貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛的單糖組成

譚 丹，楊傳玉，胡 珺，陳思穎，楊 暢，孫 佳，蘭燕宇＊

（1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004）

貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛的單糖組成

譚 丹1，2，楊傳玉1，2，胡 珺1，2，陳思穎1，3，楊 暢1，3，孫 佳1，3，蘭燕宇1，2＊

（1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004）

為鐵皮石斛藥效及多糖藥理活性提供科學依據(jù)，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化方法使糖類物質(zhì)帶上紫外基團，用高效液相色譜儀紫外檢測器進行檢測，對貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛單糖組成進行測定，并對其中單糖的含量進行分析。結(jié)果表明：鐵皮石斛多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖等組成，其中甘露糖和葡萄糖含量較高，甘露糖均占總多糖35%以上，葡萄糖均占總多糖12%以上，貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛藥材中各單糖占總多糖含量的比例存在明顯差異，大方縣產(chǎn)鐵皮石斛單糖含量相對較低，而烏當及獨山等地產(chǎn)鐵皮石斛單糖含量相對較高。

柱前衍生化；鐵皮石斛；單糖；組成；貴州

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）的干燥莖，又名黑節(jié)草，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，以新鮮或干燥的莖入藥，有味甘、質(zhì)重、黏性大等特點，享有中華九大仙草之首的美譽；《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，有滋陰清熱、益胃生津，潤肺止咳等功效，主治熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明、萎縮性胃炎、淺表性胃炎、慢性結(jié)腸炎等癥［1-2］。中國的鐵皮石斛主要分布在浙江、廣西、云南、貴州等省區(qū)［3-5］，由于以鐵皮石斛為主要原料的產(chǎn)品不斷問世，對鐵皮石斛原料需求急劇增加，其野生資源短缺的矛盾日益突出，具有巨大的市場需求。

藥理學研究表明，鐵皮石斛多糖具有免疫調(diào)節(jié)、保肝護胃和降壓降血糖等的生物活性，為鐵皮石斛主要藥效成分［6-8］，而多糖糖鏈的一級結(jié)構與其活性密切相關，一級結(jié)構的研究主要體現(xiàn)在組成多糖的單糖種類及各單糖的組成比例［9-10］。因此，弄清鐵皮石斛多糖的單糖組成對控制多糖質(zhì)量標準及研究鐵皮石斛藥理活性具有重要意義。因單糖存在互變異構體、差向異構體、結(jié)構相似等特征，而且往往同一待測樣品，如多糖、糖蛋白等，可能含有許多類型的單糖，所以單糖分析有其自身的特點，必須具有高效的分離技術，方可實現(xiàn)系列單糖的有效分離［11］。單糖在紫外區(qū)并無吸收［12］，故采用柱前衍生化方法使糖類物質(zhì)帶上紫外基團，用HPLC紫外檢測器進行檢測，具有分離效率高、分析時間短、進樣量少等特點。為有效、快速地測定鐵皮石斛中的單糖，建立鐵皮石斛多糖水解物PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化方法測定貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛中單糖的組成，以期為鐵皮石斛藥材的區(qū)域選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛：收集貴州省8個不同種植基地的鐵皮石斛藥材共20批，其中，貴陽市烏當區(qū)6批，獨山基地5批，銅仁市1批，大方縣5批，貴陽市白云區(qū)1批，羅甸縣1批，余慶縣1批。

試劑：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，99%，aladdin），三氟乙酸（TFA，化學純，國藥集團化學試劑有限公司，20140212），D-甘露糖（A0253685，＞99%），半乳糖（LL50J01，＞99%），D-無水葡萄糖（LR70H02，＞99%），半乳糖醛酸（G0010），阿拉伯糖（5328-37-0，＞98%），木糖（A0281299，＞99%），乙腈（色譜純，德國Merck公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

儀器：美國戴安UltiMate3000雙三元高效液相色譜儀，AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（G2X-942-0MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），實驗室專用超純水機（SC082767，四川沃特爾水處理設備有限公司），離心機（TGL-16G，上海安亭科學儀器廠），恒溫水浴鍋（HHS-11-1，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）。

1.2 鐵皮石斛多糖的提取

稱取鐵皮石斛藥材0.2g，精密稱定，置于索氏提取器中，加95%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，煎煮1h并攪拌，過濾，濃縮后60℃干燥，即得鐵皮石斛多糖。

1.3 鐵皮石斛多糖的水解

精密稱取鐵皮石斛多糖10mg于安瓿中，加入0.6mol/L三氟乙酸1mL，置于102℃烘箱內(nèi)水解3h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，用2mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，加水定容至刻度即得。

