火焰南天竹葉片不定芽再生研究賈思振

王媛花++顏志明+++劉丹

摘要：以火焰南天竹組培苗葉片為外植體，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑、不同營養(yǎng)物質(zhì)、暗培養(yǎng)時間、接種方式對其不定芽再生的影響。結(jié)果表明：繼代30～35 d的火焰南天竹組培苗葉片適用于葉片不定芽再生；外植體在添加1.5 mg/L TDZ、0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)14 d，再生率可達80.6%，平均每張葉片的再生芽數(shù)達到3.1個，且玻璃化現(xiàn)象較少，為最佳組合；生根試驗表明，再生芽在1/2MS+0.4 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上生根效果最好，生根率可達76.3%。

關(guān)鍵詞：火焰南天竹；葉片再生；不定芽；生根

中圖分類號：S687.904+.3 文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0073-03

收稿日期：2015-07-24

基金項目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目（編號：110751038）。

作者簡介：賈思振（1982—），男，山東濟南人，碩士，講師，從事花卉栽培生理方面的研究。E-mail：93327862@qq.com?；鹧婺咸熘瘢∟andina domestica ‘Fire power）是一種新興的園藝品種，從國外引入我國栽培，現(xiàn)在大量用于園林景觀中?；鹧婺咸熘衲秃＞G，葉片橢圓或卵圓形，與原種披針形葉有明顯區(qū)別，這是優(yōu)于原種的重要性狀[1]?；鹧婺咸熘竦矫磕昵锾煊龅嚼淇諝猓~色便由綠色轉(zhuǎn)為鮮紅色，葉片顏色能夠持續(xù)到第二年初春，因此在南方地區(qū)具有極佳的觀賞效果。在園林綠化中，火焰南天竹可與山茶同時培植于樹壇中，也適宜種植在植物群落下層，豐富景觀層次。同時，火焰南天竹又是一種具有良好發(fā)展前途的盆栽植物，并有較高的藥用價值[2]。

目前關(guān)于火焰南天竹組織培養(yǎng)快繁的研究比較多，但是關(guān)于再生植株方面的報道很少。黃一青等雖通過誘導(dǎo)不定芽獲得再生植株，但繼代培養(yǎng)時間需45 d，芽的增殖系數(shù)僅2.5倍[3]，同時也未見有關(guān)生根率的報道，這樣在一定程度上限制了火焰南天竹試管苗的大面積推廣[1]。為了使火焰南天竹進行大面積推廣，增加繁殖速度，就需要對火焰南天竹進一步研究。隨著目前分子生物學(xué)的發(fā)展，基因改良是一個重要方向，因此研究火焰南天竹的基因改良也是今后的重要研究方向[4]。火焰南天竹抗寒性弱，是抑制其在北方推廣的重要因素，亟待利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進行遺傳改良，而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化有賴于良好的再生體系[5]。目前有關(guān)火焰南天竹葉盤再生不定芽的研究很少，可借鑒的方法也非常少，本研究建立了火焰南天竹穩(wěn)定高效的再生體系，再生率高達97.6%，為火焰南天竹的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料準(zhǔn)備

以火焰南天竹生長健壯的枝條上飽滿的頂芽為外植體，用流水沖洗3 h，氯化汞殺菌8 min后用無菌水沖洗6～8次，接取種到MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA的分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)5 d以后光下培養(yǎng)。接種15 d左右芽開始萌發(fā)，40 d后分化成為2～3 cm高的植株。將分化的小苗接種于 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的繼代培養(yǎng)基中，每35 d繼代1次。

培養(yǎng)基中附加30 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂，pH 值為5.8。培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度為25 μmol/（m2·s），光周期為16 h光照+8 h暗培養(yǎng)。MS1培養(yǎng)基用6.5 g/L硫酸銨代替MS培養(yǎng)基中的硝酸銨配成。

1.2火焰南天竹葉片不定芽分化

取30～35 d葉齡的組培苗上嫩綠、平展的葉片，剪去葉尖、葉緣，剪成大小為3 mm2均勻的葉塊，分別作以下處理：（1）將剪好的葉塊接種于附加不同濃度TDZ、6-BA、NAA、2，4-D、IAA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35 d以后，觀察葉片的生長狀態(tài)，分析不同的植物生長調(diào)節(jié)劑，以及植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度比例對火焰南天竹葉片不定芽再生的影響；（2）將剪好的葉塊分別接種于附加2.5 mg/L TDZ、0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基和硫酸銨代替硝酸銨的MS1培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)14 d，研究不同營養(yǎng)源對不定芽再生的影響；（3）將外植體分別接種于附加2.5 mg/L TDZ、0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上，分別進行不暗培養(yǎng)、暗培養(yǎng)7 d、暗培養(yǎng)14 d、暗培養(yǎng)21 d的處理，分析暗培養(yǎng)時間長短對火焰南天竹葉片不定芽再生造成的影響；（4）將葉片以近軸面貼近培養(yǎng)基（正放）、遠軸面貼近培養(yǎng)基（反放）2種放置方式接種于附加2.5 mg/L TDZ、0.2 mg/L 2，4-D的MS再生培養(yǎng)基上，分析研究不同的葉片放置方式對火焰南天竹不定芽再生的影響。

