片仔癀對(duì)部分肝切除小鼠的肝再生的作用研究

項(xiàng)龍慶，羅　渢　(中國(guó)人民解放軍9608部隊(duì)衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所，上海 0009；上海第七人民醫(yī)院口腔科，上海 0037)

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片仔癀對(duì)部分肝切除小鼠的肝再生的作用研究

項(xiàng)龍慶1，羅渢2(1中國(guó)人民解放軍92608部隊(duì)衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所，上海 200092；2上海第七人民醫(yī)院口腔科，上海 200137)

【摘要】目的：研究片仔癀對(duì)70%肝切除小鼠肝再生的影響，為臨床肝再生用藥研究提供動(dòng)物模型. 方法：將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(片仔癀預(yù)處理組)和對(duì)照組(生理鹽水預(yù)處理組). 采用70%肝切除方法建立肝再生模型，術(shù)前連續(xù)兩周通過灌胃給予小鼠片仔癀0.2 mg/g體質(zhì)量(實(shí)驗(yàn)組)和生理鹽水(對(duì)照組). 第14天灌胃完片仔癀和生理鹽水2 h后對(duì)兩組小鼠分別進(jìn)行70%肝切除手術(shù)(PH). 用肝質(zhì)量/體質(zhì)量比、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real Time PCR)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和免疫組化等研究方法來評(píng)估片仔癀對(duì)小鼠部分肝切除手術(shù)后肝再生的影響. 結(jié)果：與對(duì)照組相比，70%肝切除手術(shù)后48、72、168 h，實(shí)驗(yàn)組肝質(zhì)量/體質(zhì)量比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12、24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后12、24、48、72、168 h，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)降低；術(shù)后48 h，實(shí)驗(yàn)組Ki-67表達(dá)量低于對(duì)照組. 結(jié)論：片仔癀對(duì)70%肝切除小鼠的肝再生產(chǎn)生抑制作用，延緩了肝再生過程.

【關(guān)鍵詞】片仔癀;小鼠;部分肝切除;肝再生

0引言

肝臟的再生能力很強(qiáng)，但在正常的肝臟中肝細(xì)胞處于分化成熟狀態(tài)，很少見到核分裂. 當(dāng)肝臟遭受手術(shù)切除、創(chuàng)傷、中毒、感染壞死以及肝移植術(shù)等致部分肝臟喪失后，低分化狀態(tài)發(fā)生改變，肝細(xì)胞快速增殖重新修復(fù)[1]. 因此研究肝再生的機(jī)制具有重要的臨床意義，促進(jìn)肝再生的藥物研發(fā)也備受關(guān)注. 部分肝切除是研究肝再生的經(jīng)典模型[2-3]. 片仔癀是蜚聲中外的名貴中成藥，由麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥精制而成，它原是明代太醫(yī)的秘方，被廣泛用于治療急慢性肝炎、多種創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)，甚至癌癥[4]. 研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，片仔癀對(duì)四氯化碳造成的肝細(xì)胞壞死具有緩解作用，它還可抑制結(jié)腸癌小鼠模型的腫瘤血管生成. 目前尚無片仔癀對(duì)肝切除術(shù)后肝再生的研究報(bào)道，本研究旨在探討片仔癀對(duì)肝再生的作用，為進(jìn)一步開發(fā)片仔癀提供依據(jù).

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組將雄性8周齡的C57BL/6小鼠(體質(zhì)量20～25 g)(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(片仔癀預(yù)處理組)和對(duì)照組(生理鹽水預(yù)處理組)，實(shí)驗(yàn)組每天灌胃0.2 mg/g體質(zhì)量片仔癀懸液，對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水，干預(yù)持續(xù)兩周. 第15天對(duì)兩組小鼠進(jìn)行肝切除手術(shù)，切除肝臟的70%.

1.2指標(biāo)測(cè)定

1.2.1小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量比以上兩組小鼠于術(shù)后12、24、48、72、168 h分別麻醉后處死8只，進(jìn)行稱重，并且計(jì)算肝質(zhì)量/體質(zhì)量比. 將其中4只小鼠的部分肝組織立即置于4%多聚甲醛中固定；另外4只小鼠分別取肝組織凍存在液氮中.

