劉義剛,周治全,周 超,張 強,李 蘭(.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院,四川成都630;.成都和諧九洲酒業(yè)有限公司,四川成都638)
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全細胞酯化曲(酶)在生物酯化液中的應用
劉義剛1,周治全2,周超2,張強2,李蘭1
(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院,四川成都611130;2.成都和諧九洲酒業(yè)有限公司,四川成都611238)
摘要:全細胞酯化曲(酶)是一種脂肪酶活性很高的食品級酵母細胞菌體凍干粉,能高效快速地將黃水酒尾中的有機酸生物合成相應的芳香酯。在含1%有機酸(己酸)及酒精度為20%vol~35%vol的黃水酒尾酯化液中,加入0.3%全細胞酯化曲(酶),于25~45℃、自然pH值條件下,發(fā)酵酯化15 d,其生物酯化液中己酸乙酯含量平均達687.3mg/100 mL;用25~50 kg/甑生物酯化液串蒸酒醅,可使基酒中己酸乙酯含量增加100mg/100 mL以上,乳酸乙酯含量降低50mg/100 mL以上。生物酯化液直接蒸餾可生產己酸乙酯高達30 g/L以上的高酯調味酒,其酯香濃郁、純正協(xié)調,醇甜凈爽,可代替己酸乙酯應用于固液法白酒生產,減少白酒香料的用量,能明顯消除新酒的辛辣、異味,去除酒精味和香料味,增加酒的固態(tài)感和自然感,改善酒的品質。
關鍵詞:全細胞酯化曲(酶);生物酯化液;串蒸;增己降乳;調味酒;白酒
在傳統(tǒng)固態(tài)濃香型白酒發(fā)酵過程中,己酸乙酯作為濃香型白酒的主體風味物質,其含量高低直接影響曲酒的品質。己酸乙酯的形成是以己酸菌為主的多菌系和多種酶協(xié)同作用的結果,主要有兩條合成途徑:一是在以己酸菌為主的多菌體共同作用下,將乙醇、乙酸結合成丁酸,并進一步合成己酸,己酸與乙醇在酯化酶的作用下合成己酸乙酯;二是在發(fā)酵過程中,芽孢桿菌利用乙酸乙酯和乙醇合成丁酸乙酯,并進一步合成己酸乙酯。傳統(tǒng)濃香型酒釀造體系中己酸乙酯生成緩慢,生產上為了增加酒香,通常會采取“回酒發(fā)酵”“夾泥發(fā)酵”“人工培養(yǎng)老窖泥”“雙輪底”“延長發(fā)酵周期”等技術措施來提高己酸乙酯等酯香物質的含量,但是這些技術措施在實際生產中也存在諸如發(fā)酵周期長、設備利用率低、糧耗高、基酒異雜味較大、出酒率低、母糟質量較差等問題。目前濃香型白酒生產普遍存在己酸乙酯含量小于乳酸乙酯,己乳比嚴重失調,濃香風格不突出的現象;北方生產企業(yè)因窖泥容易老化這種現象更為突出。微生物酶法生產生物酯化液技術可以很好地彌補窖內生香不足,大幅度提高基酒中己酸乙酯含量,達到增己降乳、全面改善酒質的目的。
生物酯化液就是利用微生物技術與發(fā)酵工程技術,采用生物酶酯化法,將黃水、尾水等中的有機酸類物質及醇類物質在脂肪酶的作用下轉化為以己酸乙酯為主的多種香味成分的香酯混合液。生物方法生產的酯類物質在美國聯邦法規(guī)及國外文獻中都定為天然香料,微生物酶法不但反應條件溫和、能耗低,反應速率和轉化率高,而且產品純度高,美國聯邦法規(guī)已確認為天然品[1]。微生物酶法生成的己酸乙酯等香酯與固態(tài)發(fā)酵生成的一樣,屬天然香料,其香味自然純正,在白酒勾兌中具有協(xié)調的自然香,產品風味柔和、香醇自然,能增強白酒的固態(tài)感和自然感。
生物酯化液應用于傳統(tǒng)白酒生產能大幅度提高濃香型白酒優(yōu)質品率,應用于串蒸酒醅,可使基酒質量迅速提高,實現普通白酒向優(yōu)質酒轉化,突出濃香型白酒己酸乙酯的主體香且酒體協(xié)調;應用到白酒勾兌中,采用生物酯化生成的高酯酒完全能代替化工合成香料,從而解決外加香不自然協(xié)調、存在的“浮香”的質量問題。
