HPLC同時(shí)測(cè)定刺梨中2種三萜成分

李齊激，南 瑩，楊 艷，王道平，楊小生

（貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550002）

HPLC同時(shí)測(cè)定刺梨中2種三萜成分

李齊激，南 瑩，楊 艷，王道平，楊小生＊

（貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550002）

為同時(shí)測(cè)定刺梨中2種三萜成分，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定刺梨中薔薇酸、1-β羥基薔薇酸含量，并對(duì)貴州不同地方的刺梨進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：1）在PntulipsTM BP-C18色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液（40∶60）為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208nm，進(jìn)樣量為10μL的條件下，薔薇酸和1-β羥基薔薇酸分別在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg線性關(guān)系良好（r＞0.999 7），精密度RSD分別為0.53%和1.36%，重復(fù)性RSD分別為2.12%和0.76%，12h內(nèi)穩(wěn)定性RSD分別為1.58%和1.88%，平均回收率分別為100.20%和98.79%，RSD分別為0.76%和2.37%，該方法操作簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定刺梨中薔薇酸、1-β羥基薔薇酸的含量。2）遵義產(chǎn)刺梨中的薔薇酸含量較高，為1.31%；龍里產(chǎn)刺梨中的薔薇酸、1-β羥基薔薇酸的含量相對(duì)穩(wěn)定，分別為1.26%和0.15%。

刺梨；薔薇酸；1-β羥基薔薇酸；高效液相色譜

刺梨（RoseroxburghiiTratt）系薔薇科植物繅絲花的果實(shí)，是具有維C之王美譽(yù)的藥食兩用植物，先后收載于1994版、2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和2004年衛(wèi)生部食品新資源品種17號(hào)公告，于2012年7月被國(guó)家質(zhì)檢總局（2012年第102號(hào)公告）批準(zhǔn)為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，廣泛分布于暖溫帶及亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布于西南地區(qū)，尤以貴州資源較為豐富［1-3］。其具有消食健脾，收斂止瀉的功效，主要用于治療積食腹脹及泄瀉等疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，該植物主要含有薔薇酸、1-β羥基薔薇酸等三萜成分及黃酮類成分，在抗氧化、抗癌防癌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、延緩衰老和解毒鎮(zhèn)靜等方面均具有較好的治療或預(yù)防作用［5-6］。雖然刺梨作為藥食兩用植物收載相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)已有時(shí)日，但截此目前關(guān)于刺梨的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍以顯微鑒別與薄層層析法為主［4］，含量測(cè)定主要集中在維生素C及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分［7-9］，針對(duì)刺梨單一活性三萜成分的測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者結(jié)合課題組前期化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，綜合考慮相關(guān)影響因素選擇其中較具有代表性的2個(gè)三萜成分，建立同時(shí)測(cè)定其含量的高效液相色譜法，以期為該植物藥材及其新產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

刺梨，于2015年9月采自貴州黔南布依族苗族自治州龍里縣、興義市興仁縣、凱里市郊、貴陽(yáng)市花溪區(qū)及開(kāi)陽(yáng)縣、遵義市南白鎮(zhèn)和鴨溪鎮(zhèn)，經(jīng)貴州大學(xué)鑒定為薔薇科植物繅絲花的果實(shí)（刺梨），標(biāo)本（憑證201509001）保存于貴州省、中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。薔薇酸、1-β羥基薔薇酸對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)NMR、MS等光譜數(shù)據(jù)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)HPLC純度檢測(cè)均大于98.0%；乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），三氟醋酸為分析純（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），水為超純水，其余試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜（含柱溫箱、可見(jiàn)-紫外檢測(cè)器、四元泵、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器），美國(guó)安捷倫科技有限公司；電子天平，Mettler Toledo，26115102-0；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；ZK-82A型真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取薔薇酸、1-β羥基薔薇酸對(duì)照品適量，分別置于10mL、100mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，制成每1mL含薔薇酸1.34mg/mL、1-β羥基薔薇酸0.135mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各儲(chǔ)備液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3 供試品溶液的制備

取刺梨粗粉（過(guò)三號(hào)篩）約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加75%乙醇100mL，水浴回流提取3次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮近干，加適量蒸餾水溶解，再用乙酸乙酯萃取3次（體積比為1∶2），合并乙酸乙酯萃取層，減壓濃縮近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得［10-11］。

