廣藿香不同部位總DNA提取方法比較與PTS基因克隆

陳英++吳友根++楊東梅++張軍鋒++林尤奮

摘要：分別采用PEX法、CTAB法和SDS法3種方法提取廣藿香葉、莖、根的基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測總DNA提取效果。結(jié)果表明，SDS法能高效一致地提取廣藿香根、莖、葉的總DNA。以葉總DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增廣藿香醇合成酶（PTS）基因，測序得到PTS基因（中國廣藿香）的全長序列，長度為3 058 bp，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，共編碼552個(gè)氨基酸。該P(yáng)TS基因所推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已登錄的印度廣藿香PTS氨基酸序列存在4.7%的差異。

關(guān)鍵詞：廣藿香；總DNA；廣藿香醇合成酶；克隆

中圖分類號： S567.21+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0081-04

收稿日期：2015-01-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81360618）；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)（編號：2012ZY015）。

作者簡介：陳英（1990—），女，貴州遵義人，碩士研究生，從事南藥種質(zhì)資源與活性成分研究。E-mail：814006138@qq.com。

通信作者：吳友根，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事南藥種質(zhì)資源與活性成分研究。E-mail：ccyyccii@163.com。純度高、質(zhì)量好的DNA是開展分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，是分子遺傳學(xué)試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素之一[1]，植物總DNA的純度還是影響PCR反應(yīng)的限制因素之一[2]。由于不同植物、甚至同一植物的不同部位，其代謝產(chǎn)物的種類和含量不同，尤其是多糖、多酚和蛋白質(zhì)等，很難找到一種高質(zhì)量DNA提取的通用方法[3-4]。因此對植物總DNA提取方法進(jìn)行比較分析、改進(jìn)，以獲得高質(zhì)量的植物總DNA提取方法極為重要。廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]為唇形科刺蕊草屬一年生草本植物，以干燥的地上部分入藥，是我國常用的芳香化濕類中藥之一，常用于治療濕濁中阻、脘痞嘔吐、寒濕閉暑、暑濕倦怠、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛、胸悶不舒等疾[5]。百秋李醇（又名廣藿香醇），是一種存在于天然植物中的三環(huán)倍半萜化合物，廣泛應(yīng)用于藥品、食品及日用化妝品行業(yè)，是廣藿香揮發(fā)油的主要成分之一，被歷版《中華人民共和國藥典》規(guī)定用作評價(jià)廣藿香藥材及廣藿香油質(zhì)量的指標(biāo)成分。百秋李醇的生物合成途徑類型與青蒿素的合成途徑相同，屬于類異戊二烯代謝途徑中的倍半萜類分支途徑。廣藿香醇合成酶（patchoulol synthase，PTS）被認(rèn)為是百秋李醇合成調(diào)控的關(guān)鍵酶[6]。2006年，Deguerry等從印度廣藿香中克隆得到了PTS基因的cDNA及DNA序列[6]；2014年，Hartwig等從印度另一栽培居群的廣藿香中克隆得到了PTS基因的cDNA序列，其編碼的氨基酸序列與之前報(bào)道的cDNA序列所編碼的氨基酸序列存在3.4%的差異[7]。中國廣藿香作為一種獨(dú)立栽培居群的廣藿香，其PTS基因序列與之前報(bào)道的印度廣藿香是否存在差異，目前尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選用3種常用的DNA提取方法，比較其對廣藿香根、莖、葉3個(gè)部位的提取效果，并以DNA為模板進(jìn)行PTS基因的PCR擴(kuò)展并克隆，比較克隆得到的基因序列及其編碼的氨基酸序列與之前報(bào)道的印度廣藿香的異同，為廣藿香PTS基因的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試的廣藿香植物材料采于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院廣藿香資源圃，采集生長期為5個(gè)月的廣藿香葉、莖、根，采后用液氮冷凍處理，-80 ℃保存，備用。