生產高質量的酯化液除了要因地制宜制定科學合理的酯化液配方外,關鍵是要有能高效地將有機酸轉化為生物酯的高活性脂肪酶即所謂的酯化曲(酶)。當前白酒廠在生產酯化液時使用的酯化曲(酶)多為粗酶制劑(如大曲、根霉、紅曲霉等),這些粗酶制劑存在不足之處,如用曲量大(5%~10%)、效果不明顯、活性不穩(wěn)定、酶活力較低、酯化時間較長,香味物質含量低,風味不夠協(xié)調、有異雜味等。本方案創(chuàng)新使用的酯化曲是一種新型高效白酒專用酯化曲(酶)即全細胞酯化曲(酶),全細胞酯化曲(酶)是一種活性很高的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB),它是一種新型的全細胞脂肪酶制劑,其生物合成工藝具有低能耗、無污染、轉化率高、選擇性專一等優(yōu)點,沒有界面活性,有極強的立體選擇性,且具有廣譜的底物接受性,對非水溶性和水溶性物質都有很強的催化活性,在酯化、水解、轉酯以及其他類型反應中都表現出比其他脂肪酶更為出色的催化活性。具有用量?。?.2%~0.3%)、反應時間短、產率高、操作穩(wěn)定性好等特點。用它制備生物酯化液,能克服粗酶制劑諸多不足。該種脂肪酶在白酒行業(yè)內尚未全面推廣應用,只是在實驗室下進行了清香白酒丟糟處理,將丟糟中殘存的有機酸(乙酸和乳酸)轉化為相應酯的試驗,取得了一定的效果[2]。利用全細胞酯化曲(酶)生物酯化生產酯化液的方法尚屬首創(chuàng),其生產應用方案還未見相關報道。目前該種酯化曲(酶)已開始在釀酒企業(yè)應用,達到了預期目的,取得了令人滿意的效果,制備的酯化液質量高,生成的生物酯香味純正自然,與傳統(tǒng)工藝配套使用,酒質大幅提高,增己降乳效果十分顯著。為了進一步研究和創(chuàng)新應用全細胞酯化曲(酶),本文拋磚引玉,不當之處,請同行指正。
全細胞酯化曲(酶)是以表面展示有南極假絲酵母脂肪酶B的釀酒酵母菌為出發(fā)菌株,經液體深層培養(yǎng),真空冷凍干燥制成的全細胞脂肪酶制劑。全細胞酯化曲(酶)為微黃色粉末,具有輕微的酵母固有的清香,無異味,易溶于水。它是一種脂肪酶活性很高的酵母細胞菌體凍干粉,是一種新型的釀酒酵母全細胞脂肪酶制劑。在眾多脂肪酶中,南極假絲酵母脂肪酶B的用途最為廣泛,它對非水溶性和水溶性物質都有很強的催化活性。近幾年的研究表明,在酯化、水解、轉酯以及其他類型反應中都表現出比其他脂肪酶更為出色的催化活性。尤其是在非水相催化中,具有反應時間短、產率高、操作穩(wěn)定性好的特點。該全細胞酯化曲(酶)具有多項合成功能,能受控制同時合成生物酯如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質。釀酒酵母細胞為FDA認證的安全微生物,已廣泛應用于食品工業(yè)。展示有南極假絲酵母脂肪酶B的釀酒酵母全細胞既可直接作為食品或飼料添加劑,還可全細胞催化生產食品添加劑、醫(yī)藥化工原料等[3]。用其生產酯化液制備己酸乙酯等生物香酯,完全符合綠色食品的要求。
全細胞酯化曲(酶)在非水相中催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯的能力很強,反應物己酸與乙醇的摩爾比為1∶1.25,己酸乙酯的產率高達98.0%。其最適溫度為40~45℃,適宜的酯化溫度為25~50℃;最適pH值7.5~8.0,用pH值為3.0~7.5之間的緩沖液處理24 h (20℃),其穩(wěn)定性隨pH值的增加而增加[4]。具有活性高、用量少(0.2%~0.3%)、轉化率高、酯化反應較快、生成的酯類物質香味自然純正柔和等特性。
2.1生物酯化液制備方法
生物酯化液就是利用微生物技術與發(fā)酵工程技術,將濃香型白酒生產過程中產生的黃水、酒尾等副產物中的有機酸和乙醇等成分通過生物酶轉化為富含以己酸乙酯為主要成分的酯類等白酒香味成分的混合液。將生物酯化液與傳統(tǒng)工藝相結合,采用串蒸等技術措施大幅提高基酒中己酸乙酯含量,達到“增己降乳”全面提升酒質的目的。