1.2.2RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time PCR)用反轉(zhuǎn)錄和Real Time PCR法來分析mRNA表達(dá)水平. 總RNA用TRIzol(購自美國(guó)Invitrogen Corp)法根據(jù)制造商的步驟來提取. 將RNA用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Takara公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA. Real Time PCR體系包括cDNA，SYBR Green PCR混合液(購自Takara公司)及引物(購自鉑尚生物技術(shù)有限公司).

1.2.3Ki-67免疫組織化學(xué)檢測(cè)冰凍切片由-20℃冰箱取出后放室溫30 min，用0.01 M的檸檬酸鈉緩沖液微波煮沸修復(fù)抗原15 min. 室溫冷卻，滴加封閉用正常羊血清工作液室溫孵育30 min. 甩掉后滴加Ki-67抗體(美國(guó)Epitomics公司產(chǎn)品)，1∶100，室溫，1～2 h，PBS洗滌. 滴加熒光兔二抗Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG(美國(guó)ThermoFisher公司產(chǎn)品)工作液，1∶250，室溫，1～2 h，PBS洗滌. 滴加DAPI染色液，37 ℃，5 min. PBS洗滌3次，5 min/次. 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察.

1.2.4血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性檢測(cè)血液樣本4 ℃靜置過夜，4℃，9000 rpm，離心10 min，分離血清. 血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性用上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性測(cè)量試劑盒測(cè)量，詳細(xì)方法與產(chǎn)品說明書一致.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1片仔癀干預(yù)對(duì)肝臟質(zhì)量的影響肝臟受到損傷之后就立即開始了再生過程，在70%肝切除模型中，術(shù)后24h肝臟殘余部分代償性增生至原肝質(zhì)量的45%，72h達(dá)到70%，7～14d達(dá)到93%，20d左右恢復(fù)原肝質(zhì)量[7]. 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的肝臟均有不同程度的增生，增生肝臟的形狀不規(guī)則. 術(shù)后12、24h兩組小鼠肝臟的質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 術(shù)后48h開始，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟的質(zhì)量的增加較少；術(shù)后72、120、168h，小鼠肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)比值顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟再生能力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，小鼠肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)比值顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟再生能力下降. 術(shù)后168h，對(duì)照組小鼠的肝臟質(zhì)量基本恢復(fù)到術(shù)前水平，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟質(zhì)量仍顯著低于正常水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1).

表1兩組小鼠肝臟質(zhì)量(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)變化

(n=48，x±s,%)

aP<0.05vs對(duì)照組；bP<0.01vs對(duì)照組.

2.2血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平變化情況丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)大部分存在于肝細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)肝細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，肝細(xì)胞中的ALT就會(huì)釋放到血液中，引起血清ALT的活性上升. 因此，ALT被當(dāng)做檢測(cè)肝臟損傷的重要生物學(xué)標(biāo)志. 部分肝切除對(duì)肝臟造成的損傷導(dǎo)致兩組小鼠血清中的ALT活性都顯著上升，術(shù)后12 h、24 h、48 h和72 h，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清ALT活性均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組小鼠的血清ALT活性在術(shù)后72 h恢復(fù)至術(shù)前水平，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在術(shù)后72 h仍維持在較高水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2).

表2兩組小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶變化情況

(n=30，x±s，U/L)

aP<0.05vs對(duì)照組；bP<0.01vs對(duì)照組.

2.3Ki-67在肝臟中的表達(dá)Ki-67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在細(xì)胞增殖的各期(G1，S，G2和M)中均有表達(dá)，但在細(xì)胞靜止期G0期不表達(dá)[8]. 肝組織中Ki-67陽性反應(yīng)產(chǎn)物為紅色熒光顆粒，在肝細(xì)胞核中表達(dá). 在小鼠肝臟切除術(shù)后24 h可見Ki-67少量表達(dá)，48 h肝臟表達(dá)Ki-67最為活躍，72 h未見明顯表達(dá). 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后24、48、72 h肝臟Ki-67表達(dá)量均低于對(duì)照組(圖1).

圖1　部分肝切除48 h后肝組織Ki-67表達(dá)

2.4組織HGFmRNA相對(duì)表達(dá)量肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)是存在于急性肝損傷動(dòng)物血漿中的蛋白因子，可以刺激細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，在血管生成、腫瘤發(fā)生和組織再生的過程中發(fā)揮著重要的作用[9]. 從術(shù)后12 h開始，實(shí)驗(yàn)組小鼠的HGF mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2).

