滴水珠組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

朱燕燕，羅 睿，陳海麗，劉 丹

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

滴水珠組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

朱燕燕，羅 睿＊，陳海麗，劉 丹

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

為縮短滴水珠（Pinelliacordata）的繁殖周期，促進其種質(zhì)資源的保存與產(chǎn)業(yè)化利用，以滴水珠的葉片和葉柄為外植體，研究不同植物激素種類及其配比對滴水珠外植體組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：葉柄作為外植體較優(yōu)；愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)最優(yōu)條件為MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 1.0mg/L，只需7～15d即可轉(zhuǎn)接；分化及增殖最優(yōu)條件為MS＋6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L，增殖倍數(shù)達9.2倍，時間僅需14d；生根培養(yǎng)最優(yōu)條件為MS＋6-BA 0.1mg/L＋IBA 0.5mg/L＋活性炭0.5g/L，7d即可煉苗移栽。通過對各階段進行分步優(yōu)化，繁殖周期縮短為44d，有利于滴水珠的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

滴水珠；組織培養(yǎng)；植物激素；再生體系；藥用植物

滴水珠（PinelliacordataN.E.Br.）為天南星科（Araceae）半夏屬多年生草本植物，主要分布于我國浙江和貴州等地，是我國特有的重要天然藥用植物［1］。其塊莖含多種氨基酸和生物堿［2］（如，吲哚生物堿Neoechinulin A［3］）、微量元素［4］及多種化合物，主治毒蛇咬傷［5］及用于腫瘤病人的消腫止痛［6］，其凝集素顯示出明顯的抗蟲性［7］。滴水珠對環(huán)境要求較高，主要生長在巖石邊、巖隙中或巖壁上、林下溪旁以及潮濕草地，以無性珠芽繁殖為主［1］。隨生境改變和過度采挖，其自然分布區(qū)越來越窄，僅分布于難以采挖的巖隙和巖壁上。因此，人工培育滴水珠種苗是對其進一步開發(fā)利用的重要技術(shù)，組織培養(yǎng)是培育種苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。李偉平等［8］在郁建新［9］研究的基礎(chǔ)上，對分化和生根培養(yǎng)基進行了篩選，但是其繁殖周期達89d；雖然王玉嬌等［10］通過改變激素配比，得到愈傷組織誘導的最佳組合，但繁殖周期依然沒有縮短，甚至更長，達7個多月［11］。因此，筆者擬通過改變激素種類和配比，重新篩選滴水珠組織培養(yǎng)各階段的最優(yōu)配方，旨在提高滴水珠的繁殖效率和縮短繁殖周期，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體 滴水珠植株采集于浙江省溫州市永嘉縣，2015年8月盆栽種植于貴州大學植物生理學實驗室，待長出新葉后，選取幼嫩的葉柄和葉片備用。

1.1.2 試劑 MS培養(yǎng)基、6-芐基嘌呤、α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸和無水氯化鈣等均為分析純。

1.1.3 其他 栽培基質(zhì)，按土∶有機肥∶鋸末＝10∶1∶2混合拌勻。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 用軟毛刷刷洗葉柄和葉片表面泥土，洗潔精浸泡30min，流水沖洗2h，再將材料放入超凈工作臺用75%酒精消毒45s，0.1%的升汞消毒7min，無水乙醇沖洗3次，最后放入培養(yǎng)皿中濾干水分備用。

1.2.2 試驗設(shè)計 所有培養(yǎng)基均以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加3%蔗糖30g/L＋瓊脂8g/L，控制pH5.8～6.0。培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強度2 000～2 500lx、光照時間為12h/d。

1）愈傷組織誘導。試驗設(shè)9個處理（表1），即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同配比的6-BA、NAA和2，4-D，以文獻［8］中的最佳培養(yǎng)基為對照（CK）。外植體滅菌后，葉柄切成大小為1cm左右的小段，葉片切成1cm×1cm大小，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，每種處理接種48管。

表1 滴水珠愈傷組織誘導培養(yǎng)基不同激素的種類與配比Table 1 Types and proportion of various hormones for callus induction ofP.cordatamg/L

2）不定芽分化與增殖培養(yǎng)。不定芽分化試驗設(shè)6個處理（表2），即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同配比的6-BA、NAA和2，4-D，以文獻［8］中的最佳培養(yǎng)基為對照（CK）。不定芽增殖試驗設(shè)3個處理，在不定芽分化培養(yǎng)基礎(chǔ)上選取不定芽分化率較高的培養(yǎng)基、參考文獻［8］中分化率高的P1及任意培養(yǎng)基P3等3種進行試驗。愈傷組織形成后將其轉(zhuǎn)移至不定芽培養(yǎng)基中進行不定芽分化培養(yǎng)，每種處理接種50個；待不定芽分化出綠色芽點后，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，每種處理接種50個。

