超聲提取烏糾黃酮的工藝優(yōu)化

李春榮，孟鐵宏，羅亞男，姜艷萍，任竹君，楊 勤

（黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州都勻558003）

超聲提取烏糾黃酮的工藝優(yōu)化

李春榮，孟鐵宏＊，羅亞男，姜艷萍，任竹君，楊 勤

（黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州都勻558003）

為合理開發(fā)利用烏糾，獲得較多的烏糾黃酮，采用超聲波輔助法提取苗藥烏糾中的黃酮，并利用響應曲面法設計試驗確定苗藥烏糾中黃酮的最佳提取工藝條件。結果表明：在乙醇體積分數(shù)65%，提取時間90min，提取溫度72℃，液料比33∶1（mL∶g）條件下，烏糾黃酮的溶出率達1.28%，RSD為1.13%。

烏糾；黃酮；超聲；響應面法；提取工藝

烏糾，又名九倒生、地柏枝、鐵郎雞，為鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨（Aspleniumvarians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，主要分布在我國西南地區(qū)海拔650～3 500m的林下潮濕巖石上或巖壁上，《中華本草·苗藥卷》《中藥大辭典》《中國苗族藥物彩色圖集》和《貴州民間藥物》等醫(yī)藥著作對其均有記載［1］。烏糾性涼，味微苦，具有活血消腫、止血生肌的作用，烏糾可內(nèi)服，也可外用，已成為貴州苗族傳統(tǒng)的民間藥用植物［2］。

黃酮類化合物是一類具有良好生理及藥理功能的物質(zhì)，在降血脂、抗心肌缺血、抗腫瘤、抑菌等方面具有良好的藥效。大量研究表明，鐵角蕨科藥用植物中多數(shù)富含黃酮類化合物，在醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景。目前，胡成剛等［3］研究了黔產(chǎn)鐵角蕨科藥用植物資源的種類及分布；楊鑫寶等［4］對鐵角蕨科植物過山蕨的化學成分及藥理活性進行了研究；李寧等［5-6］報道，過山蕨中含有豐富的黃酮類物質(zhì)和過山蕨酸；張春椿等［7］對烏蕨中總黃酮類成分的提取工藝進行了研究。至今為止，僅有對烏糾止血活性部位進行篩選的報道［8］，對烏糾化學成分分析的報道較少，未見有關烏糾中黃酮類化學成分的分析及提取工藝的研究報道。為合理開發(fā)利用烏糾，獲得較多的烏糾黃酮，筆者利用超聲波輔助提取技術，在單因素試驗的基礎上，采用曲面響應面法優(yōu)化黃酮提取工藝，并通過Design-Expert8.0.6.0軟件進行數(shù)據(jù)擬合［9］，優(yōu)化超聲波輔助提取烏糾中黃酮的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：烏糾采自貴州黔南、黔東南苗族地區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院鑒定為鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨。蘆丁標準品購于上海圻明生物科技有限公司（批號：KB140211），氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁和無水乙醇均為分析純。

儀器：cary100紫外-可見分光光度計（美國），Mettler AE 240電子天平（瑞士），MU5100DUVFR實驗室超純水系統(tǒng)（上海淼康實業(yè)有限公司），DHG-9240A型真空干燥箱（上海金山公司）。

1.2 標準曲線的繪制

在氫氧化鈉和亞硝酸鈉存在的條件下，黃酮與金屬Al3＋能夠生成穩(wěn)定的絡合物。以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法在510nm處測其吸光度，以濃度對吸光度繪制標準曲線［10-11］。蘆丁標準品濃度C（mg/L）在一定范圍內(nèi)與吸光度A呈良好的線性關系，得線性回歸方程：A＝0.013 3C＋0.00 42，線性回歸系數(shù)R2＝0.999 3。

1.3 烏糾黃酮含量的測定

將烏糾植株洗凈晾干后在105℃下進行烘干，粉碎，過80目篩。準確稱取一定量的烏糾粉末于100mL圓底燒瓶中，然后加入一定量濃度已知的乙醇溶液，置于恒溫水浴鍋中，加熱回流，提取完畢后，冷卻，抽濾，濾液即為烏糾中的黃酮提取液，準確量取一定量的烏糾提取液于10mL的容量瓶中，按1.2中的操作方法測定吸光度，并計算黃酮提取率。

1.4 單因素試驗考察

參照文獻［12-13］的方法對影響烏糾黃酮提取的因素進行考察。

1.4.1 乙醇體積分數(shù) 稱取1.0g烏糾固體粉末于100mL圓底燒瓶，固定乙醇和烏糾粉末的液料比為30∶1（mL∶g，以下用mL/g表示），以不同體積分數(shù)的乙醇液（40%，50%，60%，70%，80%，90%）為提取劑，在70℃下，提取90min。