2.2生物酯化液制備工藝流程
黃水、酒尾等→混合→加全細胞酯化曲(酶)→攪拌均勻→25~45℃下發(fā)酵酯化15 d→成熟生物酯化液→備用。
2.3生物酯化液組成
生物酯化液原材料主要由黃水、酒尾和全細胞酯化曲(酶)組成,為了豐富生物酯化液的微量成分,可根據生產實際情況添加適量母糟和大曲等釀酒材料。酯化液組成一般是黃水∶酒尾為(10~40)∶(90~60),要求生物酯化液酒精度為20%vol~35%vol,己酸含量為1%,全細胞酯化曲(酶)用量為0.3%。
本方案經優(yōu)選并結合生產實際最終確定大生產酯化液的配方如下:優(yōu)質黃水為20%、酒尾80%(發(fā)酵正常的優(yōu)質酒尾,要求酒精度為30%vol左右,可用丟糟酒或食用酒精等調節(jié)使酯化液酒精度達25%vol左右),在此基礎上加入0.3%全細胞酯化曲(酶)、1%有機酸(己酸);另可加入1%的優(yōu)質母糟和1%優(yōu)質大曲粉。
2.3.1黃水常規(guī)成分分析和色譜分析
通過對不同窖齡、不同發(fā)酵期、不同季節(jié)黃水的成分分析,得知黃水的分析結果數據各不相同;黃水的成分比較復雜,窖池、母糟及其發(fā)酵狀況、大曲質量、操作工藝等情況不同,其成分種類和數量差異較大。其黃水的成分含量范圍見表1、表2。
表1 黃水常規(guī)成分分析結果
表2 黃水中主要微量成分分析結果 (mg/100mL)
黃水是濃香型白酒釀造過程中的副產物,為深棕色膠狀透明液體,外觀黏稠,懸絲長,味酸澀,含有豐富的醇類、酸類、醛類、酯類等呈香呈味物質,以及經長期馴化的梭狀芽孢桿菌等有益微生物。黃水中還含有豐富的有機酸尤其是乳酸、乙酸、己酸、丁酸含量最豐富,是生產酯化液的最佳材料。因黃水中乳酸含量很高,故在酯化液生產中用量不宜過大,以不超過50%為宜。
2.3.2酒尾主要成分分析
酒尾是釀酒蒸餾過程中取完酒以后的附屬產品,酒度一般在40%vol以下,色澤微渾濁、表面有微黃色油珠,聞香帶酸香、香正、味酸、微澀。酒尾中含有較多的高沸點香味物質,特別是有機酸含量較多,是生成酯的前體物質。其主要成分見表3。
2.4生物酯化液酯化設備及條件
表3 酒尾主要成分分析 (mg/100 mL)
生物酯化液酯化設備可因地制宜選用,量小時可用500~1000 L的陶壇,量大時可用10 m3以上的不銹鋼酒罐。生物酯化液生產因需要一定的溫度酯化,生產酯化液最好選在夏季氣溫高時進行,供全年使用。若常年生產需采取保溫措施。
本方案選擇的酯化設備和條件如下:
酯化設備:30 m3不銹鋼酯化罐(內置蒸汽盤管)2個,輪換使用。
酯化條件:pH值自然;溫度25~45℃;時間15 d。
2.5生物酯化液生產操作規(guī)程
(1)將黃水酒尾按比例泵入酯化罐,通氣混合均勻,使其混合后酒精度達25%vol左右,然后加入1%的發(fā)酵己酸,充分攪拌均勻。
(2)將0.3%的全細胞酯化曲(酶)用少量黃水酒尾混合液充分溶解后加入酯化液中,攪勻。
(3)將母糟和大曲粉按比例加入酯化液中,充分攪拌均勻,于25~45℃下密封發(fā)酵酯化;每天定期攪拌1次,保溫酯化15 d左右即成熟,備用。
2.6生物酯化液理化指標分析
成熟的生物酯化液具有濃郁的以己酸乙酯為主的復合香氣,酯香自然,無黃水和酒尾味。取樣前先通氣攪拌均勻,然后取發(fā)酵成熟的酯化液100 mL,將試樣倒入500 mL蒸餾燒瓶中,量取50 mL蒸餾水充分洗滌后倒入酯化液的三角瓶,將洗液一并倒入燒瓶中蒸餾,取蒸餾液100 mL,用氣相色譜測定四大酯(己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯)。6批次生物酯化液生產實際分析結果見表4。
表4 生物酯化液主要成分分析 (mg/100mL)