試驗(yàn)所用的主要試劑有SDS（十二烷基磺酸鈉）、CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）及PEX（乙基磺原酸鉀）（北京鼎國公司），Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、感受態(tài)細(xì)胞（上海生物工程有限公司），其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，引物合成及測序由北京諾賽基因組研究有限公司完成。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用PEX法、CTAB法及SDS法[8-10]分別提取廣藿香根、莖、葉的基因組總DNA。

1.2.2DNA質(zhì)量與濃度檢測取5 μL提取的廣藿香各部位總DNA溶液于0.8%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳，檢測DNA的完整性。并取1 μL DNA樣品，用無菌水稀釋50倍，用紫外分光光度計(jì)檢測D260 nm、D280 nm，并計(jì)算D260 nm/D280 nm，以確定其純度及得率。

1.2.3PTS基因PCR擴(kuò)增根據(jù)Genbank中登錄的PTS基因的DNA序列，設(shè)計(jì)全長引物用于廣藿香PTS基因的擴(kuò)增，引物序列如下：正向引物5′-ATGGAGTTGTATGCCCAAAG-3′；反向引物5′-TTAATATGGAACAGGGTGAA-3′。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4基因克隆和測序1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒純化目的條帶，將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR擴(kuò)增鑒定獲得陽性克隆。測序由北京諾賽基因組研究有限公司完成。

2結(jié)果與分析

2.1總DNA的光吸收比值和DNA得率

通常將光吸收比值作為衡量總DNA純度的一個(gè)重要指標(biāo)，D260 nm/D280 nm在1.7～1.9之間說明DNA純度較高，低于1.7說明存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染，高于2.0說明有RNA污染[10]。由表1可知，CTAB法所提取的葉總DNA及PEX法提取的根總DNA，其D260 nm/D280 nm分別為1.69和1.46，說明含有雜質(zhì)，而CTAB法未能從根中提取到DNA。PEX法和SDS法提取的葉總DNA，3種方法提取的莖總DNA及SDS法提取的根總DNA，其D260 nm/D280 nm界于1.78～1.86，說明純度較高。PEX法提取的葉總DNA得率最高，為229.17 μg/g，其次是CTAB法，SDS法得率最低。3種方法提取的莖總DNA得率相差不大，從122.69 μg/g到131.88 μg/g，而PEX法提取的根總DNA得率較SDS法高，約為其2倍。

2.2廣藿香3個(gè)不同部位基因組總DNA完整性的檢測

由圖1可知，不同部位的樣品其總DNA得率存在一定差異，廣藿香葉在3種不同的提取方法中均能得到較多的總DNA，其次是莖，而根提取的總DNA量則較少。CTAB法在廣藿香根中未提取出DNA，在葉中雖提取出了DNA，但出現(xiàn)輕微降解現(xiàn)象，說明此方法不能有效提取廣藿香基因組DNA，特別是提取其根中的DNA。PEX法和SDS法均能從廣藿香根、莖、葉中提取到總DNA，但PEX法提取的根總DNA雜質(zhì)較多，且條帶彌散，說明存在降解。雖然SDS法提取的葉總DNA濃度不如PEX法高，用其提取的莖總DNA效果與另外2種方法差異不明顯，但3種方法中只有SDS法可以從根中提取出條帶清晰、完整性好的總DNA。因此，SDS法能高效一致地提取廣藿香各部位的基因組總DNA，以此方法提取的DNA條帶亮、清晰完整、純度高。電泳檢測的結(jié)果和紫外分光光度計(jì)檢測的結(jié)果一致。

2.3藿香醇合成酶（PTS）基因的PCR擴(kuò)增及測序

以廣藿香葉總DNA為模板，進(jìn)行PTS基因DNA序列的全長擴(kuò)增，獲得3 000 bp左右的特異條帶（圖2），片段大小與預(yù)期相符。測序得到3 058 bp的序列，將序列在GenBank上經(jīng)Blast分析，發(fā)現(xiàn)與已登記的PTS基因序列DQ355151有較高的相似性，證明獲得的序列為PTS基因序列。