1.4.2 液料比 稱取1.0g烏糾固體粉末于100mL圓底燒瓶，分別按液料比為10mL/g、20mL/g、30mL/g、40mL/g、50mL/g和60mL/g加入60%的乙醇于70℃下提取90min。

1.4.3 提取溫度 稱取1.0g烏糾固體粉末于100mL圓底燒瓶，加入60%的乙醇溶液30mL，在不同溫度（40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃）下提取90min。

1.4.4 提取時間 稱取1.0g烏糾固體粉末于100mL圓底燒瓶，加入60%的乙醇溶液30mL，在90℃下分別提取30min、60min、90min、120min和150min。

1.5 烏糾中黃酮提取工藝的響應曲面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，參照文獻［14］的方法，采用響應曲面法中設計4因素3水平共29組試驗（表1）。

表1 超聲提取烏糾黃酮的響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design for extracting flavonoids fromW.jiub

1.6 回歸模型的建立

以黃酮提取率（y）為響應值，RSM軟件程序?qū)憫嬖囼灲Y果進行分析，建立二次多項式模型［15］。

1.7 響應面分析

根據(jù)回歸方程繪出等高線圖、3D響應面圖，從響應面圖觀察各獨立變量之間的交互作用對響應值的影響，分析乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度及提取時間對烏糾黃酮提取率影響的交互作用。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件下烏糾黃酮的提取率

2.1.1 乙醇體積分數(shù) 由圖1A可知，黃酮的提取得率隨乙醇體積分數(shù)的增大而增加，當乙醇體積分數(shù)達60%時，黃酮的提取得率達最大，為1.09%，繼續(xù)增大乙醇的體積分數(shù)，黃酮的提取得率不再增加，甚至減少。其原因可能是烏糾中一些色素等醇溶性雜質(zhì)的溶出性能在高濃度乙醇溶液中被激活，在溶液中與黃酮發(fā)生競爭反應從而導致黃酮提取率下降。因此乙醇濃度以60%左右為宜。

2.1.2 液料比 由圖1B可知，烏糾中黃酮的提取率隨液料比的增加而升高，當液料比達30mL/g時，提取率達最大，為1.09%；繼續(xù)提高液料比，烏糾中黃酮提取率略顯下降直至平緩。一般情況下，提取劑用量越大，黃酮類物質(zhì)越易溶出，而烏糾中黃酮提取率略顯下降，可能是烏糾中其他雜質(zhì)等隨著提取溶劑的增加也逐漸析出，從而干擾了黃酮的測定，當黃酮溶出達最大時，繼續(xù)增大提取溶劑，也增加了成本。綜合考慮，提取液料比以30mL/g左右為宜。

2.1.3 提取溫度 由圖1C可知，黃酮的提取率受溫度影響比較明顯，隨溫度升高呈先增大后減小，當溫度達70～80℃時，黃酮提取率達最大，為1.09%。通常情況下，升高溫度可以使分子的熱運動速率加快，有利于溶質(zhì)分子由固相向液相轉移，烏糾中黃酮的提取率升高。如果溫度過高，黃酮中一些對熱不穩(wěn)定的化合物也容易被氧化，從而導致黃酮提取率的下降，且升高溫度也會消耗時間和能量。綜合考慮，溫度以70℃左右為宜。

2.1.4 提取時間 從圖1D可知，烏糾中黃酮的提取率隨時間的延長呈先增后減趨勢。這可能是提取出的黃酮在空氣中發(fā)生氧化反應或者被分解，因此造成黃酮提取率下降。甚至烏糾中的一些糖類或有機酸類等雜質(zhì)成分也會在長時間的提取中溶出，因此提取時間以90min左右為宜。

圖1 不同提取條件下烏糾黃酮的提取率Fig.1 Extraction rate of flavonoids fromW.jiubunder different extraction condition

2.2 烏糾黃酮最佳提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立與分析 由表2可知，超聲提取烏糾黃酮響應面試驗各處理的黃酮提取率。通過分析，得烏糾中黃酮提取率（y）對乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）的二次多項回歸模型：

對所得模型進行顯著性檢驗，總模型方程的P＜0.01，表明回歸模型極顯著，回歸系數(shù)R2＝0.972 9，即回歸方程對試驗的擬合度較好［16］。其校正決定系數(shù)RAdj＝0.945 9，試驗誤差較??；失擬項P＝0.315＞0.05，表明模型失擬度不顯著，其失擬項可取，表中給出的模型預測值和實際值之間較為吻合，線性相關性良好，不存在顯著差異?；貧w方程模型的二次項極顯著，但交互項中AB、BC和CD項不顯著，AC和BD交互作用顯著，AD項的交互作用極顯著。A、B、C、D的F值分別為94.19、63.56、97.59和21.9，對黃酮提取影響依次為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞液料比＞提取時間。