從表4可以看出,第6批次的酯化效果最好,酯化液中己酸乙酯最高為772.5mg/100 mL;第4批次發(fā)酵酯化液酯化效果最差,其己酸乙酯為398.1mg/100 mL,這主要是因為鍋爐停汽而保溫效果不好,酯化溫度(<25℃)較低所致。其他各批次發(fā)酵酯化效果符合生產要求,酯化液中己酸乙酯含量均大于622.0mg/100 mL,平均達687.3mg/100 mL(除第4批次外)。此外,酯化液中還含有少量的乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯等酯類物質。由此表明,全細胞酯化曲(酶)具有很強的酯化力特別是己酸乙酯生成能力,完全符合生產要求。
3.1酒醅串蒸
增己降乳,全面提升基酒等級。
3.1.1糧糟串蒸
將不同數量生物酯化液倒入底鍋用發(fā)酵70 d的糧糟串蒸得到的基酒,與直接用發(fā)酵70 d的糧糟蒸餾所得到的基酒進行理化數據分析比較和感官鑒評,結果見表5、表6。
表5 不同加量生物酯化液糧糟串蒸基酒與對照基酒主要成分分析結果 (mg/100 mL)
表6 不同生物酯化液加量糧糟串蒸基酒與對照基酒感官嘗評結果
從表5可以看出,對照樣基酒四大酯含量為乳酸乙酯>己酸乙酯>乙酸乙酯>丁酸乙酯,四大酯比例不協(xié)調,特別是己酸乙酯與乳酸乙酯之比小于1,使對照酒的濃香典型性不突出。隨著生物酯化液串蒸量的增加,基酒中己酸乙酯顯著增加,己乳比大于1,窖香突出,典型性增強;當酯化液串蒸量達100 kg/甑時,基酒中的己酸乙酯高達905.7mg/100 mL,可作高酯調味酒。適量加入酯化液串蒸后,四大酯比例協(xié)調,特別是己酸乙酯與乳酸乙酯之比大于1,濃香型酒主體香突出,這證明了加入酯化液串蒸后可以較大幅度地增加己酸乙酯含量,總酸總酯都有增加,白酒中各種微量成分更加協(xié)調,提高了酒的質量和產量。同時加入酯化液串蒸后能明顯降低乳酸乙酯的含量,達到增己降乳的目的。
從表6可以看出,加入酯化液串蒸后,所產基酒窖香濃郁,酯香突出,酒體豐滿,風格典型,醇厚感增加,后味悠長,新酒氣明顯減弱,基酒質量全面提高。
3.1.2丟糟串蒸
將生物酯化液倒入底鍋用發(fā)酵40 d的丟糟串蒸得到的串蒸酒,與直接用發(fā)酵40 d的丟糟蒸餾所得到的丟糟酒進行理化數據分析比較和感官鑒評,結果見表7、表8。
表7 丟糟串蒸酒與對照丟糟酒主要成分分析結果 (mg/100mL)
表8 丟糟串蒸酒與對照丟糟酒感官嘗評結果
從表7、表8可知,丟糟加生物酯化液串蒸后,酒質明顯改善,己乳比大于1,其四大酯比例更加協(xié)調,濃香風格突出,通過生物技術完全可以使丟糟酒達到合格酒要求。
3.2直接蒸餾生產高酯調味酒
將生物酯化液加入釜式蒸餾器或酒尾提酒器,用水蒸汽直接蒸餾,摘取酒精度為65%vol以上蒸餾液,其主要成分及品評結果見表9。
表9 蒸餾液(高酯調味酒)主要成分分析結果 (g/L)
由表9所知,此蒸餾液含濃香型白酒的主體香味物質己酸乙酯含量高達35.2 g/L,成為酯化液的主體香味成分,并含有適量的其他酯類物質,其酯香特別濃郁、純正協(xié)調,醇甜凈爽,是很好的高酯調味酒,可以協(xié)調四大酯比例,使酒體聞香更好,口感濃香突出,后味更醇和甜凈,酒質明顯改善;代替己酸乙酯應用于固液法白酒生產,能明顯消除新酒和酒精中的辛、辣、異味,并有迅速催陳的作用,可以縮短新酒存放期,增加白酒固態(tài)感和自然感。
3.3其他應用
生物酯化液除了含較高的酯類物質外,還含有較豐富的有益功能菌和酯化酶。企業(yè)可根據實際生產情況加以應用,如直接回窖發(fā)酵,也可用于養(yǎng)窖或人工老窖生產等。