表2 滴水珠不定芽分化和增殖培養(yǎng)基不同激素的種類與配比Table 2 Types and proportion of various hormones for adventitious bud differentiation and proliferation ofP.cordatamg/L

3）生根培養(yǎng)。試驗設(shè)2個處理，T1，生根培養(yǎng)基為MS＋0.1mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋ 0.5g/L活性炭；T2，生根培養(yǎng)基為1/2MS＋NAA 0.25mg/L［8］（CK），每種處理接種小苗72個。即待小苗長到一定高度后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

4）煉苗和移栽。組培苗生長10d左右，取3批共180株生長健壯、根系形成良好且株高為5～10cm的組培苗，揭開蓋子放置3～5d，然后取出組培苗用水洗凈根部的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)種于栽培基質(zhì)，澆透水后置于20～25℃及50%濕度的遮蔭環(huán)境下培養(yǎng)，每2d澆水1次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

愈傷組織誘導率＝（產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

芽分化率＝（出現(xiàn)芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)）×100%

增殖倍數(shù)＝（叢生芽總數(shù)/接種總苗數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷組織的誘導效果

從表3可知，1）葉柄外植體。接種葉柄（圖示A）外植體在9種培養(yǎng)基中均可誘導產(chǎn)生愈傷組織，M2、M7與M8間誘導率差異不顯著，與其他處理間差異顯著。其中，M4的誘導率最高，達60%；其次是M3，達55%。在6-BA濃度為1mg/L時，隨NAA濃度的升高，愈傷誘導率降低，而2，4-D則相反；當6-BA濃度為2mg/L時，隨NAA和2，4-D濃度的升高，愈傷誘導率均升高，且 NAA為1mg/L時，誘導率達最大（圖示B）。當6-BA與NAA比值為2∶1時，愈傷組織誘導率均升高；而2，4-D＋6-BA組合的誘導效果較6-BA＋NAA組合差。2）葉片外植體。接種葉片外植體在9種培養(yǎng)基中，除M2外，其他處理均可誘導產(chǎn)生愈傷組織（圖示C），M3與M6，M5與M9處理間差異性均不顯著，與其他處理間差異顯著。其中，M4誘導率最高，達57%。6-BA濃度為1mg/L，隨著2，4-D濃度的增加，誘導率呈先減后增，其他處理則與葉柄的一致。說明，滴水珠葉柄和葉片誘導愈傷組織的最適激素組合為2mg/L 6-BA＋1mg/L NAA。

表3 不同激素配比滴水珠不同愈傷組織的誘導培養(yǎng)效果Table 3 Callus induction effects under different hormone combinations %

圖示 滴水珠組織培養(yǎng)快繁體系的不同階段Fig. Different stages of rapid propagation system ofP.cordata

2.2 不同激素配比對不定芽分化與增殖培養(yǎng)效果

1）不同激素配比不定芽的分化效果依次為P5（100%）＞P1（90%）＞P2（70%）＞P3（67%）＞P6（60%）＞P4（45%）。在NAA濃度不變情況下，隨6-BA濃度升高，不定芽的分化率不斷降低。2mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA分化率達100%。經(jīng)差異顯著性分析，P1和P5差異不顯著，但二者與其他處理間差異顯著；P2與P3差異不顯著，但與其他處理間差異顯著。P5不定芽7～12d即可進行增殖，且不定芽長勢較好（圖示E），芽整齊度高。說明，P5（2mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA）為不定芽分化的最佳激素配比。

2）從表4可知，不定芽的長勢和增殖倍數(shù)均依次為P5＞P3＞P1。P5不定芽增殖倍數(shù)最高，7d即達9.2倍（圖示F）；P1不定芽只能維持基本生長，并不增殖；P3不定芽增殖倍數(shù)為4.3倍，3組的增殖倍數(shù)差異較大，差異顯著。

表4 不同培養(yǎng)基處理不定芽的增殖效果Table 4 Proliferation of adventitious buds in different culture medium