圖2　組織HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量

3討論

肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，經(jīng)手術(shù)切除部分肝組織后，殘余的肝組織細(xì)胞便會(huì)立即進(jìn)入快速增殖狀態(tài). 肝再生不是被切除的肝葉重新長(zhǎng)出，而是殘余肝細(xì)胞的增生，肝細(xì)胞增殖的過程受控于臨近細(xì)胞釋放的多種信號(hào)分子，是一個(gè)多基因參與和多步驟協(xié)同的復(fù)雜過程[10].

本研究成功建立了小鼠的70%肝切除模型，以肝質(zhì)量/體質(zhì)量比、血清ALT水平、肝臟Ki-67表達(dá)水平、HGF mRNA水平作為標(biāo)志來判斷肝再生的強(qiáng)弱. 研究結(jié)果表明，片仔癀對(duì)于肝切除小鼠的肝再生過程會(huì)產(chǎn)生不利影響.

對(duì)于片仔癀的保肝作用，科學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，片仔癀對(duì)四氯化碳造成的肝損傷具有保護(hù)作用，進(jìn)一步的肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明片仔癀可以激活重要信號(hào)通路的反應(yīng)元件. 而另一項(xiàng)研究[11]則表明取代片仔癀的一種重要成分麝香并不影響其對(duì)四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用. 對(duì)于片仔癀的抗癌作用，研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，其可顯著降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的存活率，并可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡. 片仔癀對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用在一定程度上可以解釋其對(duì)肝再生過程產(chǎn)生的不利影響.

片仔癀作為蜚聲中外的名貴中成藥，其處方、工藝均屬國(guó)家絕密級(jí)秘密，客觀上不利于對(duì)該藥的進(jìn)一步研究. 此外，其復(fù)方制劑中的多種成分之間可能存在相互作用，即藥效的協(xié)同作用和拮抗作用，這也從一定程度上增加了對(duì)其有效成分和機(jī)制研究的難度. 片仔癀等中成藥的臨床應(yīng)用應(yīng)在經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生的指導(dǎo)和觀察下使用，不宜作為日常保健品自行服用.

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Effect study of Pien Tze Huang on liver regeneration after partial hepatectomy in mice

XIANGLong-Qing,LUOFeng

1Sanitary and Anti-epidemic Institute, 92608 Regiment of PLA,Shanghai 200092;2Department of Stomatology, Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China

【Abstract】AIM: To explore the influence of Pien Tze Huang on liver regeneration after 70% PH and provide an animal model for clinical investigation of drugs for liver regeneration． METHODS: The C57BL/6 mice were randomly divided into experimental group and control group. Mice in the control group were given 0.9% saline by intragastric administration, while the mice in the experimental group were given 0.2 mg/g body weight Pien Tze Huang for two weeks before 70% PH. A C57BL/6 mice model of liver regeneration were established by 70% hepatectomy. Mice were all subjected to 70% PH two hours later at day 14. The influence of Pien Tze Huang on liver regeneration were assessd by liver weight/body weight ratio, real-time PCR, ALT activity detection and immunochemical staining of Ki-67. RESULTS: At 48, 72 and 168 h after 70% PH, the liver weight/body weight ratio in the experimental group decreased when compared with the control group, with statistically significant difference(P<0.05); At 12, 24, 48, 72 h after PH, ALT levels in serum in the experimental group increased, and the difference was statistically significant(P<0.05); At 12, 24, 48, 72 and 168 h after PH, HGF level of experimental group was significantly lower than the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05);At 48 h after PH, the Ki-67 expression of the experimental group was significantly less than the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05). CONCLUSION: Pien Tze Huang can obviously inhibit liver regeneration on mice after 70% partial hepatectomy, which delays regeneration process of liver.

【Keywords】Pien Tze Huang;mice;partial hepatectomy;liver regeneration

【中圖分類號(hào)】R657.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

作者簡(jiǎn)介：項(xiàng)龍慶. 本科，主治醫(yī)師. E-mail:kakka171@hotmail.com

收稿日期：2015-12-01；接受日期：2015-12-18

文章編號(hào)：2095-6894(2016)01-09-03

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·