益腎祛濁方對PCOS—IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影響

張曉丹+++蔡云+++許昕

[摘要] 目的 探討益腎祛濁方對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠胃動素相關(guān)肽（Ghrelin）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）及血清內(nèi)脂素（VF）水平的影響。 方法 將84只6周齡SD雌性大鼠完全隨機化分組分為7組，每組各12只，具體如下：空白組、模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組、益腎組及二甲雙胍組。造模成功后，灌服不同劑量益腎祛濁方或益腎方（益腎祛濁方高劑量組6460 mg/kg，益腎祛濁方中劑量組3230 mg/kg，益腎祛濁方低劑量組1615 mg/kg，益腎組1400 mg/kg，空白組灌服生理鹽水），以二甲雙胍作對照，觀察用藥后各組大鼠Ghrelin、SHBG及VF水平的變化。 結(jié)果 模型組Ghrelin水平較空白組顯著降低（P < 0.05），益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin水平較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。模型組SHBG水平較空白組降低（P < 0.05），各治療組SHBG水平較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。模型組VF水平較空白組升高（P < 0.05），各治療組VF水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。模型組睪酮（T）、黃體生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值與空腹胰島素（FINS）較空白組顯著升高（P < 0.05），益腎祛濁方各劑量組T及LH/FSH比值較模型組降低，益腎組T水平較模型組降低，益腎祛濁方各劑量組及二甲雙胍組FINS較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 益腎祛濁方能通過改善PCOS-IR模型大鼠的胰島素抵抗相關(guān)因子，抑制雄激素合成增加，恢復(fù)機體糖、脂代謝平衡，遏制PCOS-IR的惡性循環(huán)，達到治療PCOS-IR的目的。

[關(guān)鍵詞] 多囊卵巢綜合征胰島素抵抗；益腎祛濁方；胃動素相關(guān)肽；性激素結(jié)合球蛋白；內(nèi)脂素

[中圖分類號] R711.75 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0009-05

Effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， SHBG and VF in rats with PCOS-IR

ZHANG Xiaodan1 CAI Yun2 XU Xin1

1.Department of Gynecology， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China； 2.Department of Gynecology， Beijing Tongzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing 100142， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， sex hormone-binding globulin （SHBG） and visfatin （VF） in rats with polycystic ovarian syndrome-insulin resistance （PCOS-IR）. Methods Eighty-four female SD rats aged 6-week old were completely randomized into 7 groups， with 12 rats in each group， the groups were as followed： blank group， model group， high dose of Yishen Quzhuo Decoction group， middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group， low dose of Yishen Quzhuo Decoction group， Yishen group and Metformin group. After the model was established successfully， different doses of Yishen Quzhuo Decoction or Yishen Decoction were given by gavage （high dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 6460 mg/kg； middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 3230 mg/kg； low dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 1615 mg/kg； Yishen group： 1400 mg/kg； blank group： normal saline）， Metformin was taken as control， the level changes of Ghrelin， SHBG and VF in rats of each group after medication were observed. Results The level of Ghrelin in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of Ghrelin in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Yishen group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of SHBG in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of SHBG in each treatment group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of VF in the model group was significantly higher than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of VF in each treatment group were significantly lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of testosterone （T）， luteinizing hormone/follicle stimulating hormone （LH/FSH）， fasting insulin （FINS） were significantly higher than those of blank group （P < 0.05）， the levels of T， LH/FSH in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group were lower than those of model group， the level of T in Yishen group was lower than that of model group， the levels of FINS in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Metformin group were lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Yishen Quzhuo Decoction can improve the factors related to insulin resistance of rats with PCOS-IR， inhibit the increase of androgen synthesis， restore the balance of glycometabolism and lipid metabolism， contain the vicious circle of PCOS-IR， so as to achieve the purpose of treating PCOS-IR.endprint

[Key words] Polycystic ovarian syndrome-insulin resistance； Yishen Quzhuo Decoction； Ghrelin； Sex hormone-binding globulin； Visfatin