4.1通過生產應用表明,全細胞酯化曲(酶)是一種脂肪酶活性高的食品級酵母細胞菌體凍干粉,能高效快速地將黃水酒尾中的有機酸生物合成相應的芳香酯。作為新型高效白酒專用酯化曲(酶),它具有性能穩(wěn)定、酯化條件溫和、操作簡便、酯化率高、用曲量少(0.2%~0.3%)、酯化反應較快、生成的酯類物質酯香純正、香味自然、增己降乳效果明顯等特性。在含1%有機酸(己酸)及酒精度為20%vol~35%vol的黃水酒尾酯化液中,加入0.3%全細胞酯化曲(酶),于25~45℃、自然pH值條件下,發(fā)酵酯化15 d,酯化液中己酸乙酯含量均大于622.0mg/100 mL,平均達687.3mg/100 mL。香氣是以己酸乙酯為主的馥郁酯香,且香味純正自然,無異味。由此表明,全細胞酯化曲(酶)具有很強的酯化力特別是己酸乙酯生成能力,完全適應生產需要。
4.2生物酯化液串蒸,效果顯著。每甑可根據母糟質量加入適量的酯化液串蒸,能明顯增加己酸乙酯含量,降低乳酸乙酯含量,提高基酒質量1~2個等級??筛淖儸F在釀酒生產中乳酯高己酯低的現象,增己降乳效果十分明顯,且各香味成分協(xié)調。若用25~50 kg/甑生物酯化液串蒸酒醅,可使基酒中己酸乙酯增加100mg/100 mL以上,乳酸乙酯降低50mg/100 mL以上,己乳比大于1,四大酯比例更加協(xié)調合理,酒質全面提升1~2個等級以上,且出酒率也有一定增加。生物酯化液串蒸量越多,其基酒中己酸乙酯含量越高,量質摘酒能摘取更多的優(yōu)質調味酒。
4.3生物酯化液直接蒸餾可生產己酸乙酯高達30 g/L以上的高酯調味酒,其酯香特別濃郁、純正協(xié)調,醇甜凈爽,可以代替己酸乙酯應用于固液法白酒生產,減少白酒香料的用量,能明顯消除新酒的辛辣、異味,去除酒精味和香料味,增加酒的固態(tài)感和自然感,改善酒的品質。
4.4利用現代生物技術生產生物酯化液具有生產工藝簡單,生產設備要求不高,操作方便,簡單易行等特點。量小時可用0.5~1 t的陶壇生產,量大時可用10~100 t以上的不銹鋼大罐生產酯化液。生產酯化液最好選擇氣溫最高的夏季進行,可供全年使用;若要全年生產酯化液,則酯化設備應有保溫設施。
4.5生物酯化液的生產應用要與傳統(tǒng)釀酒工藝有機結合,配套使用。生物酯化液的生產:一是要根據企業(yè)實際情況制定科學合理的酯化液配方,在保證一定底物濃度下,要充分利用生產正常的黃水、酒尾、酒糟(香醅)、己酸菌液(發(fā)酵有機酸)、中高溫大曲及優(yōu)質老窖泥等作為酯化液的原料,以豐富酯化液的微量成分;二是要選取用量小、酯化率高、生香物質香味純正自然的高轉化率酯化曲(酶);三是要加強保溫措施,保障酯化正常進行。酯化液應用可根據本廠實際采取串蒸、直接蒸餾或入窖再發(fā)酵等方式進行,充分利用酯化液中大量的香酯特別是己酸乙酯來提高基酒的含量,達到全面改善和提高酒質的目的。
4.6全細胞酯化曲(酶)是高科技生物酶制劑,比傳統(tǒng)酯化曲具有更高的催化活性和更少的用量(不足紅曲酯化曲用量的10%),是當前制備生物酯化液的最佳催化劑。酯化酶在生物酯化液的生產及應用,是現代生物工程技術改造傳統(tǒng)工藝,推動企業(yè)創(chuàng)新發(fā)展,促進白酒產業(yè)技術升級的一項重要生物工程技術,不僅能充分彌補窖內生香的不足,大幅提高基酒中己酸乙酯及總酯含量,達到增己降乳、全面提升酒質的目的,而且能最大限度利用黃水和酒尾中的有益成分,提高資源綜合利用率,實現清潔生產。
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The Application of Whole-Cell Esterifying Enzyme in Bio-Esterifying Liquid
LIU Yigang1,ZHOU Zhiquan2,ZHOU Chao2,ZHANG Qiang2and LI Lan1
(1.Sichuan Food Fermentation Industry Research &Design Institute,Chengdu,Sichuan 611130;2.Chengdu Hexie Jiuzhou Distillery Co.Ltd.,Chengdu,Sichuan 611238,China)
