青海省麥類黃矮病發(fā)生情況調(diào)查

劉楠++閆佳會+++姚強++郭青云

摘要：對青海省重要麥類種植區(qū)麥類黃矮病的發(fā)生情況、株系種類及傳毒介體蚜蟲進行系統(tǒng)調(diào)查，結(jié)果表明，2013年麥類黃矮病在青海省為輕發(fā)生年，2014年為輕度流行年；冬麥區(qū)田間麥蚜在小麥灌漿期達到高峰，拔節(jié)期開始出現(xiàn)黃矮病病株；春麥區(qū)麥蚜在拔節(jié)期以有翅蚜形態(tài)出現(xiàn)，灌漿期蚜量達到高峰，孕穗期田間開始出現(xiàn)黃矮病病株；麥蚜在禾本科雜草和春麥上越夏，冬小麥、春小麥、青稞、栽培燕麥、野燕麥均可以感染大麥黃矮病毒；流行黃矮病株系為GAV，株系PAV有少量發(fā)生，沒有發(fā)現(xiàn)GPV株系；傳毒介體蚜蟲優(yōu)勢種為麥長管蚜，麥二叉蚜及禾谷縊管蚜發(fā)生量較??；青海省循化、貴德等冬麥區(qū)的麥蚜可以越冬。

關鍵詞：麥類黃矮病；蚜蟲；GAV；麥長管蚜；青海省

中圖分類號： S435.121.4+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0154-04

收稿日期：2015-02-27

基金項目：國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201303021）。

作者簡介：劉楠（1987—），女，河南駐馬店人，碩士研究生，從事植物保護研究。E-mail：liunanqinghai@163.com。

通信作者：郭青云，碩士，研究員，從事植物保護研究。E-mail：guoqingyunqh@163.com。麥類黃矮病是由大麥黃矮病毒（BYDVs）引起、由蚜蟲傳播的一種全球性病毒病[1]，寄主廣泛，不僅侵染小麥、大麥，還危害燕麥、玉米、水稻等禾本科作物[2-5]，在小麥上的常見癥狀是植株矮化、抽穗率降低，葉片從葉尖開始失綠黃化，后逐漸干枯，而下部植株仍為綠色[6]。 BYDVs主要有4種株系類型，分別為GAV、GPV、PAV、RMV，其傳毒介體蚜蟲分別為麥二叉蚜（Schizaphis gramium）和麥長管蚜（Sitobion avenae）2種、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜（Rhopalosiphum padi）2種、禾谷縊管蚜、麥長管蚜和麥二叉蚜3種及玉米蚜1種[7]。目前，防控黃矮病仍以防治麥蚜為主，沒有表現(xiàn)突出的抗病毒藥劑[8-9]。

青海省地處青藏高原，麥類作物種植區(qū)主要集中在東部季風區(qū)，海拔從1 650～2 000 m，氣候區(qū)分布差異大，垂直變化明顯。河湟是麥類作物生長的主要地區(qū)，年平均溫度在 -6～-4 ℃，6—8月平均溫度為5.4～19.8 ℃，特殊的氣候條件導致麥類病害的發(fā)生規(guī)律更為復雜，不同于其他地區(qū)。翟浩等2010年對青海省東部小麥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2010年黃矮病在青海中度發(fā)生，西寧、貴德、樂都、互助地區(qū)小麥黃矮病主要流行株系為GAV[10]。近年來，青海省除種植小麥外，最多的麥類作物為青稞，栽培燕麥種植面積也越來越大。全面了解青海省麥類作物黃矮病的發(fā)生情況，系統(tǒng)了解青海省傳毒介體蚜蟲與黃矮病的發(fā)生規(guī)律，對黃矮病的防治具有指導作用，也可為抗病育種提供一些理論基礎。

1材料與方法

1.1調(diào)查地點概況

選擇青海省互助縣、貴德縣、循化縣3個不同氣候特征的地區(qū)作為麥蚜及小麥黃矮病系統(tǒng)調(diào)查的地點，其中，互助縣調(diào)查點為春麥，貴德縣和循化縣調(diào)查點為冬麥。麥類黃矮病樣本采集地除這3個地區(qū)外，還包括西寧市、湟中縣、海北州（表1）。

