華北大黑鰓金龜幼蟲腸道菌的分離及對農(nóng)藥的降解

孫勇++曹小迎+++蔣繼宏++張先道

摘要：采用4種培養(yǎng)基對金龜幼蟲腸道內(nèi)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，并通過16S rRNA測序進(jìn)行初步鑒定，將分離獲得的菌株接種于含辛硫磷和毒死蜱的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上，初步測定對腸道內(nèi)微生物降解農(nóng)藥的能力。結(jié)果表明，選用的4種培養(yǎng)基中，淀粉-酪素培養(yǎng)基獲得的微生物數(shù)量最多，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基次之，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基最差。對13株有代表性的菌株進(jìn)行測序分析，初步鑒定這些微生物分屬9個屬，在分離篩選的菌株中隨機(jī)挑選供試的28株菌株中，在以毒死蜱（濃度100 mg/L）為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為8株，在以辛硫磷為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為19株，表明腸道中有一些微生物對農(nóng)藥有降解作用，其中對辛硫磷降解作用優(yōu)于毒死蜱，說明在防治華北大黑鰓金龜時，毒死蜱防治效果可能優(yōu)于辛硫磷。

關(guān)鍵詞：華北大黑鰓金龜；腸道微生物；分離；農(nóng)藥降解

中圖分類號： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0151-03

收稿日期：2015-03-26

基金項目：江蘇師范大學(xué)省藥用植物生物技術(shù)實驗室開放課題（編號：KLBMP1305）。

作者簡介：孫勇（1977—），男，江西高安人，碩士，講師，從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蔣繼宏，教授。Tel：（0516）83403515；E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。我國農(nóng)藥使用技術(shù)水平和農(nóng)藥的利用率都比較低，而更多的農(nóng)藥在施用后則進(jìn)入了土壤、水體和空氣中，對非靶標(biāo)生物和各個生態(tài)因子產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)低劣和農(nóng)藥殘留超標(biāo)[1-2]。長期大量使用農(nóng)藥使害蟲產(chǎn)生一定的抗藥性，因此要想殺死害蟲就得加大藥量，害蟲的抗藥性不斷增強，農(nóng)藥使用量不斷加大，就會形成惡性循環(huán)，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，國家環(huán)保局也發(fā)布：農(nóng)藥殘留污染已被列為環(huán)境污染重點治理的工程之一，因此解決農(nóng)藥污染問題勢在必行。生活在這些農(nóng)藥環(huán)境中的微生物，為了自身生存，與這些污染源一直在進(jìn)行著斗爭，隨著時間的推移，它們之間形成了一種協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，這些微生物具備了降解和利用這些污染源的機(jī)制。農(nóng)藥生物修復(fù)是利用特定的生物吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中農(nóng)藥污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境凈化、生態(tài)功能恢復(fù)的生物措施。而且已有大量研究表明細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等微生物對農(nóng)藥有很好的降解作用[3-10]，它們大多數(shù)來自土壤微生物類群。華北大黑鰓金龜為鞘翅目鰓金龜科昆蟲，分布在我國東北、華北、西北等地區(qū)，主要危害楊、柳、榆、桑、核桃、蘋果、刺槐、櫟等林木葉片，幼蟲危害闊、針葉樹根部及幼苗；幼蟲棲息在土壤中，取食萌發(fā)的種子，造成缺苗斷壟；將根莖、根系咬斷，使植株枯死，且傷口易被病菌侵入，引起其他病害發(fā)生。華北大黑鰓金龜幼蟲生活在土壤中，且長期接觸化學(xué)農(nóng)藥（辛硫磷和毒死蜱是常見的用來殺滅大黑鰓金龜?shù)幕瘜W(xué)農(nóng)藥），腸道內(nèi)可能含有一些能降解農(nóng)藥的微生物，因此我們分離了華北鰓金龜幼蟲腸道中微生物，采用16S rRNA序列分析進(jìn)行了初步鑒定，并就農(nóng)藥降解能力進(jìn)行了初步篩選。

1材料與方法

1.1供試材料

華北大黑金龜鰓幼蟲：取冬眠期幼蟲。

1.2培養(yǎng)基

TNYE培養(yǎng)基：酵母膏 0.25 g，K2HPO4 0.5 g，瓊脂 15.0 g，pH值為7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

淀粉-酪素培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，CaCO3 2 g，瓊脂15 g，pH 值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值7.2。

甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基：甘油10 g，L-天冬氨酸1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.1 g，瓊脂15 g，pH值 7.2，NaCl 10%，水1 L，pH值 7.2。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉20.0 g，磷酸氫二鈉2.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15.0 g，水1 L，pH值7.2。

ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖 4 g，水1 L，瓊脂15 g，pH值7.2。

LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，pH值7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，20 g瓊脂，1 L水。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：

NaCl 1.00 g，NH4NO3 1.00 g，K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.10 g，水1 L，pH值7.0。

1.3金龜幼蟲腸道微生物的分離

清洗5支試管，每支試管注入10 mL蒸餾水，加上試管塞，用高溫滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，取出后使其冷卻至室溫，并標(biāo)上編號為1、2、3、4、5。打開無菌操作臺進(jìn)行紫外滅菌。選取冬眠的金龜幼蟲放入75%的乙醇中浸泡2 min，在無菌操作臺上取出蟲體放在培養(yǎng)皿中無菌解剖。取少量腸道里白色物質(zhì)，放入標(biāo)號為1的試管，然后蓋上試管塞搖晃使微生物分布均勻，取出后在無菌操作臺上進(jìn)行梯度稀釋。從稀釋103倍和104倍的菌液中取50 μL，分別滴入供分離用的培養(yǎng)基中（分離培養(yǎng)基：TNYE培養(yǎng)基，淀粉-酪素培養(yǎng)基，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基），涂布均勻，把培養(yǎng)皿倒置放入恒溫保溫箱內(nèi)30 ℃培養(yǎng)8 d。觀察菌落生長情況，統(tǒng)計菌落數(shù)，并挑取部分菌株轉(zhuǎn)接于試管中保存。