多囊卵巢綜合征（PCOS）是青春期及育齡期女性常見的內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病，以稀發(fā)排卵或持續(xù)無排卵、高雄激素和/或高胰島素血癥、卵巢多囊樣變?yōu)橹饕卣?，常見月?jīng)失調(diào)或閉經(jīng)、不孕、多毛、肥胖、胰島素抵抗（IR）等[1]。IR是指各種原因使胰島素促進組織細(xì)胞對葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥以維持代謝狀態(tài)所需血糖水平，是機體靶細(xì)胞對正常水平胰島素反應(yīng)低下的一種病理改變[2]，特點為空腹血糖值正常而空腹胰島素（FINS）水平升高。1980年，Berger等[3]發(fā)現(xiàn)PCOS肥胖婦女血清胰島素與睪酮、雄烯二酮有明顯相關(guān)性，推測高胰島素血癥與PCOS發(fā)病有關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCOS患者IR發(fā)生率為50%～70%[4]。多項研究顯示，胃動素相關(guān)肽（Ghrelin）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、血清內(nèi)脂素（VF）與PCOS-IR密切相關(guān)。本研究基于“沖脈隸于陽明”“腎主生殖”等中醫(yī)經(jīng)典理論，在前期研究[5]及動物實驗[6]基礎(chǔ)上，進一步驗證益腎祛濁方（國家專利申請?zhí)?0170368825.2）對PCOS-IR模型大鼠Ghrelin、SHBG、VF等IR相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取84只6周齡SD雌性大鼠，體重約150 g，將其完全隨機化分為七組，每組12只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物合格證書編號：11401300038666；在北京市中醫(yī)研究所屏蔽動物房飼養(yǎng)，許可證編號：SCXX（京）2009-0017。

1.2 實驗用藥

鹽酸二甲雙胍腸溶片（北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司，批號H11021560）；羥甲纖維素鈉（安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號160301）；來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號HI9991001）。

益腎祛濁方由續(xù)斷、桑寄生、敗醬草等12味中藥組成。制備成中藥水煎劑，按成人用量折算成大鼠用量（每天正常人給藥劑量/成人體重×6.25，默認(rèn)成人體重60 kg），設(shè)為中劑量（3230 mg/kg）。中劑量濃度為低劑量濃度的2倍（6460 mg/kg），高劑量濃度為中劑量濃度的2倍（1615 mg/kg）。益腎方由續(xù)斷、桑寄生等6味中藥組成，制備成中劑量以作對照（1400 mg/kg）。

1.3 實驗試劑

Ghrelin酶聯(lián)免疫試劑盒（Phoenix Pharmaceuticals，貨號PK-031-31）、SHBG酶聯(lián)免疫試劑盒（CLOUD-CLONE CORP，貨號SEA396Ra）、VF酶聯(lián)免疫試劑盒（CLOUD-CLONE CORP，貨號SEA638Ra），卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、FINS放射免疫試劑盒，由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司提供。

1.4 造模方法

參考蔡云等[7]的來曲唑聯(lián)合高脂飼料造模法，建立PCOS-IR大鼠模型。該實驗結(jié)果顯示：來曲唑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)大鼠30 d，大鼠體重顯著增加，血清T、LH/FSH比值、FINS等均異常升高，空腹血糖值正常，大鼠卵巢可見多囊樣改變，所有數(shù)據(jù)符合PCOS-IR典型病理特征，證實造模成功。

1.5 治療方法

七組大鼠分組情況如下：空白組、模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組、益腎組、二甲雙胍組。造模成功后，各治療組大鼠給予相應(yīng)劑量藥物灌胃，空白組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌服15 d。其間空白組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.6 觀察指標(biāo)

各組大鼠于灌胃結(jié)束后禁食水24 h后，以2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取大鼠腹主動脈血，離心并收集血清。Ghrelin、SHBG、VF等均用酶聯(lián)免疫吸附法測定，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析。各指標(biāo)經(jīng)正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布及具備方差齊性，采用Tukey法作組間多重比較，方差不齊時用Dunnett T3法作組間多重比較。衡量變量間密切程度用Pearson相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實驗大鼠灌胃后，各項生命體征正常，試驗周期內(nèi)無大鼠死亡。

2.2 益腎祛濁方對PCOS-IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影響

模型組Ghrelin、SHBG水平較空白組降低，VF水平較空白組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin水平較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；益腎祛濁方高劑量組Ghrelin水平較二甲雙胍組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。各治療組SHBG水平較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；各治療組VF水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；益腎祛濁方中劑量組及益腎組VF水平較二甲雙胍組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 益腎祛濁方對PCOS-IR大鼠T、LH/FSH、FINS的影響

模型組T、LH/FSH及FINS水平較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。益腎祛濁方各劑量組及益腎組T水平明顯低于模型組；益腎祛濁方各劑量組LH/FSH比值明顯低于模型組；益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組及二甲雙胍組FINS水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。二甲雙胍組各激素指標(biāo)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。endprint

2.4 Ghrelin、SHBG、VF與T、LH/FSH及FINS的相關(guān)性

2.4.1 空白組及益腎祛濁方各劑量組Ghrelin與T水平顯著相關(guān)；模型組、二甲雙胍組、益腎組Ghrelin與T水平無顯著相關(guān)性。各組SHBG與T水平顯著相關(guān)。各組VF與T水平無顯著相關(guān)性。見表3。

