基于星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥凝集素的提取工藝

雨 田，郭曉恒，楊 杭，嚴(yán) 瀟，趙 鋼，彭鐮心，鄒 亮＊

（1.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，成都四川610106；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理云南671000）

基于星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥凝集素的提取工藝

雨 田1，郭曉恒1，楊 杭2，嚴(yán) 瀟1，趙 鋼1，彭鐮心1，鄒 亮1＊

（1.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，成都四川610106；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理云南671000）

為進(jìn)一步開發(fā)利用藜麥的生物活性，利用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選藜麥凝集素的提取工藝。以凝血活性為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化藜麥凝集素提取條件。結(jié)果表明：藜麥凝集素的最佳提取條件為pH 7.2，液料比15∶1（mL∶g），提取溫度17℃，提取時間14.3h，該條件下，凝集素血凝活性實為3.612 36。

藜麥；凝集素；星點設(shè)計-響應(yīng)面法；提取工藝

藜麥（Chenopodiumquinoawilld），又稱南美藜，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是唯一一種單體植物，可滿足人體營養(yǎng)需求。中國于1987年開始進(jìn)行藜麥的引種試驗研究，并于1993年在西藏地區(qū)獲得小面積試種成功［1］。目前，在山西、四川和青海等地均開展藜麥小規(guī)模種植。藜麥營養(yǎng)成分豐富，其中可利用蛋白質(zhì)的含量明顯高于普通谷物［2］。有研究表明，藜麥中總蛋白質(zhì)的含量為155.7g/kg［3］。此外，還含有多種氨基酸、淀粉、脂肪、礦物質(zhì)和維生素。藜麥的藥用活性成分包括多酚類、黃酮類、皂苷和凝集素。目前，關(guān)于藜麥各種營養(yǎng)成分和多種活性成分的研究均有較多報道，但藜麥凝集素相關(guān)的研究較少。

植物凝集素（Lectin）是一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)，多種植物凝集素對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用［4］。從目前研究現(xiàn)狀看，植物凝集素的提取分離、結(jié)構(gòu)解析、抗腫瘤、抗病毒分子機(jī)制及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究將成為未來幾年該領(lǐng)域的熱點［5］。藜麥作為一種新型雜糧，除具有豐富的營養(yǎng)功能外，還有較高的藥用價值，藜麥凝集素的提取開發(fā)將為藜麥生物活性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

目前，正交試驗是篩選植物凝集素提取工藝的主要方法，正交試驗設(shè)計的考察因素有液料比、溶液pH、提取溫度和提取時間等，各個因素根據(jù)實際需要設(shè)置不同水平。作為一種廣泛使用的多因素多水平試驗設(shè)計方法，正交試驗一直用于植物凝集素提取工藝的篩選。響應(yīng)面法是基于單因素試驗結(jié)果設(shè)計的響應(yīng)面試驗，可通過方程擬合，預(yù)測最佳試驗條件，能夠更加直觀和準(zhǔn)確地體現(xiàn)各因素間的交互作用。響應(yīng)面法比正交試驗更具有直觀性、全面性和準(zhǔn)確性。凝集素的提取率可以通過凝血活性來反映，即同一濃度的提取溶液，凝血活性越強(qiáng)則其中凝集素的含量越高。因此，選擇凝血活性作為考察指標(biāo)，更具有實際意義和可操作性。綜上，筆者選用PBS緩沖液提取藜麥凝集素，以凝血活性為響應(yīng)值，基于星點設(shè)計-響應(yīng)面法［6-7］優(yōu)化藜麥凝集素的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗兔（成都學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院動物實驗室），藜麥（山西稼祺藜麥開發(fā)有限公司），肝素鈉注射液（成都市海通藥業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：141004）。

儀器：FW-100多功能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司制造），CP224C電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司制造），H H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州奧華儀器有限公司制造），HC-2517高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司制造）。

1.2 凝集素的粗提

取藜麥100g，用高速萬能粉碎機(jī)在26 000r/min的轉(zhuǎn)速下粉碎60s，過100目篩，于60℃下烘干至恒重，備用。用電子天平精密稱取0.2g藜麥粉末，在不同的提取條件下（不同pH、液料比、提取溫度、提取時間）提取，提取后的溶液在高速離心機(jī)上以4 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清液，作為凝集素粗提液。

1.3 2%新鮮紅細(xì)胞懸液的制備

參照文獻(xiàn)［8］的方法，取新鮮兔血1mL于事先用肝素鈉注射液潤洗的離心管中，在4 000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，棄去上清液，加入生理鹽水1mL，混勻，繼續(xù)離心10min，連續(xù)操作4次，收集底部紅細(xì)胞，根據(jù)紅細(xì)胞體積，加入相應(yīng)體積生理鹽水配制成2%紅細(xì)胞懸液，備用［8］。