1.4 鐵皮石斛多糖供試品溶液的柱前衍生化

精密吸取1.2項下供試品溶液0.2mL，加入0.2mL 0.5mol/L PMP甲醇溶液和0.2mL 0.3mol/L NaOH溶液混勻，70℃水浴加熱100min，并不時振搖，取出室溫冷卻10min，用0.3mL 0.2mol/L HCl中和，加入2mL三氯甲烷萃取，萃取2次，充分振搖，取上層水相，加水補足至1mL，混勻，離心10min，即得。

1.5 色譜條件

色譜柱：CORTECS C18（150mm×4.6mm，2.7μm）；流動相：A為乙腈，B為0.02mol/L乙酸銨緩沖溶液，檢測波長：250nm；流速：0.5mL/min，柱溫：35℃，進樣量：10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.6 系統(tǒng)適用性考察

分別精密吸取混合對照品溶液（甘露糖50mg、半乳糖醛酸2mg、葡萄糖25mg、半乳糖3mg于25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻后，精密量取2.5mL于10mL量瓶中，用水稀釋至刻度）0.2mL和供試品溶液各0.2mL，照1.4進行柱前衍生化，并在1.5的色譜條件下，分別用HPLC測定，根據(jù)色譜參數(shù)計算系統(tǒng)適用性。

1.7 方法學考察

1.7.1 線性關系考察 精確稱取各單糖標準品甘露糖50mg、半乳糖醛酸2mg、葡萄糖25mg、半乳糖3mg于25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻后，得對照品溶液5，從對照品溶液5中分別精密量取0.5mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL于10mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得對照品溶液1、2、3、4。精密吸取對照品溶液0.2mL，照1.4制備PMP衍生物，然后進行測定，以進樣濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。

1.7.2 精密度試驗 取貴州羅甸縣（19號）鐵皮石斛樣品0.2g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進樣10μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。

1.7.3 重復性試驗 取同一批號（19號）鐵皮石斛樣品6份，每份0.2g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別測定峰面積。

1.7.4 穩(wěn)定性試驗 照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于0h、1h、2h、4h、8h、16h和24h進樣，測定各指標成分峰面積。

1.7.5 回收率試驗 精密稱取鐵皮石斛藥材樣品多糖（19號）9份，每3份為1組，分別按各單糖含量的50%、100%、150%加入4種單糖對照品，按1.3和1.4對多糖進行水解和衍生化，測定各含量。

1.8 含量測定

取鐵皮石斛樣品，按1.2制備鐵皮石斛多糖，按1.3和1.4對多糖進行水解和衍生化處理，按1.5的色譜條件測定，記錄峰面積，計算各單糖占總多糖的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性考察結(jié)果

從圖中看出，1號峰為衍生化試劑PMP峰，2號峰為甘露糖，3號峰為半乳糖醛酸，4號峰為葡萄糖，5號峰為半乳糖。4種單糖與其他物質(zhì)峰分離完全，理論塔板數(shù)均在10 000以上。

圖示 鐵皮石斛多糖衍生化產(chǎn)物和4種單糖混合對照品液相色譜Fig. Liquid chromatogram of Dendrobium officinale polysaccharide derivatization product and the mixture sample of 4monosaccharide

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系 甘露糖在0.020 0～0.400 0mg/mL、半乳糖醛酸在0.000 8～0.016 0mg/mL、葡萄糖在0.010 0～0.200 0mg/mL、半乳糖在0.001 2～0.024 0mg/mL線性范圍內(nèi)均具有良好的線性（表2）。

2.2.2 精密度 4個單糖峰面積RSD依次為甘露糖0.76%、半乳糖醛酸0.82%、葡萄糖0.91%、半乳糖0.83%，表明精密度良好。

2.2.3 重復性 4個單糖峰面積RSD分別為甘露糖0.76%、半乳糖醛酸0.84%、葡萄糖0.89%、半乳糖1.20%，表明試驗的重復性良好。

表2 4種單糖的標準曲線和線性范圍Table 2 Standard curves and linear range of four different monosaccharides

2.2.4 穩(wěn)定性 4個單糖峰面積RSD分別為甘露糖0.16%、半乳糖醛酸0.94%、葡萄糖0.95%、半乳糖0.93%，表明，室溫下供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率 甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖的平均回收率和RSD分別為98.6%、101.5%、99.1%、102.4%和1.23%、0.83%、0.80%和1.34%。表明該方法準確度良好。

