雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草的核型分析

羅宗志，林潔榮，2＊，羅虹建，林志魁，陳碧成

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350000；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350000；3.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350000；4.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州350000）

雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草的核型分析

羅宗志1，林潔榮1，2＊，羅虹建2，3，林志魁4，陳碧成1

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350000；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350000；3.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350000；4.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州350000）

為狼尾草屬種質(zhì)資源的多樣性保護、利用及遺傳育種研究提供理論依據(jù)，采用常規(guī)壓片法對雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草的染色體數(shù)目及核型進行分析。結(jié)果表明：2種牧草的染色體基數(shù)為x＝7，均為3倍體，染色體數(shù)目為2n＝21條。雜交狼尾草的核型公式2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，染色體相對長度組成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L，第1組和第5組染色體含有隨體；桂牧1號雜交象草核型公式2n＝3x＝21＝3m＋18sm，染色體相對長組成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L，未發(fā)現(xiàn)隨體。雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草核型不對稱系數(shù)分別為60.79%和65.06%，分別屬于1B型和2B型，桂牧1號雜交象草的進化程度高于雜交狼尾草。

雜交狼尾草；桂牧1號雜交象草；牧草；染色體；核型

雜交狼尾草（P.americanum×P.purpureum）隸屬禾本科狼尾草屬，為多年生草本植物，由美洲狼尾草和象草雜交而成，雜種優(yōu)勢明顯，具有產(chǎn)量高、抗逆性強、耐刈割和適口性好等優(yōu)點，近年來作為優(yōu)質(zhì)牧草被廣泛種植［1-2］。桂牧1號雜交象草〔（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu No.1〕隸屬禾本科狼尾草屬，為多年生牧草新品種，由矮象草和雜交狼尾草雜交而成，具有生物產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、抗逆性強和適應(yīng)性廣等優(yōu)點，近年來在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用［3-4］。到目前為止，國內(nèi)外科研工作者對雜交狼尾草的研究主要集中在外植體愈傷組織的誘導、堿預(yù)處理、栽培技術(shù)、青貯飼料和RAPD分析等方面［5-8］，對桂牧1號雜交象草的研究主要集中在栽培技術(shù)、植物特征分析和飼喂動物等方面［9-10］，但對細胞核型方面的研究鮮見報道。

染色體是基因的攜帶者，遺傳物質(zhì)的載體［11］。研究染色體數(shù)目與核型對植物系統(tǒng)演化、物種之間親緣關(guān)系及遺傳工程中染色體鑒別具有重要意義［12］。目前，狼尾草屬一些牧草核型方面的研究已有報道，如朱丹丹等［13］研究了象草和巨菌草的核型及親緣關(guān)系；周自瑋等［14］對云南德宏地區(qū)的逸生狼尾草進行了分類學鑒定；張倫等［15］對長序狼尾草的核型進行了分析研究。但目前未見關(guān)于雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草的核型參數(shù)信息。為此，筆者以雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草為試驗材料，采用常規(guī)壓片法對其染色體數(shù)目及核型進行分析，以期為狼尾草屬種質(zhì)資源的多樣性保護、利用及遺傳育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交狼尾草來源于江蘇農(nóng)科院土壤肥料研究所；桂牧1號雜交象草來源于廣西畜牧研究所。2種牧草均采集于福建省福州市福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源圃（26°10′55.62″N、119°23′21.24″E，海拔10m）。選取不同植株且長勢良好，生長100d以上的雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草莖稈，按2節(jié)切成一段，插入帶有細沙的塑料桶中，水以淹沒幼芽1cm為宜，將塑料桶擺放在塑料大棚內(nèi)，每天換水1次，常溫下培養(yǎng)生根。待根尖長至2～3cm時，于8：00～9：00截取不同莖稈上生長旺盛、潔白幼嫩的根尖1cm作為試驗材料。

1.2 染色體制片

1）預(yù)處理。將根尖放入冰水混合物離體處理，然后置于0.05%秋水仙素溶液中室溫處理2h。2）固定。用蒸餾水沖洗后將根尖放入4℃卡諾氏液（V無水乙醇∶V冰乙酸＝3∶1）中固定24h。3）解離。將根尖洗凈后放入60℃恒溫水浴鍋中酸解10min，用蒸餾水沖洗酸液10min后轉(zhuǎn)入2%纖維素酶水溶液中室溫下酶解1h。4）再固定。將根尖洗凈后重新用卡諾氏液固定30min。5）染色。用蒸餾水沖洗酸液后轉(zhuǎn)入卡寶品紅染液室溫下染色1～2h。6）制片。取根尖置于載玻片上，用鑷子和剪刀切取根尖1mm，加1滴45%乙酸溶液，用鑷子將根尖充分壓碎，并使其均勻分散，加蓋玻片，用帶有橡皮擦的鉛筆輕輕敲打，并用食指壓緊，用濾紙吸取多余的乙酸溶液。