1.4 凝血活性的檢測

在96v孔板上，用移液槍加入40μL凝集素提取液，用生理鹽水將凝集素溶液進(jìn)行等量倍比稀釋，混合均勻，加入40μL 2%紅細(xì)胞懸液，靜置2h后，觀察紅細(xì)胞凝集效果。紅細(xì)胞在v型孔板底部呈網(wǎng)狀，不下沉則凝血效果較好；若在v型孔板底部呈點狀，則凝血效果較差或無凝血效果。用產(chǎn)生凝血效果最大稀釋倍數(shù)的對數(shù)值表示凝血活性［9-10］。

1.5 單因素試驗考察

1.5.1 pH 控制液料比為20∶1（mL∶g，下同），提取時間5h，提取溫度60℃，考查pH分別為5.8、6.5、7.2、8.0和8.6時的凝血活性。

1.5.2 液料比 控制pH 6.5，提取時間5h，提取溫度60℃，考查液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1時的凝血活性。

1.5.3 提取溫度 控制pH 6.5，液料比為15∶1，提取時間5h，考查提取溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃和50℃時的凝血活性。

1.5.4 提取時間 控制pH 6.5，液料比為15∶1，提取溫度為20℃，考查提取時間分別為5h、10h、 15h和20h的凝血活性。

1.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取液pH值、提取液料比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量，根據(jù)Design Expert 8.0.6響應(yīng)面軟件設(shè)計出星點（中心）設(shè)計表，其因素水平見表1。

表1 藜麥凝集素提取的響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 The factor and level of response surface experiment for extraction ofC.quinoalectin

1.7 回歸模型的建立

Design-Expert軟件程序?qū)憫?yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，3個因子經(jīng)過擬合建立多元二次回歸響應(yīng)面回歸模型。

1.8 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪出等高線圖、3D響應(yīng)面圖，從響應(yīng)面圖觀察各獨立變量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，分析pH、液料比、提取時間及提取溫度對藜麥凝集素凝血效果影響的交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素提取藜麥凝集素的凝血活性

由圖1可知，不同pH、料液比、提取溫度和提取時間的藜麥凝集素凝血效果變化。

2.1.1 pH 隨著pH的升高，藜麥凝集素的凝血效果呈先升高后下降趨勢，在提取緩沖液pH為6.5時，其凝血效果最佳，隨后逐漸降低，因此藜麥凝集素的提取pH 6.5為宜。

2.1.2 液料比 隨著液料比的升高，藜麥凝集素凝血效果呈先升高后降低再升高趨勢，在液料比為15∶1時的凝血效果最佳?？紤]成本等因素，藜麥凝集素提取的料液比以15∶1為宜。

2.1.3 提取溫度 隨著溫度的升高，藜麥凝集素凝血效果呈先升高后下降，最后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。在20℃時，其凝血效果最佳，故提取溫度以20℃為宜。

圖1 不同pH、液料比、提取溫度和提取時間藜麥凝集素的凝血效果Fig.1 Effect of different pH，liquid to solid ratio，temperature and extraction time on blood coagulation ofC.quinoalectin

2.1.4 提取時間 隨著提取時間的延長，藜麥凝集素的凝血效果呈先下降后升高再下降的變化趨勢，提取時間為15h時，其凝血效果最佳，故提取時間以15h為宜。

2.2 藜麥凝集素提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立 由表2可知響應(yīng)面試驗提取藜麥凝集素各處理的凝血效果。通過分析，預(yù)測模型為y＝3.13＋0.18A＋0.075B＋0.050C-0.11D＋0.075AB-0.30AC＋0.23BC＋0.075BD＋0.28A2＋0.053B2-0.40C2-0.40D2-0.15A2B＋0.49B2D-1.13A2B2

由方差分析可知，模型的F＝4.71，P＜0.001，試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著，在統(tǒng)計學(xué)上有意義。失擬項用來表示模型與試驗擬合程度，即二者差異程度。失擬項P＞0.05，對模型有利，無失擬因素存在。因此可用該回歸方程代替試驗對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。

因素A的P值小于0.05，因素B、C、D的P值均大于0.05，說明在一次項中，提取液pH對凝集活性影響顯著，其余3個因素（液料比、提取溫度、提取時間）對凝集素凝血活性不顯著；二次項A2、C2、D2的P值均小于0.05，說明其對凝集活性影響顯著；交互項AC、B2D、A2B的P值均小于0.05，對凝集素活性有顯著影響。故4個因素對凝集素血凝活性的影響并非簡單的線性關(guān)系，二次項、交互項均有顯著影響。