2.4生物信息學(xué)分析

將所得的PTS基因序列與已登記的PTS基因cDNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)PTS基因序列包含了完整的7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，7個(gè)外顯子的大小分別為115、264、376、221、137、252、294 bp，6個(gè)內(nèi)含子大小分別為144、455、79、119、79、523 bp。共編碼552個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.46，將其命名為PTS-1。在氨基酸組成中，酸性氨基酸（D、E）占15.40%，堿性氨基酸（K、R）占12.14%，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）占22.28%，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）占36.97%。由圖3可知， 蛋白質(zhì)疏

水性預(yù)測結(jié)果表明，PTS-1疏水性平均值（GRAVY）為 -0.323，表明該蛋白為親水性蛋白。利用在線分析軟件TMHMM 對PTS-1氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)果預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白為非跨膜蛋白。由圖4可知，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明該氨基酸序列含有4種二級結(jié)構(gòu)，有363個(gè)氨基酸參與 α-螺旋，占65.76%；54個(gè)參與延伸鏈，占9.78%；42個(gè)參與 β-轉(zhuǎn)角，占7.61%；93個(gè)參與無規(guī)則卷曲，占16.85%。本試驗(yàn)所得PTS基因序列與GenBank中已登記的該基因序列DQ355151相比，有53個(gè)核酸差異，所編碼的氨基酸序列與已登記的廣藿香PTS氨基酸序列ABC87816相比，有26個(gè)氨基酸差異，差異率為4.7%（圖3）。

3討論與結(jié)論

DNA是最重要的生物信息分子，是遺傳信息的載體，能快速、經(jīng)濟(jì)地從植物樣品中提取高產(chǎn)量、高純度的基因組DNA在當(dāng)前分子生物學(xué)研究中極為重要。1961年，十二烷基磺酸鈉（SDS）和氯仿從細(xì)胞中分離提取DNA樣品的方法被首次報(bào)道，自此，國內(nèi)外學(xué)者對不同樣品的DNA提取方法進(jìn)行了深入的研究，至今國內(nèi)外已報(bào)道了多種從植物細(xì)胞中提取DNA的方法。不同植物、甚至同種植物的不同器官，其化學(xué)成分及含量各不相同，導(dǎo)致DNA提取難易程度及所提出DNA的質(zhì)量存在明顯差異[11-15]。廣藿香化學(xué)成分主要有揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分2類，其中揮發(fā)性成分主要有酮類、萘類、單萜類、倍半萜烯類、醇類、烷酸類及醛類化合物等[16-17]。非揮發(fā)性成分主要為黃酮類、植物甾醇類、生物堿、三萜類、苯丙素苷類及烷酸類化合物等次生代謝產(chǎn)物及植物多糖[18-19]，在提取DNA的過程中，這些物質(zhì)會與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物，這些膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變，致使提取出來的DNA質(zhì)量降低甚至提取不出DNA，進(jìn)而抑制了PCR擴(kuò)增反應(yīng)。我們在提取過程中發(fā)現(xiàn)，從廣藿香根中提取的總DNA顏色為褐色，較難溶解，而從葉和莖中提取的總DNA為白色，溶解較易。