Abstract:Whole-cell esterifying enzyme is food-grade yeast cell lyophilized powder with high lipase activity,which can effectively turn organic acids in yellow water into aromatic esters.By adding 0.3% of whole-cell esterifying enzyme into the yellow-water-esterifying liquid (20%vol~35%vol) that contained 1% of caproic acid,and fermenting for 15 days under conditions of 25~45℃and natural pH value,the content of ethyl caproate in the bio-esterifying liquid could reach 687.3mg/100 mL.By using 25~50 kg/steamer bio-esterifying liquid for cross-steaming with fermented grains,the content of ethyl caproate in the base liquor would increase over 100mg/100 mL,while the content of ethyl lactate would decrease over 50mg/100 mL.Distilling the bio-esterifying liquid directly,we could get flavoring liquor with ethyl caproate content up to 30 g/L,which had strong ester aroma,tasted pure,harmonious,rich and clean,and could replace ethyl caproate in the production of Baijiu by solid-liquid fermentation.Such method could reduce the consumption of flavorings,eliminate the spicy,bad,alcoholic or additive flavor in the newly produced liquor,make the liquor taste more natural,and improve the quality of the liquor.(Trans.by HUANG Xiaoli)
Key words:whole-cell esterifying enzyme;bio-esterifying liquid;cross-steaming;caproic acid-increasing and lactic acid-decreasing;flavoring liquor;Baijiu
作者簡介:劉義剛(1964-),男,重慶人,大專,高級工程師,副總經理,發(fā)表科研論文30余篇。
收稿日期:2016-01-20
中圖分類號:TS261.1;TS262.3;TS261.4
文獻標識碼:A
文章編號:1001-9286(2016)02-0072-05
DOI:10.13746/j.njkj.2016024
優(yōu)先數字出版時間:2016-01-25;地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160125.1114.002.html。