表2 超聲提取烏糾黃酮的曲面響應試驗設計結果Table 2 Results of Box-Behnken design for extracting flavonoids fromW.jiub

2.2.2 不同因素間的交互作用 響應曲面變化陡峭，說明有交互作用的2個因素之間的交互作用強，也說明曲面的響應值對條件的改變越敏感，對烏糾中黃酮的提取率影響也越顯著。平緩的響應曲面說明各個影響因素的交互作用較弱，對黃酮提取率的影響不顯著。由圖2可知，在各個因素的交互作用中，提取溫度與乙醇體積分數(shù)的交互作用最強，對烏糾中黃酮提取率的影響最顯著，提取時間與體積分數(shù)以及提取時間與料液比的交互作用也比較強，對黃酮提取率影響顯著。而料液比與體積分數(shù)、提取溫度與料液比、提取時間與溫度之間的交互作用不明顯。綜合分析，在不斷增加乙醇的體積分數(shù)，延長提取時間的過程中，黃酮的提取率逐漸升高，當達最高值時，繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)和延長提取時間，黃酮的提取率反而下降。由此可知，在選擇合適的乙醇體積分數(shù)和恰當?shù)奶崛r間前提下，即使料液比和溫度不太高時，也能達到較高的提取率。

圖2 不同因素交互作用的烏糾黃酮提取率Fig.2 Flavonoids extraction rate fromW.jiubunder interactions between different factors

2.2.3 最佳工藝及驗證 利用軟件Design expert對回歸模型方程進行計算，得到黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)64.95%，提取時間90.08min，提取溫度72.14℃，液料比33.54∶1（mL/g），在此條件下，黃酮的溶出率為1.172 8%。為便于試驗操作，對最佳工藝條件進行修正為乙醇體積分數(shù)65%，提取時間90min，提取溫度72℃，液料比33∶1（mL/g）。對最佳工藝條件進行3次平行驗證試驗，烏糾中黃酮的溶出率為1.28%，RSD為1.13%。

3 結論與討論

采用超聲波輔助提取方法提取烏糾中的總黃酮，并對黃酮類化合物的含量進行測定，采用曲面響應法優(yōu)化黃酮的提取工藝，其最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)65%，提取時間90min，提取溫度72℃，液料比33∶1（mL/g），在該條件下，黃酮的溶出率達1.28%，RSD為1.13%。烏糾作為貴州苗族地區(qū)民間傳統(tǒng)藥用植物，其所含有的黃酮類化合物成分在抑菌、抗腫瘤、降血脂和抗心肌缺血等方面有顯著的藥效，在未來民族醫(yī)藥的開發(fā)中具有廣闊的應用前景。采用超聲波輔助提取技術結合響應面分析法可節(jié)省提取溶劑和減少對環(huán)境的污染，對有效成分的破壞性小，數(shù)學模型的擬合度高，試驗結果具有較大的參考價值，是一種值得提倡的提取方法。

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（責任編輯：孫小嵐）

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids fromWetjiub

LI Chunrong，MENG Tiehong＊，LUO Yanan，JIANG Yanping，REN Zhujun，YANG Qin
（QiannanMedicalCollegeforNationalities，Duyun，Guizhou558003，China）

The ultrasonic-assisted extraction technology is used in extracting flavonoids fromW.jiuband the optimum extraction conditions are determined by the response surface method to rational develop and utilizeW.jiuband obtain more flavonoids fromW.jiub.Results：The dissolution rate of flavonoids fromW.jiubis 1.28%with 1.13%RSDunder the optimum extraction conditions of 65%ethanol content，90min，72℃and 33∶1（mL∶g）of liquid-solid ratio.

Wetjiub；flavonoids；ultrasound；response surface method；extraction technology

S567.9；O629.9

A

2016-03-09；2016-08-31修回

貴州省衛(wèi)生廳校科技聯(lián)合基金項目“苗藥烏糾止血活性部位研究”（Gzwkj2012-2-018）；黔南民族醫(yī)學高等?？茖W?；痦椖俊肮檄h(huán)對苗藥烏糾中黃酮類成分蘆丁的緩釋性研究”（QNYZ201510）；黔南州科技計劃項目“六元瓜環(huán)對苗藥烏糾中黃酮類成分蘆丁的緩釋性研究”［黔南州科合社字（2015）2］

李春榮（1983-），女，副教授，從事化學教學及天然產(chǎn)物研究。E-mail：lichunrong68＠163.com

＊通訊作者：孟鐵宏，E-mail：mengtiehong19850＠163.com

1001-3601（2016）09-0401-0132-05