1株不動桿菌發(fā)酵液對水稻紋枯病菌的抑菌作用

袁夢思++李建文++劉夢華++孫文秀

摘要：測定了1株不動桿菌A2發(fā)酵液對水稻紋枯病菌的抑菌率、菌絲的生長及菌核萌發(fā)和形成時間的影響。結(jié)果表明，不動桿菌A2發(fā)酵液對水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達82.6%；導致病原菌菌絲畸形，原生質(zhì)外漏；經(jīng)不動桿菌A2處理后降低了菌核的萌發(fā)指數(shù)，菌核萌發(fā)指數(shù)為38.2%；明顯延遲了菌核的形成時間。

關(guān)鍵詞：不動桿菌；發(fā)酵液；水稻紋枯病；病菌；抑菌作用

中圖分類號： S435.111.4+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0164-02

收稿日期：2015-03-27

基金項目：湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金（編號：2015MS021）。

作者簡介：袁夢思（1989—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向為細胞生物學。E-mail：YMS20151001@163.com。

通信作者：孫文秀，博士，副教授，主要從事植物病害的生物防治。E-mail：wenxiusun@163.com。水稻紋枯病是一種世界范圍內(nèi)的土傳真菌病害，為水稻三大病害之一，給水稻的生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟損失。水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起，該病原菌寄主范圍廣，致病力強，引起紋枯、立枯等癥狀。與傳統(tǒng)的化學防治、農(nóng)業(yè)防治等方法相比，利用微生物及其代謝產(chǎn)物來防治水稻紋枯病具有高效、安全、低毒、殘留少、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了包括木霉菌屬[1-2]、青霉菌屬[3]、內(nèi)生真菌[4]、芽孢桿菌屬[5]、假單胞菌屬[6]、內(nèi)生細菌[7]及鏈霉菌屬[8-9]等微生物，對水稻紋枯病具有較好的防治效果。尋找新型微生物源農(nóng)藥防治植物病害具有很大的應用前景，因而篩選更高抑菌活性的微生物對水稻紋枯病的防治有著重要的實踐意義。本研究探討了從土壤中分離到的1株不動桿菌（Acinetobacter sp.）A2對水稻紋枯病菌的抑制作用，為明確該菌的發(fā)酵液對水稻紋枯病的防治應用價值和今后開發(fā)安全的新型生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

不動桿菌A2分離自湖北地區(qū)芝麻田土壤；水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由長江大學微生物實驗室分離提供。

1.2培養(yǎng)基

水稻紋枯病菌培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；不動桿菌A2發(fā)酵用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（NB）。

1.3不動桿菌發(fā)酵液的制備

采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法。將不動桿菌A2在NA培養(yǎng)基上劃線后，挑取單菌落于5 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min，過夜培養(yǎng)。取菌液1 mL接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，振蕩培養(yǎng)48 h（28 ℃，120 r/min）。將不動桿菌A2發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液用細菌過濾器（濾膜孔徑0.22 μm）除菌，即得無菌濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4不動桿菌發(fā)酵液對水稻紋枯病菌的抑制作用

取1 mL不動桿菌A2無菌濾液與20 mL PDA培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿，制備平板。將直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于平板中央，28 ℃培養(yǎng)72 h，以不加無菌濾液的培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻紋枯病菌為對照。此外，將100 μL不動桿菌A2的菌液涂布于PDA平板，再接種水稻紋枯病菌菌塊培養(yǎng)。采用垂直十字法測量菌落直徑，按如下公式計算抑菌率：

抑菌率=對照菌落半徑-處理菌落半徑對照菌落半徑×100%。

1.5不動桿菌發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌絲的抑制作用

將水稻紋枯病菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、90 r/min 培養(yǎng)48 h，挑取菌絲球于無菌培養(yǎng)皿中，用不動桿菌A2的發(fā)酵液處理24 h，取菌絲做玻片，在倒置顯微鏡下觀察，以無菌水處理為對照，每處理重復3次。