1.4 色譜條件篩選

以PntulipsTM BP-C18色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm），柱溫30℃，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208nm，進(jìn)樣體積10μL為基礎(chǔ)，對(duì)不同比例流動(dòng)相（甲醇∶水＝30∶70、乙腈∶水＝40∶60、甲醇∶乙酸水溶液＝50∶50、乙腈∶乙酸水溶液＝60∶40、甲醇∶三氟醋酸水溶液＝70∶30、乙腈∶三氟醋酸水溶液＝80∶20）下樣品與對(duì)照物質(zhì)色譜峰分離度進(jìn)行考察，以篩選出最佳色譜條件。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液2.0μL、4.0μL、6.0μL、8.0μL、10.0μL和12.0μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（x，mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度 精密吸取對(duì)照品溶液適量，按篩選的最佳色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積RSD。

1.6.2 重復(fù)性 稱取同一刺梨樣品6份，制備供試品溶液，按篩選的最佳色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算峰面積RSD。

1.6.3 穩(wěn)定性 取同一刺梨供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、10h和12h時(shí)按篩選的最佳色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積RSD。

1.6.4 加樣回收率 稱取已知含量的刺梨樣品6份，每份約0.5g，分別加入薔薇酸6.05mg、1-β羥基薔薇酸0.63mg，制備供試品溶液，再按篩選的最佳色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.7 樣品的測(cè)定

取貴州各產(chǎn)地刺梨樣品約1g，平行制備供試品溶液各2份，再按篩選的最佳項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中薔薇酸、1-β羥基薔薇酸平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的流動(dòng)性選擇

由圖示可知，在PntulipsTM BP-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液流動(dòng)相（40∶60），柱溫30℃，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208nm及進(jìn)樣體積10μL條件下，各樣品峰與其他雜質(zhì)峰能夠得到很好的分離，分離度均大于1.5。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍與回歸方程

試驗(yàn)表明，刺梨薔薇酸和1-β羥基薔薇酸的回歸方程分別為y＝237.26x-50.32（R＝0.999 8）、y＝222.36x-1.829 4（R＝0.999 7）。在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

精密度：薔薇酸和1-β羥基薔薇酸的峰面積RSD分別為0.53%和1.36%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性：薔薇酸和1-β羥基薔薇酸的峰面積RSD分別為2.12%和0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性：薔薇酸和1-β羥基薔薇酸的峰面積RSD分別為1.58%和1.88%，表明供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收率：由表1可知，薔薇酸、1-β羥基薔薇酸平均加樣回收率分別為100.20%和98.79%，RSD分別為0.76%和2.37%，表明測(cè)定方法準(zhǔn)確、可行。

2.4 樣品測(cè)定

由表2可知，除遵義產(chǎn)刺梨中的薔薇酸含量（1.31%）較高外，龍里產(chǎn)刺梨中薔薇酸、1-β羥基薔薇酸的含量相對(duì)穩(wěn)定，分別為1.26%和0.15%，其他靠近龍里區(qū)域產(chǎn)刺梨中二者的含量也更接近龍里產(chǎn)刺梨，遠(yuǎn)離則相對(duì)偏低，甚至消失，如興義興仁產(chǎn)刺梨中二者含量分別為0.87%和0，此現(xiàn)象或受當(dāng)?shù)丨h(huán)境變化及過(guò)度開(kāi)發(fā)影響。

圖示 刺梨中1-β羥基薔薇酸和薔薇酸對(duì)照品（A）與供試品（B）HPLC色譜Fig. HPLC Chromatogram of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid in CK（A）and sample（B）

表1 薔薇酸和1-β羥基薔薇酸的回收率（n＝6）Table 1 Recovery rate of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid（n＝6）

表2 貴州不同地方刺梨的薔薇酸和1-β羥基薔薇酸含量（n＝6）Table 2 Content of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid inR.roxburghiifrom different producing areas in Guizhou（n＝6）%

