK/STAT通路抑制劑AG490預(yù)處理1 h可顯著抑制由高糖引起的內(nèi)皮細胞損傷，表現(xiàn)為細胞存活率升高、凋亡相關(guān)蛋白caspase-9表達和胞內(nèi)ROS生成減少、MMP及eNOS表達升高。結(jié)論: JAK/STAT信號通路參與了高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷過程。

[關(guān)鍵詞]JAK/STAT信號通路； 高糖； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； AG490

糖尿病血管病變(diabetic angiopathy)是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者失明、截肢以及死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量。高血糖通過直接或間接的影響引起血管內(nèi)皮功能異常，啟動或加重糖尿病血管病變[1]。

研究表明高糖可通過核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路[2]、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)通路[3]等細胞信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷。Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT通路參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。Marrero等[4]發(fā)現(xiàn)，高糖在腎小球濾過膜細胞通過激活JAK/STAT通路導(dǎo)致腎小球濾過膜細胞的增殖，從而引起糖尿病腎病。此外，另有研究表明在牛視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞，高糖可通過激活JAK/STAT通路上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達[5]。而對于JAK/STAT通路是否參與高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的多種損傷，目前鮮有報道。

為此，本研究旨在探討高糖在誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)損傷過程中，JAK/STAT通路是否被激活；JAK/STAT通路抑制劑AG490能否抑制高糖誘導(dǎo)HUVECs的多種損傷，從而探討JAK/STAT通路在高糖損傷血管內(nèi)皮細胞中的作用，為深入闡明JAK/STAT通路在高糖損傷血管內(nèi)皮細胞的作用及機制提供新穎的實驗依據(jù)。

材料和方法

1材料

DCFH-DA和羅丹明123(rhodamine 123, Rh123)購自Sigma； CCK-8試劑盒購自Dojindo；DMEM(低糖)培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；JAK2抗體、p-JAK2抗體、p-STAT3抗體和eNOS抗體購自CST；STAT3抗體、caspase-9抗體和GAPDH抗體購自Proteintech；HUVECs購自廣州吉妮歐公司。

2方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)在含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，同時加入1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于5% CO2、37 ℃的溫箱中培養(yǎng)。待細胞融合達80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，適度消化后加完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化作用。用滅菌槍頭將瓶壁細胞吹落形成細胞懸液。1 200 r/min離心5 min, 棄上清, 按1∶3傳代。實驗前換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后進行分組實驗。

2.2實驗分組

實驗分為4組：正常對照(control)組；高糖(high glucose，HG)損傷組：應(yīng)用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h；AG490+HG組：10 μmol/L AG490作用于HUVECs 1 h，撤去，用PBS洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；AG490組：10 μmol/L AG490作用于HUVECs 1 h。

2.3CCK-8實驗測定細胞存活率

將HUVECs接種于96孔培養(yǎng)板中，細胞在培養(yǎng)孔內(nèi)生長至大約80%時，按照實驗要求給予不同處理，于每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)，波長設(shè)定為450 nm。按公式：細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，求出處理組細胞存活率，重復(fù)3次。

2.4Western blot法檢測JAK2、STAT3、caspase-9和eNOS的表達

將HUVECs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長至80%時給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2次，各皿加入80 μL裂解液后置4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進行測定?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加入各種I抗[p-JAK2和JAK2(1∶2 000)，p-STAT3、STAT3和 caspase-9(1∶5 000)，eNOS(1∶1 000)]，4 ℃過夜，然后用TBST洗3次(每次10 min)，加入 II 抗(1∶10 000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗3次(每次10 min)。ECL發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2.5細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量的檢測

DCFH-DA是一種自身不能發(fā)熒光的化合物，可自由穿過細胞膜，被胞內(nèi)ROS氧化為有熒光的DCF。通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內(nèi)ROS水平。將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞生長貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗3次，將HUVECs與10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機地選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，采用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均綠色熒光強度，進而對每組的各個樣本進行統(tǒng)計分析。

2.6細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)含量的測定

Rh123是一種可被線粒體吸收的綠色熒光染料，其吸收值隨細胞MMP 的改變而變化，因此可根據(jù)其熒光強度來間接反映MMP的高低。將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁生長至大約80%時，給予各實驗組不同的處理因素，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，將HUVECs與10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min, 再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機地選取5個不重復(fù)區(qū)攝片。用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均熒光強度，進而對每組的各個樣本進行統(tǒng)計分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，采用SNK-q檢驗(實驗組組間比較)及Dunnett-t檢驗(實驗組與對照組比較)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1高糖上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的p-JAK2和p-STAT3蛋白表達