1.4部分分離菌株的初步鑒定

通過測定16S rRNA 基因序列進(jìn)行初步鑒定，分離菌株總DNA 的提取參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行，PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1492R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物用經(jīng)EB 染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。依照測序結(jié)果，從NCBI （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，進(jìn)行序列比對分析。

1.5降解辛硫磷和毒死蜱菌株的篩選

配制含辛硫磷和毒死蜱有效成分100 mg/L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，將分離獲得的菌株接種于培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長狀況良好（能形成菌落）的即定為可降解菌。

2結(jié)果與分析

2.1各培養(yǎng)基菌株分離情況

由表1可知，選用的4種培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，淀粉-酪素培養(yǎng)基獲得的微生物數(shù)量最多，0.5 g濕樣/mL在稀釋103倍下平板菌落數(shù)162個，稀釋104倍下獲得菌落數(shù)36個，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基次之，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基最差，在稀釋103倍下平板菌落數(shù)為30個。

2.2分離獲得的菌株種類情況

從各種培養(yǎng)基中共挑取菌株65株，細(xì)菌保存于含LB培養(yǎng)基斜面試管中，放線菌保存于含ISP2培養(yǎng)基斜面試管中，從65株菌株挑取了13株有代表性的菌株進(jìn)行測序分析，由比對結(jié)果（表2）可知，幼蟲腸道微生物至少包括原小單孢菌屬（Promicromonospora）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、冢村氏菌屬（Tsukamurella）、壤霉菌屬（Agromyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、詹森菌屬（Janthinobacterium）、小單孢菌屬（Micromonospora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等9個屬。

2.3腸道微生物對2種農(nóng)藥的降解情況

挑選部分獲得的菌株，進(jìn)行降解毒死蜱和辛硫磷的試驗，結(jié)果見表3。

供試的28株菌株中，在以毒死蜱（濃度100 mg/L）為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為8株，占供試菌株28%，在以辛硫磷為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，能形成菌落的菌株為19株，占供試菌株67.8%，對毒死蜱和辛硫磷都能降解的有CH1、CH19、CH32、CH33、CH44、CH47（Sac

3討論

華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物的分離試驗選用的4種培養(yǎng)基中，淀粉-酪素培養(yǎng)基分離效果最好，甘油天門冬氨酸培養(yǎng)基分離效果最差。因此，在做腸道微生物分離試驗時建議使用淀粉-酪素培養(yǎng)基。

通過研究表明，一些腸道微生物對農(nóng)藥有降解作用，本試驗中，華北大黑鰓金龜幼蟲腸道微生物對辛硫磷降解作用優(yōu)于毒死蜱，說明在防治華北大黑鰓金龜時，毒死蜱防治效果可能優(yōu)于辛硫磷，腸道微生物的降解作用可能是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的原因之一。在農(nóng)藥降解上，微生物菌劑的使用也可能導(dǎo)致害蟲獲得有分解農(nóng)藥的菌株，為防止用藥量上的惡性循環(huán)，建議使用具有降解農(nóng)藥菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行農(nóng)藥降解，而不應(yīng)直接使用微生物菌體。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊新玲. 2011年我國農(nóng)藥產(chǎn)量情況[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2012（1）：50.

[2]王永杰，李順鵬，沈標(biāo). 有機(jī)磷農(nóng)藥樂果降解菌的分離及其活性研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，24（2）：71-74.

[3]張韓杰，閆艷春. 農(nóng)藥殘留及微生物在農(nóng)藥降解中的應(yīng)用與展望[J]. 湖北植保，2004（1）：31-35.

[4]虞云龍，樊德方，陳鶴鑫. 農(nóng)藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與發(fā)展策略[J]. 環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1996（3）：28-36.

[5]崔中利，李順鵬. 化學(xué)農(nóng)藥的微生物降解及其機(jī)制[J]. 江蘇環(huán)境科技，1998（3）：1-5.

[6]儀美芹，王開運，姜興印，等. 微生物降解農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，33（4）：519-524.

[7]魏敏，李玉江. 微生物降解土壤殘留農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J]. 山東化工，2007，36（3）：15-18.

[8]程國鋒，李順鵬，沈標(biāo)，等. 微生物降解蔬菜殘留農(nóng)藥研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1998（1）：82-85.

[9]Spychala J，Datta N S，Takabayashi K，et al. Cloning of human adenosine kinase cDNA：Sequence similarity to microbial ribokinases and fructokinases[C]//Proc.Natl，93.Sci.USA，1996：1232-1237.

[10]Müller C W，Schlauderer G J，Reinstein J，et al. Adenylate kinase motions during catalysis：an energetic counterweight balancing substrate binding[J]. Structure，1996，4（2）：147-156.

[11]姜淑梅，張龍，戴世鯤，等. 一種簡單、有效的適于PCR操作的放線菌DNA提取方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：39-41.劉楠，閆佳會，姚強，等. 青海省麥類黃矮病發(fā)生情況調(diào)查[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：154-158.