基于ITS2和rbcL序列石斛屬植物的鑒定

王 超，郭雪玲，郭瑞軍＊

（1.內(nèi)黃縣思源農(nóng)業(yè)科技有限公司，河南內(nèi)黃456300；2.安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院急診科，河南安陽(yáng)455000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100）

基于ITS2和rbcL序列石斛屬植物的鑒定

王 超1，3，郭雪玲2，郭瑞軍1，3＊

（1.內(nèi)黃縣思源農(nóng)業(yè)科技有限公司，河南內(nèi)黃456300；2.安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院急診科，河南安陽(yáng)455000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100）

為選育優(yōu)質(zhì)石斛品種和開發(fā)利用高效藥用石斛資源，利用形態(tài)學(xué)分類法和DNA條形碼技術(shù)對(duì)采集到的石斛樣品進(jìn)行鑒定，并對(duì)樣品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：樣品形態(tài)與石斛屬植物特征相似。以ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樣品GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale位于同一位置，其二級(jí)結(jié)構(gòu)也基本一致，螺旋區(qū)和莖環(huán)等結(jié)構(gòu)均無明顯區(qū)別。基于rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹沒有達(dá)到很好的分辨效果，石斛屬種間遺傳距離最大為0.028。表明ITS2比rbcL更適合石斛屬種間物種鑒定，并且其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的輔助作用。

石斛屬；ITS2；rbcL；二級(jí)結(jié)構(gòu)

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）最大的屬之一，全世界范圍內(nèi)約1 500種，我國(guó)有74種和2個(gè)變種，其中多數(shù)為傳統(tǒng)名貴中藥［12］。鐵皮石斛和美花石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效，由于鐵皮石斛具有廣泛的保健作用，更是被視為石斛中的珍品［34］。石斛生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特，對(duì)溫度、濕度等自然條件要求較高，并且生長(zhǎng)緩慢，人工種植難度大，成本高。過多依賴野生資源，使野生石斛遭到嚴(yán)重破壞，也導(dǎo)致醫(yī)藥市場(chǎng)上石斛商品來源混亂。準(zhǔn)確鑒定對(duì)石斛品種選育及確保石斛藥效具有重要意義，然而石斛屬植物的形態(tài)特征有較大的相似性，給該屬植物的鑒定工作帶來極大困難。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是一種利用標(biāo)準(zhǔn)的短的DNA片段來準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行物種鑒定的新技術(shù)［5］。Chen SL等［6］通過對(duì)753屬4 800種6 600余份樣品進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，ITS2在種水平上的鑒定成功率高達(dá)92.7%。陳士林等［7］經(jīng)過大量的工作研究，建立了以ITS2序列為主體的藥用植物DNA條形碼鑒定體系。ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)在多種藥用植物鑒別中得到應(yīng)用，并且常被用作DNA條形碼的輔助分析手段。rbcL基因是編碼葉綠體中核酮糖－1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）大亞基的單拷貝序列，是植物分類中普遍應(yīng)用的基因之一。為進(jìn)一步選育優(yōu)質(zhì)石斛品種和開發(fā)藥用石斛資源，筆者利用傳統(tǒng)形態(tài)分類和DNA條形碼技術(shù)對(duì)所采集的2個(gè)石斛屬樣品進(jìn)行分類，并對(duì)其ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期準(zhǔn)確鑒定石斛樣品，通過比較各種鑒定方法的不同，為進(jìn)一步優(yōu)化石斛鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

石斛：采集自廣西欽州（編號(hào)：GX07）和云南保山（編號(hào)：YN08），由內(nèi)黃縣思源農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

分別稱取約150mg石斛放入預(yù)冷研缽中，加液氮充分研磨后，使用DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。參考文獻(xiàn)［1］的方法設(shè)計(jì)ITS序列擴(kuò)增引物，正向?yàn)?′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG－3′，反向?yàn)?′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；參考文獻(xiàn)［8］的方法設(shè)計(jì)rbcL序列擴(kuò)增引物，正向?yàn)?′－ATGTCACCACAAACAG AGACTAAAGC－3′，反向?yàn)?′－GTAAAATCAAG TCCACCRCG－3′，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送上海英駿生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 序列分析