2.3 組培苗生根、煉苗與移栽

觀察發(fā)現(xiàn)，T1的小苗發(fā)根株數(shù)為72個，生根率為100%，根系發(fā)達（圖示G），有5～9根，主根長度最長可達10cm，植株高度可達8～12cm；而T2的小苗發(fā)根株數(shù)只有50株，生根率為69%，根的長勢一般。選取經(jīng)煉苗后生長健壯、根系形成良好，葉片2～3，株高8cm左右的植株（圖示H）進行移栽，1個月后其成活率達100%（圖示I）。

2.4 繁殖周期

在最佳培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導時間為10d，不定芽分化時間為7d，增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d即可轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10d后可進行煉苗移栽，繁殖周期為44d。

3 結(jié)論與討論

滴水珠的葉柄和葉片在添加激素2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L NAA培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率較高，且6-BA＋NAA組合誘導效果優(yōu)于6-BA＋2，4-D組合。該研究結(jié)果與劉鑫欣等［12］愈傷組織誘導的激素以6-BA為主，NAA其次，而2，4-D影響不顯著的結(jié)論一致，但與李偉平等［8，10］研究結(jié)果不同?？赡鼙驹囼炇褂玫牟牧吓c其所用材料的基因型不同，因而最適的激素種類不同。林婭等［13-15］的研究也證明，NAA誘導愈傷組織的效果優(yōu)于2，4-D。

在添加激素2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L IBA處理下，不定芽分化率較李偉平等［8，10］提高12%，分化時間縮短7d。表明，細胞分裂素與生長素相互作用，當二者比值高時可誘導不定芽正常分化［16］；該研究細胞分裂素與生長素比（10∶1）高于李偉平等［8，10］的試驗比例（2∶1），可能是導致不定芽分化率提高、時間縮短的主要原因。

通過優(yōu)化激素種類和配比，獲得增殖和繼代培養(yǎng)的最優(yōu)激素種類為2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IBA，2種激素的用量比例為10∶1。聞麗等［17］的研究表明，6-BA與IBA的組合適合油茶花藥愈傷組織的進一步繼代培養(yǎng)，6-BA與IBA組合是否適用于更多植物的繼代培養(yǎng)，有待研究。

該研究表明，在MS培養(yǎng)基＋0.1mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA＋0.5g/L活性炭條件下，不定芽生根數(shù)目、質(zhì)量以及所用時間均優(yōu)于李偉平等［8，10］。推測可能是因為活性炭創(chuàng)造的黑暗條件有利于根的誘導和根系的生長［18］。

滴水珠的愈傷組織誘導繁殖周期為44d，與之前滴水珠繁殖周期最快89d［8］相比，縮短培養(yǎng)周期1/2。王玉嬌等［10］曾對滴水珠的愈傷組織誘導進行優(yōu)化，但并未縮短其繁殖周期；其認為，材料增殖再多但不生根就不是一株完整的植株［19］。因此，要獲得最優(yōu)的培養(yǎng)體系，應對各環(huán)節(jié)進行優(yōu)化。

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（責任編輯：王 海）

Tissue Culture System Optimization ofPinelliacordata

ZHU Yanyan，LUO Rui＊，CHEN Haili，LIU Dan
（CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China）

In order to shorten the reproductive cycle ofP.cordataand promote the preservation and industrialization utilization of the genetic resources，leaves and petioles were used for explants，the effects of different types of plant hormones on the tissue culture were studied.Results：Petiole was proved to be the best explants for callus inducing.The best conditions for callus induction was MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 1.0mg/L.Differentiation and propagation culture with medium MS＋6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L could increase the proliferation ratio which could reach 9.2.The rooting medium（MS）supplied with IBA 0.5mg/L＋6-BA 0.1mg/L＋AC 0.5g/L was optimal.The test-tube plantlets could be transplant after 7days of rooting culture.The reproduction cycle was shortened to 44d，which was beneficial for industrialization production ofP.cordata.

Pinelliacordata；tissue culture；phytohormone；regeneration system；medicinal plant

S567.2

A

2016-03-26；2016-08-20修回

國家自然科學基金項目“半夏珠芽發(fā)育的激素調(diào)節(jié)和關(guān)鍵調(diào)控基因克隆研究”（31560081）；貴州大學創(chuàng)新基金項目“滴水珠珠芽發(fā)育的形態(tài)解剖學研究”（研農(nóng)2016006）

朱燕燕（1989-），在讀碩士，研究方向：植物生理學。E-mail：15761622057＠163.com

＊通訊作者：羅 睿（1974-），副教授，碩士生導師，從事發(fā)育生物學研究。E-mail：luorui＿physiol＠126.com

1001-3601（2016）09-0393-0101-04