1.2蚜蟲發(fā)生種類與優(yōu)勢種調(diào)查

冬麥從3月初、春麥從5月底開始，各調(diào)查點每10 d左右從田間采集蚜蟲進行室內(nèi)蚜種鑒定，統(tǒng)計各蚜蟲數(shù)量，判定優(yōu)勢種。

1.3麥蚜越冬調(diào)查

冬麥區(qū)從冬麥出苗開始，定期到田間觀察麥苗上的蚜蟲情況，挖取小麥根部土層檢查有沒有蚜蟲；春麥區(qū)從小麥收割后開始，定期查看小麥殘茬根部自生麥苗及禾本科雜草蚜蟲的發(fā)生情況。

1.4蚜蟲消長規(guī)律調(diào)查

根據(jù)品種、播期、地勢、作物長勢等，選擇有代表性的麥田4～4.7 hm2，采用平行線抽樣法選取10點，每點在1行中等距離取10株，共100株。冬麥區(qū)從3月1日開始至小麥收割，春麥區(qū)從4月上旬開始至小麥收割，每5 d調(diào)查1次，統(tǒng)計百株蚜量、有翅蚜與無翅蚜比例[11]。

1.5小麥黃矮病病情調(diào)查

春麥區(qū)從田間出現(xiàn)病株開始，一直調(diào)查到小麥乳熟期，包括發(fā)病率和病情指數(shù)。調(diào)查時，如為黃矮病發(fā)生流行年，按5點取樣，如為一般發(fā)生年份，應調(diào)查田塊發(fā)病中心數(shù)及大小，田間發(fā)病率調(diào)查取樣應包括麥田邊行樣點，以避免因取樣所造成的誤差。黃矮病病株的病情采用5級分級：0級：健株；1級：部分葉片尖端變黃；2級：旗葉1～2片葉葉尖黃化；3級：旗葉黃化面積占旗葉總面積的1/2以下，其他葉片黃化面積占總?cè)~面積的1/2以下；4級：旗葉黃化面積占旗葉總面積的1/2以下，其他葉片黃化面積占總?cè)~面積的1/2及以上；5級：幾乎所有葉片完全黃化，植株矮化顯著，穗變小甚至不抽穗[12]。

1.6青海省麥類黃矮病發(fā)生株系調(diào)查

1.6.1田間病樣采集與識別2014年，于小麥、青稞、栽培燕麥、野燕麥抽穗期，在青海省西寧市、貴德縣、循化縣等田間采集疑似黃矮病樣本，記錄采集日期、地點、寄主、樣品數(shù)及發(fā)病癥狀，分別編號（表2），-80 ℃保存。麥類黃矮病識別癥狀：病株較健株稍矮，抽穗較晚，穗頭較?。幻黠@癥狀是葉片失綠，旗葉及上部葉片最先表現(xiàn)癥狀；小麥、青稞病葉是從葉尖開始發(fā)黃，質(zhì)地光滑，后期逐漸黃枯；栽培燕麥、野燕麥病葉從葉尖開始發(fā)黃變紅，質(zhì)地變硬。

1.6.2病毒株系鑒定

1.6.2.1試劑UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購自生工公司（Sangon Biotech）；RevertAidTM 第一鏈cDNA Synthesis試劑盒、Taq DNA polymerase 5 U/μL和dNTP mixture 2.5 mmol/L，購自Thermo公司。

1.6.2.2病毒RNA提取取植物葉片組織，在裝有液氮的研缽中充分研磨；取0.1 g樣品，加1 mL Trizol，混勻，室溫放置5～10 min使核蛋白與核酸完全分離；加入400 μL氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min；12 000 r/min、4 ℃離心 10 min；取上層水相600 μL，轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入300 μL無水乙醇，混勻；將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入500 μL RPE Solution，靜置2 min，10 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中廢液，重復1次；將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min離心2 min；將吸附柱放入干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated ddH2O，靜置5 min，12 000 r/min離心2 min；-20 ℃暫存，-70 ℃長期保存。