1.6不動桿菌發(fā)酵液對水稻紋枯病菌菌核的影響

把滅菌的PDA培養(yǎng)基滴于無菌載玻片上，使之成一薄層，取出放在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)并保濕。將大小相同的水稻紋枯病菌菌核放入不動桿菌A2發(fā)酵液中處理1 h后取出，放在載玻片上，每張3粒，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌核的萌發(fā)情況。無菌水處理為對照，每處理重復3次。菌絲萌發(fā)指數(shù)測定參考于艷敏等的方法[10]。

將同齡、直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于含有不動桿菌A2無菌濾液的PDA培養(yǎng)上，28 ℃培養(yǎng)，記錄菌核形成的時間。以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻紋枯病菌為對照。

2結(jié)果與分析

2.1不動桿菌A2對水稻紋枯病菌的抑制作用

測定結(jié)果表明，不動桿菌A2無菌濾液對水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達82.6%；而A2菌液對水稻紋枯病菌的抑制率則為59.5%，表明不動桿菌A2的抑菌成分主要存在于無菌濾液中（表1）。采用倒置顯微鏡觀察A2無菌濾液處理后的水稻紋枯病菌菌絲，發(fā)現(xiàn)菌絲彎曲，頂端膨大，原生質(zhì)外滲（圖1-a）；而正常的水稻紋枯病菌菌絲細長，原生質(zhì)均勻，節(jié)間距大（圖1-b）。由此可見，不動桿菌A2對

水稻紋枯病菌具有明顯的抑制作用。

2.2不動桿菌A2對水稻紋枯病菌菌核的影響

在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用不動桿菌A2發(fā)酵液處理水稻紋枯病菌菌核后，菌核都能萌發(fā)，菌絲萌發(fā)指數(shù)為 38.2%，而用無菌水處理后的菌核菌絲萌發(fā)指數(shù)是76.7%，表明不動桿菌A2對水稻紋枯病菌的菌核萌發(fā)具有明顯的抑制作用。此外，在含有不動桿菌A2無菌濾液的培養(yǎng)基上，水稻紋枯病菌菌核形成的時間大大延長，比對照延遲了近72 h（表2）。

3討論

水稻紋枯病是典型的土傳真菌病害，以菌核形式越冬并作為來年病害發(fā)生的侵染源，給病害的有效防治造成了很大困難。目前，主要采用井岡霉素等化學藥劑防治水稻紋枯病，但長期單一使用井岡霉素導致水稻紋枯病菌易產(chǎn)生抗藥性，且嚴重污染環(huán)境。因此，有必要采取生物防治的措施來控制水稻紋枯病的發(fā)生，尋找新型的微生物資源也成為一種必然。在前期的研究中，從湖北地區(qū)的芝麻田土壤中分離到了幾株不動桿菌，并發(fā)現(xiàn)其對水稻紋枯病菌具有一定的拮抗作用。

不動桿菌廣泛分布于外界環(huán)境中，主要存在于水體和土壤中，是一類不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性的革蘭氏陰性菌。利用不動桿菌的代謝產(chǎn)物進行植物病害防治，與此相關(guān)的研究報道較少[11-12]。藺經(jīng)等[13-14]曾采用從樟樹中分離的鮑曼不動桿菌對梨樹的主要病害進行了防治，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液鮑曼菌素能夠抑制梨黑斑病、輪紋病和炭疽病等真菌性病害，起到了較好的防治作用。本試驗結(jié)果表明，不動桿菌A2的發(fā)酵液能夠有效抑制水稻紋枯病菌的生長，造成菌絲的畸形，降低菌核的萌發(fā)指數(shù)，延遲菌核的形成時間，達到了一定的抑菌效果。所以在此基礎(chǔ)上，有必要深入研究不動桿菌A2的作用機制，明確其在田間的防治效果，為研制推廣新的生防制劑及有效防治水稻紋枯病打下堅實的基礎(chǔ)。

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