使用高糖(40 mmol/L)處理HUVECs 6～12 h可顯著上調(diào)JAK2蛋白磷酸化水平(P<0.05)，其中在9 h時p-JAK2表達達到最高峰；應(yīng)用高糖處理HUVECs 6～12 h可顯著上調(diào)p-STAT3表達(P<0.01)，并且在12 h時STAT3蛋白磷酸化水平最高，見圖1。

Figure 1.High glucose (40 mmol/L) up-regulated the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1高糖促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平

2JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞毒性

高糖(40 mmol/L)處理HUVECs 24 h可產(chǎn)生細胞毒性，使細胞存活率降低至(68.6±2.4)%。在高糖處理細胞前，分別應(yīng)用5、10、20、40和80 μmol/L AG490(為JAK/STAT通路的抑制劑)預(yù)處理HUVECs 1 h，其中10、20、40和80 μmol/L AG490均能顯著抑制HG引起的細胞毒性，使細胞存活率明顯升高，但各組之間無明顯差異；而單獨應(yīng)用80 μmol/L AG490處理細胞1 h則對細胞存活率無明顯影響，見圖2。據(jù)此，本實驗應(yīng)用10 μmol/L AG490作為后續(xù)實驗的有效保護濃度。

3JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡

分別用不同葡萄糖糖濃度(10～40 mmol/L)處理HUVECs 24 h，隨著葡萄糖濃度升高，caspase-9的表達水平也逐漸升高，與對照組相比，各組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中濃度為40 mmol/L時，caspase-9表達增加最多。同時，用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 6～24 h均能明顯增加的caspase-9的表達水平(P<0.01)，其中12 h的水平達最高峰。但是，在HG作用前，用10 μmol/L AG490預(yù)處理HUVECs 1 h能明顯抑制HG對caspase-9的上調(diào)作用，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。10 μmol/L AG490本身對caspase-9的基礎(chǔ)表達水平無明顯影響，見圖3。

Figure 2.The inhibitor of JAK/STAT signaling pathway antagonized high glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced cytotoxicity in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖2JAK/STAT通路抑制劑減輕高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞毒性

Figure 3.The inhibitor of JAK/STAT signaling pathway attenuated high glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced apoptosis of HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖3JAK/STAT通路抑制劑減輕高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡

4JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激

圖4顯示，HG作用于HUVECs 24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI；反映ROS水平的一個指標(biāo))明顯增強，與正常對照組相比，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。但經(jīng)AG490預(yù)處理1 h可使胞內(nèi)ROS堆積明顯減少，MFI從 (9.8±2.7)%減少至 (4.2±2.0)%，與高糖組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。而單獨AG490預(yù)處理則對胞內(nèi)ROS生成無明顯作用，見圖4。

5JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的線粒體損傷

HG作用HUVEC 24 h使胞內(nèi)Rh123的MFI(反映MMP大小的指標(biāo))從(9.4±1.2)%降低至 (3.5±0.7)%，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。然而，AG490預(yù)處理1 h可使MFI升高至(6.1±1.1)%，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。單獨AG490預(yù)處理本身對HUVECs的MMP大小無顯著作用，見圖5。

6JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS表達水平的下調(diào)作用

采用不同葡萄糖濃度(10～40 mmol/L)分別處理HUVECs 24 h后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖濃度為40 mmol/L時對eNOS的表達具有明顯的抑制作用。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。同時，用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 3～24 h，其中12 h與24 h均可明顯下調(diào)eNOS的表達水平(P<0.01)，而且在24 h時表達量最低。采用AG490預(yù)處理HUVECs 1 h能減輕高糖引起的eNOS表達水平的降低，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。AG490本身對eNOS的基礎(chǔ)水平無明顯影響，見圖6。

Figure 4.The inhibitor of JAK/STAT signaling pathway reduced high glucose(HG)-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖4JAK/STAT通路抑制劑減少高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧堆積

Figure 5.The inhibitor of JAK/STAT signaling pathway attenuated high glucose (HG)-induced reduction of MMP in HUVECs. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖5JAK/STAT通路抑制劑減輕高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞線粒體膜電位降低

Figure 6.The inhibitor of JAK/STAT signaling pathway antagonized high glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced decline of the expression of eNOS in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖6JAK/STAT通路抑制劑減弱高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS表達的下調(diào)作用

討論

高血糖作為各型糖尿病的共同特征，除可引起代謝障礙外，更重要的一點是可引起內(nèi)皮細胞的損傷，進而啟動或加重糖尿病血管病變。本研究在高糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型再次證實，高糖對內(nèi)皮細胞有明顯的損傷作用，表現(xiàn)在使細胞存活率下降，凋亡相關(guān)蛋白caspase-9表達增多,ROS生成增加，線粒體膜電位丟失，eNOS生成減少，上述結(jié)果均與既往研究相一致[1, 6-7]。