［9］的方法，基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov model）的注釋方法，去除5.8S和28S區(qū)段以獲得ITS2序列，將序列在NCBI網(wǎng)站上用Blast工具進(jìn)行同源序列比對(duì)［10］。從GenBank下載部分同源序列，利用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件進(jìn)行分析、處理［11］，用鄰接法（Neighbor－Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定分析各樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

2個(gè)樣品形態(tài)較為相似（圖1），莖圓柱形，粗約0.3cm，具多節(jié)。樣品GX07在莖節(jié)處長(zhǎng)出側(cè)芽，具氣生根（圖1－A）。樣品YN08的葉呈長(zhǎng)圓披針形，先端鈍且有鉤轉(zhuǎn)，葉鞘具紫斑（圖1－B）。根據(jù)2個(gè)樣品的形態(tài)特征，將其初步鑒定為石斛屬植物。花是被子植物重要的繁殖器官，能精確反應(yīng)物種的分類學(xué)地位［12］。由于所采集樣品尚未發(fā)育到開花階段，所以很難進(jìn)一步確定其分類地位。

圖1 石斛樣品的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Dendrobiumsamples

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

由圖2可知，樣品GX07和YN08的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)為單一條帶，ITS擴(kuò)增產(chǎn)物大小約750bp（圖2－A），rbcL片段大小在500～750bp（圖2－B），均與預(yù)期目的條帶大小相符。

圖2 石斛樣品PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of Dendrobiumsamples PCR products electrophoresis of Dendrobiumsamples

2.3 序列分析

大部分被子植物ITS區(qū)的GC含量約為50%［13］。通過比較2個(gè)樣品的ITS2序列，GX07的ITS2序列長(zhǎng)度為248bp，GC含量為52.42%，YN08略有不同，ITS2序列長(zhǎng)度為246bp，GC含量為51.22%。2個(gè)樣品的ITS2長(zhǎng)度和GC含量均與栗丹等［14］測(cè)定的石斛樣品結(jié)果相符合，且2個(gè)樣品的rbcL測(cè)序長(zhǎng)度接近，GX07樣品中為568bp，GC含量為42.43%，YN08樣品為567bp，GC含量為42.83%。

利用2個(gè)樣品的ITS2和rbcL序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中分別進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale的相似度均≥99%。Landeweert R等［15］在研究中指出，序列相似度≥99%可認(rèn)定為同一種，可以初步判定GX07為美花石斛（Dendrobium loddigesii），YN08為鐵皮石斛（Dendrobium officinale）。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

由圖3可知，GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale位于進(jìn)化樹的同一位置，且遺傳距離均為0.000，表明樣品與同一位置的物種為同一種。然而在rbcL構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖4）中，其并沒有處于同一位置，遺傳距離均為0.004，這可能與樣品rbcL序列兩端個(gè)別堿基測(cè)序準(zhǔn)確度有關(guān)。

基于ITS2序列構(gòu)建的進(jìn)化樹能很好地顯示出所選樣品間的差異，并且支持率較高，所選石斛屬樣品的種間遺傳距離最大、最小值分別為0.283和0.053，而rbcL序列分析顯示最大遺傳距離、最小遺傳距離分別為0.028和0.000，其中Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum在進(jìn)化樹的同一位置，遺傳距離為0.000，由此可知ITS2有較強(qiáng)的鑒別能力。

圖3 基于ITS2序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on ITS2sequence

圖4 基于rbcL序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree based on rbcLsequence

圖5 ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)比較Fig.5 The comparisons of ITS2secondary structures