1.6.2.3提取的RNA質(zhì)量測定把提取的RNA稀釋200倍，即398 μL DEPC-treated ddH2O+2 μL RNA，使用核酸蛋白測定儀測量RNA質(zhì)量。

1.6.2.4引物設計與合成根據(jù)GenBank己報道的BYDV基因組序列[13]設計引物（表3），由上海生工生物工程有限公司進行合成。

1.6.2.5RT-PCR擴增按照Thermo使用說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應：0.2 mL RNase/DNase-free的離心管中加入 DEPC-treated H2O 4 μL、反向引物1 μL、病毒RNA 1 μL，短暫離心混勻，65 ℃孵育5 min，立即置于冰上；依次加入5×Reaction buffer 2 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1 μL、20 U/μL RiboLockTM RNA酶抑制劑0.5 μL、200 U/μL RevertAidTM M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，短暫離心混勻，42 ℃溫育1 h，70 ℃滅活 10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應液，總體積50 μL：10×PCR buffer 5 L；2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL；10 μmol/L正向引物1 μL；10 μmol/L 反向引物1 μL；反轉(zhuǎn)錄cDNA 5 μL；Taq DNA polymerase 0.25 μL；ddH2O 36 μL。在BIO-RAD S1000 PCR儀上進行擴增，反應條件為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性 2 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取PCR反應產(chǎn)物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1蚜蟲種類和優(yōu)勢種

由表4至表6可見，青海省小麥上發(fā)生的蚜蟲種類有麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜，其中優(yōu)勢種為麥長管蚜，禾谷縊管蚜發(fā)生較少；麥長管蚜在小麥整個生長期均有危害，穗期發(fā)生量相對最大；麥二叉蚜主要危害小麥葉片。

2.2麥蚜的越冬調(diào)查

2013年9月至2014年12月，對互助地區(qū)春麥收割后蚜蟲發(fā)生情況進行定期調(diào)查，結(jié)果顯示，春麥區(qū)麥蚜小麥收割前蚜量急劇降低，部分遷移到田邊禾本科雜草上，蚜量為0～50頭/百株；10月春麥田自生麥苗生長期，自生麥苗上百株蚜

量為0～200頭，且蚜蟲主要集中在接近土壤的莖根部；11、12月份，隨著氣溫降低，自生麥苗被凍死，田間已觀察不到蚜蟲，直至來年4月份挖取小麥根部土壤，均沒有發(fā)現(xiàn)蚜蟲；5月，春麥上最初發(fā)現(xiàn)的麥蚜中，有翅蚜占有絕大比例。冬麥區(qū)，2013年11月至2014年3月調(diào)查結(jié)果顯示，11月份小麥秋苗上蚜量為0～100頭/百株，并隨氣溫降低，蚜量逐漸減少；12月初到來年3月中旬，土層上部小麥植株上觀察不到蚜蟲；3月上旬，挖取小麥田土壤檢查，在小麥根部土壤檢查到綠色的低齡若蚜，且集中在向陽的田邊，這說明麥蚜在青海省冬麥種植區(qū)可以存活越冬，可能是來年黃矮病傳毒介體的重要蟲源。

2.3蚜蟲的消長規(guī)律調(diào)查

由表4至表6可見，冬麥區(qū)小麥，3月中旬小麥返青期開始在葉片上出現(xiàn)蚜蟲，且均為無翅蚜；5月上旬小麥抽穗早期，百株蚜量在100頭以內(nèi)，蚜量緩慢增長；6月上旬小麥灌漿期，田間蚜量迅速增多，百株蚜量在6 000頭左右，田間蚜量高峰出現(xiàn)，此時90%的蚜蟲集中在小麥穗部取食，葉片部位危害的基本上為二叉蚜；6月下旬，隨著小麥進入蠟熟期，蚜蟲群體密度又迅速減退，百株蚜量在1 000頭左右，并且有翅蚜比例上升；小麥進入成熟期，植株干枯，麥蚜逐漸遷移到其他寄主上或其他地方。春麥區(qū)小麥，5月下旬小麥拔節(jié)期才觀察到蚜蟲遷入小麥田，且98%均為有翅蚜；直到6月中旬，蚜蟲群體密度均較低，百株蚜量不足2頭；7月中下旬，蚜量突增，達到高峰，但相比冬麥區(qū)，麥蚜發(fā)生量較小，百株蚜量在800頭左右；8月中旬開始，小麥進入成熟期，蚜量又迅速降低，有翅蚜增多。