目前研究已證實，外界刺激因子與調(diào)節(jié)各種細胞行為及細胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化緊密相關(guān)，其中JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)這一過程中發(fā)揮著重要作用。JAK是一類胞質(zhì)內(nèi)非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶，包括4個家族:JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。STAT是一類能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白，是JAK的下游底物，其家族包括7個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。JAK家族酪氨酸磷酸化后募集胞質(zhì)中的STATs，使其磷酸化后形成二聚體進入細胞核內(nèi)，在核內(nèi)它們與目的基因啟動子結(jié)合，進而激活基因表達，實現(xiàn)對細胞的生理及病理反應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)控，在細胞的生長、活化、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[8]。

JAK/STAT通路在血管系統(tǒng)的病理生理中發(fā)揮著非常重要的作用。Manea等[9]發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EAhy926，阻斷JAK/STAT通路可抑制高糖引起的內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的升高，而后者在維持血管內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用；Amiri等[10]研究表明高糖可通過JAK2/STAT通路促進血管平滑肌的增殖； Tawfik等[11]應(yīng)用HG和H2O2干預(yù)主動脈內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)，JAK2在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。由此可見，JAK/STAT通路與血管病變及內(nèi)皮細胞功能紊亂密切相關(guān)。根據(jù)這一系列研究報道，我們推測JAK/STAT通路可能參與高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞的多種損傷，而在本研究中我們也證實了這一點。高糖在引起HUVECs細胞存活率下降、caspase-9表達上調(diào)、ROS生成增加、線粒體膜電位丟失及eNOS表達減少的同時，還伴有JAK2蛋白及STAT3蛋白的激活:HG誘導(dǎo)HUVECs 6 h時p-JAK2蛋白水平明顯增加，9 h時升至頂峰，隨后逐漸下降；HG處理HUVECs 6 h時p-STAT3顯著增加，12 h時達頂峰。

在上述實驗基礎(chǔ)上，為進一步探討JAK/STAT通路是否參與高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷過程，本研究觀察了該通路抑制劑AG490對高糖損傷內(nèi)皮細胞作用的影響。AG490是一種選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制劑，可有效阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及STAT3的活化[12]，進而抑制相應(yīng)的生理、病理效應(yīng)。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，AG490可有效抑制高糖損傷內(nèi)皮細胞這一過程，顯著提高內(nèi)皮細胞的存活率，減少凋亡蛋白caspase-9的表達及ROS的生成，保護線粒體膜電位以及抑制eNOS的生成減少，這為深入闡明JAK/STAT通路在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷的作用及其機制提供了新穎的實驗證據(jù)。

JAK/STAT通路是最早被確認的由脂肪組織細胞分泌的信號分子——瘦素的下游信號通路。研究表明，瘦素能引起血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)和氧化應(yīng)激[13-15]。但是瘦素-JAK/STAT通路是否介導(dǎo)高血糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷迄今尚未明了，值得今后進一步研究探討。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Role of JAK/STAT signaling pathway in high glucose-induced damage in human umbilical vein endothelial cells

LIAO Jing-qiu1, 2, LIN Jia-qiong1, 2, ZHANG Wei-jie2, XU Lin2, ZHI Xi-mei2,LIN Kai2, WU Wen2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofEndocrinology,EastWard,GuangdongGeriatricInstitute,GuangdongAcademyofMedicalSciences,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China.E-mail:wuwen1964@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signaling pathway mediates high glucose-induced damage in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: The cell viability was examined by CCK-8 assay. The expression levels of JAK2, STAT3, caspase-9 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) were detected by Western blot. The intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were tested by DCFH-DA staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was measured by rhodamine 123 staining followed by photofluorography. RESULTS: Treatment of HUVECs with high glucose (40 mmol/L glucose) for 6～12 h enhanced the protein level of phosphorylated JAK2, peaking at 9 h. Treatment of the cells with high glucose for 6～12 h also increased the protein level of p-STAT3 with the peak value at 12 h. Pretreatment with the inhibitor of JAK/STAT pathway AG490 for 1 h before exposure of the HUVECs to high glucose significantly inhibited the high glucose -induced injury, as evidenced by an increase in the cell viability, decreases in the expression of caspase-9 and the intracellular ROS production, and increases in MMP and the expression of eNOS. CONCLUSION: JAK/STAT signaling pathway is involved in the high glucose-induced damage in HUVECs.

[KEY WORDS]JAK/STAT signaling pathway; High glucose; Human umbilical vein endothelial cells; AG490

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.002

[中圖分類號]R363.2； R587.2

[文獻標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 020-83827812； E-mail： wuwen1964@163.com

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81450062);廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2015A030313872)

[收稿日期]2015- 10- 30[修回日期] 2015- 12- 14

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0392- 06

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