表2 藜麥凝集素的響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface analysis ofC.quinoalectin

2.2.2 各因素間的交互作用 從圖2～5看出，在所選擇的范圍內(nèi)，均存在極點，響應(yīng)面3D曲線比較平坦，與試驗數(shù)據(jù)得出的結(jié)果一致。液料比、提取溫度、提取時間對凝集素血凝活性影響的顯著性較小。

2.2.3 最佳工藝驗證 由響應(yīng)面試驗結(jié)果預(yù)測最佳提取條件為pH 7.2，液料比14.82，提取溫度16.76℃，提取時間14.28h，根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測的最佳提取條件，凝集素血凝活性為3.633 33。結(jié)合實際實驗操作的可行性，將實際最佳提取條件調(diào)整為pH 7.2，液料比15，提取溫度17℃，提取時間14.3h。照此條件進(jìn)提取，凝集素血凝活性實際測定值為3.612 36，實際偏差僅0.577%，故此模型預(yù)測可行，有實際的指導(dǎo)意義。

圖2 pH與液料比交互作用的藜麥凝集素凝血活性Fig.2 Effect of pH value and ratio of liquor to solid interaction on blood coagulation activity ofC.quinoalectin

圖3 pH與提取溫度交互作用的藜麥凝集素凝血活性Fig.3 Effect of pH value and temperature interaction on blood coagulation activity ofC.quinoalectin

圖4 液料比與提取溫度交互作用的藜麥凝集素凝血活性Fig.4 Effect of temperature ratio of liquor to solid interaction on blood coagulation activity ofC.quinoalectin

圖5 液料比與提取時間交互作用的藜麥凝集素凝血活性Fig.5 Effect of extraction time and ratio of liquor to solid interaction on blood coagulation activity ofC.quinoalectin

3 結(jié)論與討論

試驗在藜麥凝集素提取的單因素試驗基礎(chǔ)上，基于Box-Behnken星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化，利用Design-Expert 8.0.6優(yōu)化藜麥凝集素最佳提取條件，并結(jié)合實際操作確定最佳提取工藝為pH 7.2，液料比15∶1，提取溫度17℃，提取時間14.3h。該條件下，凝集素血凝活性實為3.612 36，提取效果最佳，實際測定值與理論預(yù)測值的偏差僅0.577%，表明此預(yù)測切實可行，具有實際指導(dǎo)意義。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對藜麥有一定的研究，其多種化學(xué)成分的研究均有報道，如總多酚［11］、皂苷［12-14］、黃酮［15］、多糖［16］、蛋白質(zhì)氨基酸［17］和礦物質(zhì)營養(yǎng)素等。但針對藜麥凝集素尚缺乏較深入的研究。凝集素作為一種具有抗腫瘤、抗病毒等多種重要藥理作用的生物活性物質(zhì)，具有較高的研究開發(fā)價值。

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Optimization of Extraction Technology ofChenopodiumquinoaLectin Based on Central Composite Design/Response Surface Method（CCD-RSM）

YU Tian1，GUO Xiaoheng1，YANG Hang2，YAN Xiao1，ZHAO Gang1，PENG Lianxin1，ZOU Liang1＊
（1.CollegeofBasicSciences＆Nursing，ChengduUniversity，Chengdu，Sichuan610106；2.CollegeofPharmacy andChemistry，DaliUniversity，Dali，Yunnan671000，China）

The extraction technology of lectin fromC.quinoais optimized by Central Composite Design-Response Surface Methodology（CCD-RSM）to further develop and utilize biological activity ofC.quinoa.Results：The optimum extraction conditions for lectin extraction fromC.quinoainclude pH 7.2，15∶1（mL∶g）of liquid-solid ratio，17℃and 14.3h.The blood coagulation activity of lectin extracted fromC.quinoacan reach 3.612 36under the optimum extraction conditions.

Chenopodiumquinoa；lectin；CCD-RSM；extraction technology

S643.9

A

2016-02-17；2016-8-31修回

食品加工四川省重點實驗室項目“藜麥果素酒的制備工藝研究”（15-S08）

雨 田（1981-），女，講師，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail：yutian＠cdu.edu.cn

＊通訊作者：鄒 亮（1979-），男，教授，博士，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail：zouliang＠cdu.edu.cn

1001-3601（2016）09-0398-0120-05