2.4小麥黃矮病病情調(diào)查

由圖1至圖3可見，青海省貴德、循化冬麥區(qū)，3月底田間小麥開始出現(xiàn)有黃矮病癥狀的病株；6月中旬小麥灌漿期，田間小麥黃矮病病情指數(shù)達到最高，病株率達到高峰；循化縣小麥黃矮病病情稍低于貴德縣，2013、2014年病情指數(shù)最高分別為3.5、6.9，病株率最高分別在4.9%、7.9%左右，根據(jù)相建業(yè)等對黃矮病的分級標準[12]，青海省2013年冬麥區(qū)小麥黃矮病為輕度發(fā)生年，2014年為輕度流行年。青海省互助縣春麥區(qū)，6月上旬小麥孕穗期開始觀察到病株出現(xiàn)，8月上旬小麥蠟熟期，小麥黃矮病發(fā)病達到高峰，2013、2014年病情指數(shù)最高分別為3.78、3.87，田間病株率分別在4.07%、7.74% 左右，青海省2013年春麥區(qū)小麥黃矮病為輕度發(fā)生年，2014年為輕度流行年。

在調(diào)查過程中還發(fā)現(xiàn)，小麥有病植株較正常植株矮小，穗頭較小，穗部輕微彎曲；重病植株不能抽穗，較早黃化、干枯、死亡；小麥黃矮病在田間發(fā)病不均勻，不同田塊病情差異較大。

2.5青海省麥類黃矮病發(fā)生株系調(diào)查

病葉樣本提取的總RNA通過核酸蛋白測定儀進行質(zhì)量檢測，D260 nm/D280 nm值均在2.0左右，這說明提取的樣本總RNA純度滿足試驗要求，可用作逆轉(zhuǎn)錄反應的模板。提取的病葉樣本RNA經(jīng)過RT-PCR擴增，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，被不同病毒株系侵染發(fā)病的葉片均擴增出各自的特異性目的條帶，而健康的小麥葉片則沒有特異性條帶出現(xiàn)（圖4），這說明RT-PCR具有特異性，擴增結(jié)果與預期相符。

由表7可見，大麥黃矮病毒在青海省麥類主要種植區(qū)均有發(fā)生，并且小麥、青稞、栽培燕麥、野燕麥均能感??；青海省

大麥黃矮病流行株系為GAV，另外有少數(shù)病株為GAV與PAV復合侵染，沒有PAV單獨侵染，也沒有GPV株系發(fā)生。

3結(jié)論

本研究系統(tǒng)調(diào)查了青海省小麥黃矮病發(fā)生嚴重程度、大麥黃矮病毒株系、傳毒介體蚜蟲的發(fā)生情況等，為該地區(qū)小麥黃矮病的防治提供了理論依據(jù)。調(diào)查結(jié)果顯示，青海省2013—

表72014年青海省麥類黃矮病株系檢測

采集地點寄主樣品份數(shù)GAVGPVPAV無病西寧市小麥1818000西寧市 青稞2524001西寧市栽培燕麥1717000西寧市野燕麥1010000貴德縣小麥3130010貴德縣野燕麥1515000循化縣小麥3230020互助縣小麥3535000互助縣青稞2726010互助縣栽培燕麥1211010湟中縣小麥3232000湟中縣青稞3028020湟中縣野燕麥1010000海北州西海鎮(zhèn)青稞3330030總計327316