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

從圖5可知，GX07和YN08的二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含1個(gè)中心環(huán)（主環(huán)）和4個(gè)螺旋區(qū)（Helix），在每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)上都有大小不等、數(shù)量不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Loop）。GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale的二級(jí)結(jié)構(gòu)相同，表明ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)在相同物種間差別較小。比較2個(gè)樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在主環(huán)大小、莖環(huán)大小和位置方面均有較大區(qū)別，表明其在不同物種間具有較強(qiáng)的鑒別能力。

3 結(jié)論與討論

ITS（Internal Transcribed Spacer）即內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分，在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快。其中，ITS2序列片段較短、易擴(kuò)增、通用性強(qiáng)，常被用于種和屬水平的系統(tǒng)發(fā)育分析［16］。試驗(yàn)以紋瓣蘭（Cymbidium aloifolium）為外類群，以包含樣品在內(nèi)的20條石斛屬物種的ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale遺傳距離為0.000，而種間遺傳距離最小，為Dendrobium gratiosissimum和Dendrobium officinale之間的0.053，說明ITS2序列在石斛屬種內(nèi)差異小、種間差異大，與嚴(yán)華［17］和Lau DT［18］等的研究結(jié)果一致。然而Xu SL等［19］通過對(duì)石斛屬184種的1 698條序列進(jìn)行分析，確定ITS＋matK為最有效的條形碼組合，而ITS2對(duì)166種664條序列的鑒定效率僅22.29%。

rbcL基因長(zhǎng)約1 400bp，容易擴(kuò)增和測(cè)序，其中，長(zhǎng)500～600bp的片段被用作植物條形碼，由于其進(jìn)化速率慢，適合用于研究屬及屬以上單位的系統(tǒng)進(jìn)化分析［20］。Xu SL等［19］的研究結(jié)果也證實(shí)了rbcL基因在石斛屬種間的分辨效率很低。通過對(duì)rbcL基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所選石斛屬樣品的種間遺傳距離最大，為0.028，Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum的遺傳距離為0.000，表明rbcL基因不適合石斛屬種間水平的鑒別。然而袁佐清等［21］通過rbcL基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與經(jīng)典的形態(tài)分類學(xué)結(jié)果基本一致。

石斛屬植物外形特征相似，該屬植物種類鑒定是蘭科植物最困難的問題之一。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地分辨物種，在植物鑒定中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。然而DNA序列的選擇極大影響了DNA條碼的準(zhǔn)確性，ITS2和rbcL序列能否使用還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Identification of Dendrobiumby ITS2 and rbcL Sequence

WANG Chao1，3，GUO Xueling2，GUO Ruijun1，3＊
（1.Neihuang Siyuan Agri－Tech.Co.，Ltd.，Neihuang，Henan 456300；2.Emergency Department，Anyang District Hospital，Anyang，Henan 455000；3.College of Life Sciences，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）

To breed high－quality varieties and develop resources of Dendrobium，the collected samples were identified by morphological determination and DNA barcoding method，anDThe ITS2secondary structure was predicted and analyzed.The results showeDThe morphology of the samples was similar to that of the genus Dendrobium.The phylogenetic tree based on ITS2sequence showeDThat GX07and Dendrobium loddigesii，YN08and Dendrobium officinale were located at the same position with nearly identical ITS2secondary structures.There was no significant difference in structures including Helix and Loop.However，the maximum genetic distance between genus Dendrobiumwas 0.028，without a very good resolution effect of the phylogenetic tree based on rbcLsequence.The results indicateDThat ITS2sequence may be more effective in the identification of different species of Dendrobiumwith its secondary structure playing a supportive role.

Dendrobium；ITS2；rbcL；secondary structure

R282.5

A

1001－3601（2016）10－0410－0001－04

2016－06－14；2016－10－05修回

王 超（1990－），女，從事植物系統(tǒng)進(jìn)化研究。E－mail：zhoumo＠nwsuaf.edu.cn

＊通訊作者：郭瑞軍。E－mail：guo＿2009＿2013＠nwsuaf.edu.cn。