1.3 染色體觀察

將根尖細胞裝片置于尼康NI-U熒光顯微鏡載物臺上，在100倍低倍鏡下找到染色體視野后用1000倍油鏡繼續(xù)觀察，選擇分散良好、輪廓清晰、數(shù)目較全的染色體中期相進行拍照。

1.4 核型分析

根據(jù)首屆全國植物染色體學術(shù)研討會約定的標準［16］，每個品種選擇30個以上分裂中期細胞，以85%以上細胞具有相同的染色體數(shù)作為該品種的染色體數(shù)目，并選擇5個圖像清晰且分散良好的中期分裂相進行核型分析。首先利用核型分析軟件Karyo 3.1處理染色體圖片，然后進行染色體編號、確定著絲粒位置并測量其長臂、短臂值。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行同源染色體配對組合并繪制核型圖，采用Excel 2010繪制核型模式圖，按臂長由長到短的順序進行編號，最后取5個細胞的平均值作為核型參數(shù)。核型分析按照文獻［17］的方法，染色體相對長度組成參照文獻［18］的分類標準，染色體排序參照文獻［19］的命名系統(tǒng)，核型分類參照文獻［20］的分類標準，核型不對稱性系數(shù)參照文獻［21］的方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種狼尾草屬牧草的染色體數(shù)目

2.1.1 雜交狼尾草 經(jīng)觀察計數(shù)，分散良好、輪廓清晰的雜交狼尾草細胞染色體數(shù)目為20條、21條、22條的分別有2個、27個和1個細胞，分別占計數(shù)總數(shù)的6.67%、90.00%和3.33%。染色體數(shù)目為2n＝21條，染色體基數(shù)x＝7（圖1），為3倍體。

2.1.2 桂牧1號雜交象草 經(jīng)觀察計數(shù)，分散良好、輪廓清晰的桂牧1號雜交象草細胞染色體數(shù)目為20條、21條、22條的分別有1個、27個和2個細胞，分別占計數(shù)總數(shù)的3.33%、90.00%和6.67%。染色體數(shù)目為2n＝21條，染色體基數(shù)x＝7（圖2），為3倍體。

圖1 雜交狼尾草染色體的中期相（左）和核型（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）ofP.americanum×P.Purpureum

圖2 桂牧1號雜交象草染色體的中期相（左）和核型（右）Fig.2 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）of（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1

2.2 2種狼尾草屬牧草染色體的核型

2.2.1 雜交狼尾草 從表1、表2可知，雜交狼尾草染色體核型公式為2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，由此看出，體細胞中期染色體由18條中部染色體和3條近中部染色體組成，其中第1組和第5組染色體含有隨體（圖3）。從染色體相對長度組成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L看，雜交狼尾草由短染色體、中短染色體、中長染色體和長染色體組成，7組染色體相對長度介于5.95%～23.80%，相對長度指數(shù)介于0.42～1.67，最長染色體與最短染色體長度比為4.00，臂比范圍在1.43～1.80，無臂比值大于2的染色體。核型不對稱系數(shù)As.K＝60.79%，按照核型分類標準，雜交狼尾草核型屬于1B型。

表1 2種狼尾草屬牧草的染色體核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of two Pennisetum varieties

表2 2種狼尾草屬牧草的染色體核型特征Table 2 Karyotype characteristics of two Pennisetum varieties

圖3 雜交狼尾草（左）、桂牧1號雜交象草（右）染色體的核型模式Fig.3 The karyotype ideogram ofP.americanum×P.purpureum（left）and（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1（right）

2.2.2 桂牧1號雜交象草 從表1、表2可知，桂牧1號雜交象草染色體的核型公式為2n＝3x＝21＝3m＋18sm，由此看出，體細胞中期染色體由3條中部染色體和18條近中部染色體組成，未發(fā)現(xiàn)隨體（圖3）。從染色體相對長度組成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L看，桂牧1號雜交象草由短染色體、中短染色體、中長染色體和長染色體組成，7組染色體相對長度介于7.29%～23.24%，相對長度指數(shù)介于0.51～1.63，最長染色體與最短染色體長度比為3.19，臂比介于1.68～2.14，臂比值大于2的染色體比例為28.57%。核型不對稱系數(shù)As.K＝65.06%，按照核型分類標準，桂牧1號雜交象草核型屬于2B型。