（99.68%）010

（3.15%）1

2014年麥類黃矮病發(fā)生相對較輕，病毒流行株系為GAV，少量有PAV復合侵染，這與翟浩等在2010年對青海省大麥黃矮病株系檢測的結(jié)果[8]吻合；傳毒介體麥蚜優(yōu)勢種為麥長管蚜，麥二叉蚜有少量發(fā)生，禾谷縊管蚜零星發(fā)生；麥蚜在青海省冬麥區(qū)可以越冬，蚜量在小麥抽穗期達到高峰。從貴德縣、循化縣、互助縣麥蚜開始發(fā)生危害的時間和相應地區(qū)小麥黃矮病開始發(fā)病的時間來看，麥蚜開始危害與小麥黃矮病發(fā)病均相差20 d左右，這說明黃矮病在該地區(qū)的潛伏期為20 d左右。從各調(diào)查點蚜量和對應地區(qū)黃矮病的病情指數(shù)，結(jié)合楊菲等檢測青海省貴德地區(qū)蚜蟲帶毒率為75%左右的結(jié)論[14]可以看出，蚜量影響黃矮病的嚴重程度，防治麥蚜是防治黃矮病的關鍵，冬麥區(qū)控制拔節(jié)期麥蚜、春麥區(qū)控制孕穗期麥蚜是防治小麥黃矮病的關鍵時期。

青海省主要麥類作物包括小麥、青稞、栽培燕麥等均有黃矮病發(fā)生，尤其近幾年，栽培燕麥逐漸有大面積的種植，這就要求青海省在篩選當?shù)乜裹S矮病農(nóng)作物的同時，要全面考慮品種結(jié)構，進行合理布局，才能達到減輕病害的目的。

參考文獻：

[1]Oswald J W，Houston B R. A new virus disease of cereals，transmissible by aphid[J]. Plant Disease Reporter，1951，35：471-475.

[2]錢幼亭，周廣和. 小麥黃矮病毒寄主范圍的測定[J]. 植物保護，1987（1）：20-22.

[3]張秦風，趙玉俠，楊英，等. 玉米感染小麥黃矮?。˙YDV）初步研究[J]. 中國病毒學，1992，7（2）：192-196.

[4]張秦風，趙玉俠. 水稻感染小麥黃矮病毒（BYDV）初步研究[J]. 植物病理學報，1996，26（1）：64.

[5]Rochow W F. Transmission of barley yellow dwarf virus acquired from liquid extracts by aphids feeding through membranes[J]. Virology，1960，12（2）：223-232.

[6]王信，郭青云. 2010年青海省麥類病毒病流行分析及防治措施[J]. 青?？萍?，2011（2）：43-44.

[7]周廣和，張淑香，錢幼亭. 小麥黃矮病毒4種株系鑒定與應用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，1987，20（4）：7-12.

[8]翟浩，劉艷. 青海省大麥黃矮病毒的種類鑒定及基于CP基因的分子進化研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2011（24）：253-257.[9]張文斌，安德榮，任向輝. 中國小麥黃矮病的發(fā)生及綜合防控研究進展[J]. 麥類作物學報，2009，29（2）：361-364.

[10]Fabre F，Kervarrec C，Mieuzet L，et al. Improvement of barley yellow dwarf virus-PAV detection in single aphids using a fluorescent real time RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods，2003，110（1）：51-60.

[11]徐云，木德偉，梅紅，等. 迪慶青稞黃矮病和介體蚜蟲發(fā)生規(guī)律及防治技術[J]. 植物保護學報，2003，30（2）：219-220.

[12]相建業(yè)，馮崇川. 小麥黃矮病預測預報[J]. 植物保護學報，1994（1）：73-77.

[13]劉雙清. 大麥黃矮病毒三種株系的特異性檢測及PAV株系的群體遺傳變異[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2008.

[14]楊菲，吳茂森，陳華民，等. 我國不同地區(qū)麥蚜攜帶BYDV-GAV比率的差異[J]. 植物保護，2012，38（2）：117-119.

[15]于祥泉. 陜西省小麥黃矮病抗病性調(diào)查及流行株系檢測[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2010.

[16]張秦風，朱象三. 關于小麥黃矮病的研究進展[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，1995（2）：1-4.

[17]劉乾. 甘肅省天水市麥蚜發(fā)生規(guī)律及小麥種植模式對其種群數(shù)量的影響[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2010.崔鄭龍，柴秀娟，孔德真，等. 棉花枯萎病菌拮抗內(nèi)生菌的篩選和拮抗效果檢測[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（2）：158-163.