2.4.3 空白組、益腎祛濁方各劑量組及益腎組Ghrelin與FINS水平顯著相關(guān)。各組SHBG與FINS水平無顯著相關(guān)性?？瞻捉M、益腎祛濁方各劑量組及二甲雙胍組VF與FINS水平顯著相關(guān)，益腎組VF與FINS水平無顯著相關(guān)性。見表5。

3 討論

自1980年Berger首次提出IR參與PCOS發(fā)病，研究證實IR是PCOS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和致病基礎(chǔ)[9]。西醫(yī)治療PCOS-IR首選二甲雙胍，該藥通過促進腸道對葡萄糖的吸收，抑制糖原分解，減少肝糖原異生，提高外周組織對葡萄糖的敏感性[10]。二甲雙胍治療PCOS-IR，可降低胰島素水平，糾正高雄激素血癥，改善排卵功能，但遠(yuǎn)期效果不夠理想，且伴有胃腸道不良反應(yīng)[11]。中醫(yī)藥治療PCOS，可顯著降低睪酮水平，恢復(fù)月經(jīng)周期，提高患者排卵功能，療效優(yōu)于達英-35，且不良反應(yīng)少[12]。本研究提示，益腎祛濁方對PCOS-IR模型大鼠具有良好的治療作用，療效優(yōu)于二甲雙胍。

Ghrelin是一種具有強促生長激素釋放功能的活性多肽，在中樞、卵巢及胃腸道發(fā)揮多種調(diào)控作用[13-14]。研究證明，PCOS患者經(jīng)治療后，血FINS水平明顯下降，而Ghrelin水平顯著升高[15]，由此可知FINS與Ghrelin之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。SHBG能特異性結(jié)合并轉(zhuǎn)運性激素，調(diào)控性激素濃度，影響其生物利用度[16]。血中性激素水平可影響SHBG在肝臟的合成過程[17]，LH異常升高可刺激卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生過多雄激素，高濃度睪酮抑制肝臟合成SHBG；SHBG缺乏會導(dǎo)致游離睪酮增多，進而轉(zhuǎn)化為過多雌酮，E1>E2反饋性刺激LH分泌增多，誘發(fā)高胰島素血癥，形成惡性循環(huán)。VF是一種脂肪細(xì)胞因子，具有類胰島素的降糖活性[18-20]，參與組織局部炎性反應(yīng)等。VF可促使脂肪細(xì)胞分化和存儲以調(diào)節(jié)脂代謝，通過類胰島素樣作用調(diào)節(jié)糖代謝[21]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，PCOS與全身低度反應(yīng)炎癥有關(guān)，是一種慢性炎癥過程[22]，而PCOS-IR是PCOS發(fā)展到代謝紊亂的嚴(yán)重階段，VF水平升高，也是PCOS-IR的重要病機之一。

根據(jù)PCOS-IR的特征及證候，中醫(yī)婦科學(xué)將其歸屬于“閉經(jīng)”“不孕”“崩漏”等范疇。本病以腎虛、脾虛痰濕、陽明濁熱蓄積等病機為主，涉及三焦、胃腸、腎等多個臟腑；本研究治法為補腎健脾，祛濁調(diào)經(jīng)。前期實驗結(jié)果證實益腎祛濁方能夠改善PCOS-IR大鼠高雄激素血癥，糾正LH/FSH比值異常等內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，降低FINS水平，改善卵巢多囊樣變，綜合療效較二甲雙胍更具優(yōu)勢[6]。本研究結(jié)果提示，益腎祛濁方能使低水平Ghrelin升高，提高SHBG濃度，糾正高雄激素狀態(tài)，改善內(nèi)分泌紊亂，恢復(fù)生殖軸功能；同時降低異常升高的FINS與VF水平，改善脂代謝及體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)，遏制PCOS-IR高雄激素及高胰島素血癥糖脂代謝紊亂的惡性循環(huán)，達到治愈疾病的目的。通過分析各因子間相關(guān)性可證實，PCOS-IR破壞了機體內(nèi)分泌與脂代謝平衡，益腎祛濁方可使性激素及IR相關(guān)因子恢復(fù)平衡狀態(tài)，且效果優(yōu)于益腎方。鑒于Ghrelin與T和FINS的雙重顯著相關(guān)性，考慮其是兼能觀察內(nèi)分泌和脂代謝紊亂與否的敏感指標(biāo)。

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（收稿日期：2017-08-04 本文編輯：張瑜杰）endprint