DNA的D260 nm/D280 nm在1.7～1.9之間通常被認(rèn)為純度較高、質(zhì)量較好，純的雙鏈DNA的D260 nm/D280 nm為1.8。如果總DNA的D260 nm/D280 nm低于1.7或高于2.0則被認(rèn)為是含有一定的雜質(zhì)，影響了DNA分子的光吸收值而導(dǎo)致的[10]，這些雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)、多糖、多酚和單寧類物質(zhì)、RNA等。本研究所用的3種DNA提取方法中，SDS法所得總DNA的D260 nm/D280 nm為1.78～1.84，說明純度較高，不會影響到下游PCR反應(yīng)。此外，DNA得率也是衡量提取方法優(yōu)劣的重要參數(shù)之一。植物總DNA得率與植物種類和來源存在一定的關(guān)系，不同物種的DNA得率不同，同一物種的不同部位，其DNA得率也存在差異，如侯艷霞等以一串紅的葉片、莖段、花為材料，比較5種方法對其DNA提取效果的影響，結(jié)果表明葉片較容易得到高質(zhì)量的DNA，莖段次之，花最差[9]。本研究選用的3個(gè)部位的植物材料中，葉的總DNA得率最高，為176.52～229.17 μg/g，莖次之，根最低。此外，植物材料的保存時(shí)間是影響總DNA得率的主要因素之一，保存的時(shí)間越長，DNA降解越嚴(yán)重，得率越低。郭紅媛等在棉花的總DNA提取過程中發(fā)現(xiàn)，老化或儲存時(shí)間較長的材料中，棉酚、多糖、單寧等次生代謝物質(zhì)含量較高，在提取過程中易與DNA結(jié)合，并且難以去除，嚴(yán)重影響了DNA的得率和質(zhì)量[20]。

本研究得到的廣藿香醇合成酶基因與已登錄的該基因存在一定的差異，不僅體現(xiàn)在有26個(gè)氨基酸序列不同，還體現(xiàn)在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上。PTS-1的二級結(jié)構(gòu)中，有363個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占65.76%，54個(gè)參與延伸鏈，占9.78%，42個(gè)參與β-轉(zhuǎn)角，占7.61%，93個(gè)參與無規(guī)則卷曲，占16.85%。而已登錄的廣藿香醇合成酶蛋白序列ABC87816的4種二級結(jié)構(gòu)中，有359個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占65.04%，50個(gè)參與延伸鏈，占9.06%，46個(gè)參與β-轉(zhuǎn)角，占8.33%，97個(gè)參與無規(guī)則卷曲，占16.85%。造成同一物種的同一基因序列和結(jié)構(gòu)差異的因素有很多。首先，同一物種不同部位的同一類型基因可能存在差異，如Vasiliki等在對番茄（Lycopersicon esculentum）不同器官的同一功能酶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在番茄中可以催化GPP形成芳樟醇的酶TPS37和TPS39，在序列上存在較大差異，前者在葉片、莖、花中都表達(dá)，而后者只在嫩葉和花中表達(dá)[21]。其次，同一物種不同品種的同一酶基因序列也可能存在差異，如Naoko等通過比較3種不同紫蘇（Perilla frutescens）品種合成的香葉醇合酶基因，發(fā)現(xiàn)不同紫蘇品種合成的香葉醇合酶蛋白序列存在 2%～3.2%的差異[22]。再者，同一物種不同生長環(huán)境，同一類型基因也可能存在差異，如王海波等通過對蘆葦（Phragmites Australis）Rubisco蛋白分子的研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)型的2種蘆葦（沙蘆和水蘆）的Rubisco蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，反映了該酶有基因表達(dá)的環(huán)境適應(yīng)[23]。本研究選用的材料為中國廣藿香，而NCBI已登錄的PTS基因序列是從印度廣藿香中克隆得到的，生長環(huán)境的不同可能是廣藿香PTS基因存在差異的主要原因。然而，PTS基因序列和結(jié)構(gòu)是否還存在其他影響因素，如不同取材部位等，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過本研究可以得出如下3個(gè)結(jié)論：其一，在所選用的3種方法中，SDS法可以高效一致地提取廣藿香根、莖、葉的基因組總DNA，而CTAB法不能從根中提取到DNA，且該法提取的葉總DNA存在降解，PEX法提取的根總DNA雜質(zhì)較多，降解嚴(yán)重。其二，廣藿香葉總DNA得率最高，其次是莖，根得率最低。其三，中國廣藿香PTS基因的DNA序列與印度廣藿香相比，有53個(gè)核酸存在差異，二者編碼的氨基酸序列有4.7%的差異，引起基因差異的具體原因，還需進(jìn)一步研究確定。

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