3 結(jié)論

隨著刺梨作為藥食兩用植物正逐漸被人們廣泛關(guān)注，大量以刺梨為原料的健康產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)（如刺梨干、刺梨酒、刺梨醋、刺梨口服液、刺梨膠囊等），因其是衛(wèi)計(jì)委公布的食品新資源，針對(duì)該品種的質(zhì)量控制方法相對(duì)滯后。基于貴州豐富的刺梨資源亟待開(kāi)發(fā)利用和廣泛的市場(chǎng)需求，筆者在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)綜合考慮檢測(cè)指標(biāo)的代表性、質(zhì)量控制方法的難易程度和地方標(biāo)準(zhǔn)修訂需要［4-5］，選擇薔薇酸、1-β羥基薔薇酸作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制方法的建立與含量測(cè)定，結(jié)果表明，在PntulipsTM BP-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液（40∶60）為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208nm，進(jìn)樣量為10μL的條件下，薔薇酸、1-β羥基薔薇酸分別在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg線性關(guān)系良好（R＞0.999 7），精密度RSD分別為0.53%和1.36%，重復(fù)性RSD分別為2.12%和0.76%，12h內(nèi)穩(wěn)定性RSD分別為1.58%和1.88%，平均回收率分別為100.20%、98.79%，RSD分別為0.76%、2.37%。對(duì)貴州地區(qū)刺梨中2種三萜成分進(jìn)行測(cè)定，遵義產(chǎn)刺梨中薔薇酸含量較高，為1.31%；龍里產(chǎn)刺梨中的薔薇酸、1-β羥基薔薇酸的含量相對(duì)穩(wěn)定，分別為1.26%和0.15%。黔中、黔北地區(qū)相對(duì)更適合刺梨生長(zhǎng)，在品種選育時(shí)，可結(jié)合刺梨中三萜成分的含量和該地區(qū)土壤環(huán)境進(jìn)行綜合考慮，以此提高刺梨品種質(zhì)量。

［1］中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1998.

［2］貴州植物志編輯委員會(huì).貴州植物志［M］.貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1982.

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［4］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］.貴陽(yáng)：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003：230.

［5］楊小生，馬 琳，梁 冰，等.刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測(cè)方法和應(yīng)用：中國(guó)，ZL201110080922［P］.2013-03-20.

［6］代甜甜，楊小生.刺梨化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，37（4）：93-97.

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［8］吳洪娥，金 平，周 艷，等.刺梨與無(wú)籽刺梨的果實(shí)特性及其主要營(yíng)養(yǎng)成分差異［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（8）：221-223.

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［11］南 瑩，李齊激，馬 琳，等.紫外分光光度法測(cè)定刺梨總?cè)婆c總黃酮含量［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35（6）：473-476.

（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Simultaneous Determination of Two Triterpenoids Components fromRoseroxburghiiby HPLC

LI Qiji，NAN Yin，YANG Yan，WANG Daoping，YANG Xiaosheng＊
（KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts，ChineseAcademyofSciences，Guiyang，Guizhou550002，China）

In order to simultancous detemination of two triterpenoids compents fromR.roxburghil，The content of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid inR.roxburghiifrom different producing areas in Guizhou was determined by HPLC.Results：1）The content of euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid inR.roxburghiiis 0.268～1.608μg and 0.027～0.162μg with a good linear relation（r＞0.999 7）under the conditions of Pntulips TM BP-C18（4.6mm×250mm，5μm）column with acetonitrile-water（containing 0.05%Trifluoroacetic acid）as mobile phase，30℃，1mL/min of flow rate，208nm and 10μL of sample size.TheRSDof precision，repetition and stability within 12hof euscaphic acid and 1-βhydroxy euscaphic acid is 0.53%and 1.36%，2.12%and 0.76%1.58%and 1.88%respectively.The average recovery rate of euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid is 100.20%and 98.79%and theRSDis 0.76%and 2.37%.The determination method with advantages of easy operation and accuracy can be used to determine euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid content inR.roxburghiisimultaneously.2）The euscaphic acid content inR.roxburghiifrom Zunyi is the highest（1.31%）.The euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid content inR.roxburghiifrom Longli County is 1.26%and 0.15%respectively and their content is relatively stable.

Roseroxburghii；euscaphic acid；1-β-hydroxy euscaphic acid；HPLC

R284.1

A

2016-02-19；2016-08-29修回

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目“藥渣高值化綜合利用關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”［黔科合NY（2015）3005-1］；貴州省科技重大專項(xiàng)“刺梨高值化新產(chǎn)品研制及示范—刺梨活性提取物的新產(chǎn)品研發(fā)”［黔科合重大專項(xiàng)字（2013）6006-4］；貴州省創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目“貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)—百層次”［黔科合人才（2015）4027］；貴州省創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目“貴州省藥材品質(zhì)研究與評(píng)價(jià)科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”［黔科合人才團(tuán)隊(duì)（2013）4006］

李齊激（1983-），男，助理研究員，從事民族藥用植物資源化學(xué)研究。E-mail：leeqiji＠163.com

＊通訊作者：楊小生（1966-），男，研究員，從事民族藥用植物資源化學(xué)及其品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail：gzcnp＠sina.cn

1001-3601（2016）09-0399-0125-04