2.3 貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛單糖的含量

從表3可知，鐵皮石斛甘露糖和葡萄糖含量較高，甘露糖均占總多糖35%以上，這對多糖發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及抗炎效果具有重要作用；葡萄糖均占總多糖12%以上；半乳糖醛酸和半乳糖含量相對較低，僅占總多糖1%～4%。甘露糖以貴州獨山、白云、羅甸、余慶最高，均占總多糖50%以上，而貴州大方產(chǎn)的含量相對較低，均占總多糖40%以下，而葡萄糖含量則以獨山以及銅仁相對較低，白云、羅甸、余慶也均占總多糖20%以上，半乳糖醛酸與半乳糖含量差異不大。綜合來說，以獨山、白云、羅甸和余慶產(chǎn)地的鐵皮石斛含量較高，這可能與其生長環(huán)境等有一定關系。

表3 鐵皮石斛各單糖占總多糖比例（n＝2）Table 3 Proportion of different monosaccharide in total polysaccharide of Dendrobium officinale

3 結(jié)論與討論

1）研究結(jié)果表明，鐵皮石斛莖中多糖是一種酸性雜多糖，主要由3種六碳糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖），一種糖醛酸（半乳糖醛酸）和2種五碳糖（木糖、阿拉伯糖）組成。其中甘露糖和葡萄糖含量較高，甘露糖均占總多糖35%以上，葡萄糖均占總多糖12%以上。貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛多糖中各單糖含量存在顯著差異，貴陽烏當以及獨山等地甘露糖與葡萄糖含量較高，而大方等地甘露糖與葡萄糖含量相對偏低，總體上看，單糖以甘露糖和葡萄糖含量較高。試驗僅對貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛的單糖組成進行測定，后續(xù)將繼續(xù)收集云南、浙江和廣西等不同省份鐵皮石斛樣品進行比較研究，擴大研究結(jié)果的應用范圍，并且通過測定研究每種單糖的含量，更進一步為鐵皮石斛莖多糖的組成和生物活性的研究提供基礎依據(jù)，對深入開發(fā)鐵皮石斛具有重要意義。

2）貴州不同產(chǎn)地鐵皮石斛藥材中糖類化合物化學組成相似，但相對比例有明顯的差異，而不同植物中提取的多糖其生物活性有很大差別［10］，多糖的研究主要體現(xiàn)在組成多糖的單糖種類及各單糖的組成比例，因此，對鐵皮石斛多糖的單糖組成進行分析具有重要意義。通過研究不同產(chǎn)地鐵皮石斛莖多糖的單糖組成和各單糖的組成比例，可為鐵皮石斛莖的多糖結(jié)構分析及其藥用價值研究提供參考。

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（責任編輯：孫小嵐）

Monosaccharide Composition ofDendrobiumofficinalefrom Different Producing Areas in Guizhou

TAN Dan1，2，YANG Chuanyu1，2，HU Jun1，2，
CHEN Siying1，3，YANG Chang1，3，SUN Jia1，3，LAN Yanyu1，2＊
（1.SchoolofPharmacy，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang，Guizhou550004；2.TheEngineeringResearchCenterforDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTraditionalChineseMedicine，MinistryofEducation，Guiyang，Guizhou550004；3.GuizhouKeyLaboratoryofPharmaceutics，Guiyang，Guizhou550004，China）

The composition and content of monosaccharide inD.officinalefrom different producing areas in Guizhou were detected by the ultraviolet detector of HPLC after the carbohydrates are carried with ultraviolet radicals by PMP pre-column derivatization method to provide the scientific basis for pharmacological function and polysaccharide pharmacological activity ofD.officinale.Results：The polysaccharide ofD.officinaleis composed by mannose，glucose，galacturonic acid and galactose mainly.The content of mannose and glucose accounts for above 35%and 12%of total polysaccharide respectively.There is a significant difference in proportion of different monosaccharide in total polysaccharide ofD.officinalefrom different producing areas.The monosaccharide content ofD.officinalefrom Dafang County is lower relatively and monosaccharide content ofD.officinalefrom Wudang District and Dushan County is higher.

pre-column derivatization；Dendrobiumofficinale；monosaccharide；composition；Guizhou

R282.7；S657

A

2016-01-22；2016-08-28修回

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項“黔產(chǎn)鐵皮石斛品質(zhì)評價體系研究及深加工產(chǎn)品開發(fā)”［黔科合SY字（2014）3032-2］；民族藥與中藥開發(fā)應用產(chǎn)學研基地建設項目［黔科合KY字（2013）122］；現(xiàn)代藥物研究開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目［黔教合協(xié)同創(chuàng)新字（2013）04］；貴州省民族藥與中藥開發(fā)應用工程技術研究中心項目［黔科合重G字（2013）4001］

譚 丹（1991-），女，在讀碩士，研究方向：藥物新劑型、新技術、新工藝研究與新藥開發(fā)。E-maiL：845947785＠qq.com

＊通訊作者：蘭燕宇（1985-），女，教授，從事中藥新藥研究與開發(fā)。E-maiL：yanyu626＠126.com

1001-3601（2016）09-0394-0105-04