3 結(jié)論與討論

染色體數(shù)目是最穩(wěn)定的細胞學特征之一，染色體核型可以揭示生物在系統(tǒng)演化中的位置，也是判斷生物與其相近物種間親緣關(guān)系的重要依據(jù)［22］。研究結(jié)果表明，雜交狼尾草、桂牧1號雜交象草染色體數(shù)為21條，比例均超過85%，確定其染色體數(shù)為2n＝21條。根尖細胞中偶爾存在附加1～2條額外的染色體，也有部分缺失的染色體，可能跟染色體變異有關(guān)。陳志彤等［23］研究表明，狼尾草屬植物染色體基數(shù)分為兩大類：一類基數(shù)為x＝7，如美洲狼尾草2n＝2x＝14，象草2n＝4x＝28，逸生狼尾草2n＝4x＝28等；另一類基數(shù)為x＝9，如中亞白草2n＝4x＝36，東非狼尾草2n＝4x＝36，中序狼尾草2n＝4x＝36等。由此推斷，雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草染色體基數(shù)均歸為第一類，即染色體基數(shù)x＝7，為3倍體，染色體數(shù)目為2n＝21條，雜交狼尾草的染色體數(shù)和倍性均與陳禮偉等［24］的研究結(jié)果一致，桂牧1號雜交象草的染色體數(shù)和倍性均為首次報道。雜交狼尾草與桂牧1號雜交象草染色體數(shù)目和倍性均相同，說明其親緣關(guān)系較近，同時也印證其來源相似，都是通過雜交選育而成，雜交狼尾草由4倍體象草和2倍體美洲狼尾草雜交選育而成，桂牧1號雜交象草由矮象草和3倍體雜交狼尾草雜交選育而成。

雜交狼尾草的核型不對稱系數(shù)為60.79%，由18條中部染色體（m）和3條近中部染色體（sm）組成，核型類型屬于1B型；桂牧1號雜交象草的核型不對稱系數(shù)為65.06%，由3條中部染色體（m）和18條近中部染色體（sm）組成，核型類型屬于2B型。根據(jù)核型分類標準［25］，核型對稱性與物種進化相輔相成，核型對稱性越低的生物染色體變異越大，物種進化程度越高；核型對稱性越高的生物染色體變異越小，進化程度越低。因此，不論從核型不對稱系數(shù)還是核型類型看，雜交狼尾草和桂牧1號雜交象草在進化上都屬于比較原始的類型，與張懷山［26］對中型狼尾草的研究結(jié)果一致；但桂牧1號雜交象草的進化程度比雜交狼尾草高，由于桂牧1號雜交象草由雜交狼尾草和矮象草雜交選育而成，這與雜交可以加速物種進化程度的規(guī)律相符［27］。雜交狼尾草第1組和第5組染色體的短臂上均發(fā)現(xiàn)了隨體，此結(jié)果鮮有報道。

目前，從國外引進的狼尾草屬牧草較多，命名比較混亂，常出現(xiàn)同物異名、同名異物的現(xiàn)象，給育種工作帶來了較大困難，嚴重阻礙狼尾草屬牧草的應(yīng)用推廣和可持續(xù)發(fā)展。核型分析為研究生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和物種分化提供了重要依據(jù)［28］，同時應(yīng)結(jié)合形態(tài)學、蛋白質(zhì)組學和分子生物學等研究方法，為鑒定狼尾草屬牧草種質(zhì)資源、遺傳育種、系統(tǒng)演化等提供可靠的理論依據(jù)。

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（責任編輯：馮 衛(wèi)）

Karyotype Analysis ofPennisetumamericanum×Pennisetumpurpureumand（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1

LUO Zongzhi1，LIN Jierong1，2＊，LUO Hongjian2，3，LIN Zhikui4，CHEN Bicheng1
（1.CollegeofAnimalScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；2.China NationalEngineeringResearchCenterofJUNCAOTechnology，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；3.CollegeofFood Science，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；4.CollegeofLifeScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000，China）

The chromosome number and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1was analyzed by the root tip squash method to provide the theoretical basis for diversity protection，utilization and genetic breeding ofPennisetumgermplasm resources.Results：The basic chromosome number，ploidy and chromosome number ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1both are 7，triploid and 21respectively.The karyotype formulas and relative chromosome length ofP.americanum×P.purpureumare 2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm and 6S＋3M1＋6M2＋6Lseparately and there is a trabant on the chromosome of Group 1and Group 5.The karyotype formulas and relative chromosome length of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1are 2n＝3x＝21＝3m＋18sm and 6S＋6M1＋3M2＋6Lrespectively and there is no a trabant on their chromosomes.The karyotype asymmetrical coefficient and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is 60.79%and 1B type，and 65.06%and 2Btype separately.The evolution degree of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is higher thanP.americanum×P.purpureum

Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum；（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1；forage grass；chromosome；karyotype

S334

A

2016-05-13；2016-07-22修回

國家林業(yè)局公益性行業(yè)專項“渾善達克沙地疏林型植被建設(shè)技術(shù)研究”（201504412）；福建省科技重大專項“菌草食藥用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2014NZ002-1）；國家菌草工程技術(shù)研究中心項目“菌草生物學特性及優(yōu)良品種評價體系研究”（JCGG14020）

羅宗志（1989-），男，在讀碩士，研究方向：草業(yè)科學。E-mail：1183525491＠qq.com

＊通訊作者：林潔榮（1958-），男，副研究員，碩士生導師，從事草業(yè)科學研究。E-mail：fafumcs＠163.com

1001-3601（2016）09-0370-0008-05