將外植體均接種于250 mL廣口玻璃瓶中，每個處理5瓶，重復(fù)3次。

1.3火焰南天竹再生不定芽的新梢伸長

再生45 d以后，火焰南天竹的不定芽一般長至1 cm左右，將這種不定芽接種到MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的芽伸長培養(yǎng)基中，不定芽進行大約30 d的伸長生長，長成株高約3 cm的植株。

1.4火焰南天竹再生不定芽生根培養(yǎng)

經(jīng)過伸長生長的植株，把新梢剪成1.0～1.5 cm長的莖段進行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基選用MS、1/2MS，培養(yǎng)基中分別添加不同濃度比例的IBA、NAA，每個處理5瓶，每瓶5個植株，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根率。

1.5評價指標(biāo)與數(shù)據(jù)調(diào)查

調(diào)查獲得的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，平均值進行Duncans測驗，得出顯著性差異?；緮?shù)據(jù)按照以下公式計算：

火焰南天竹不定芽再生率=（再生不定芽葉片總數(shù)/接種葉片總數(shù)）×100%；

火焰南天竹平均每外植體再生芽數(shù)=葉片再生不定芽總數(shù)/再生不定芽葉片數(shù)；

火焰南天竹再生不定芽生根率=（所有生根再生不定芽數(shù)/所有接種的再生不定芽數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同植物生長調(diào)節(jié)劑以及濃度配比對火焰南天竹不定芽再生的影響

由表1、圖1可見，不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類以及濃度配比對火焰南天竹葉片不定芽分化有重要影響。結(jié)果表明，TDZ比6-BA更適于不定芽再生；TDZ與2，4-D組合對火焰南天竹不定芽的誘導(dǎo)效果要好于TDZ與 NAA、IAA的組合。用2.5 mg/L TDZ、 0.2 mg/L 2，4-D的組合最適于火焰南天竹葉片不定芽分化，再生率可達97.6%，平均每塊葉片外植體再生芽數(shù)也較多（圖1-a、圖1-c）。但是試驗中發(fā)現(xiàn)，這個激素的濃度會造成部分芽玻璃化，玻璃化芽不能夠生根，因此不能夠用于后續(xù)試驗。

當(dāng)TDZ濃度達到1.5 mg/L時，與0.2 mg/L 2，4-D配合使用不定芽再生率可以達到80.6%，而且在這個激素濃度的培養(yǎng)基中玻璃化芽明顯減少。因此在試驗過程中，實際選擇這個培養(yǎng)基濃度來進行火焰南天竹的不定芽再生，雖然再生率有一定程度的降低，但是再生芽不發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，而且平均每塊葉片再生芽數(shù)也能達到3.1個（圖1-b、圖1-d）。TDZ濃度達到4.0 mg/L時，不定芽再生率顯著降低，而且玻璃化芽明顯增多。試驗結(jié)果表明，6-BA不適于火焰南天竹再生，添加6-BA的培養(yǎng)基中火焰南天竹葉片不定芽再生率、平均每塊葉片再生芽數(shù)都顯著低于添加TDZ的培養(yǎng)基。

2.2不同營養(yǎng)源對火焰南天竹不定芽再生的影響

用6.5 g/L的硫酸銨代替MS培養(yǎng)基中的硝酸銨，不定芽再生率顯著降低，說明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)對不定芽再生影響極大（表2）。有研究報道用硫酸銨代替硝酸銨繼代火焰南天竹，繼代苗生長正常，而本研究的再生試驗表明，此培養(yǎng)基不適于火焰南天竹再生。硝酸銨是培養(yǎng)基中氮元素的主要來源，用硫酸銨代替硝酸銨后，氮元素含量減少，再生率顯著降低，因此可見，氮元素在火焰南天竹不定芽再生中起重要作用。

2.3暗培養(yǎng)時間對火焰南天竹不定芽再生的影響

暗培養(yǎng)時間的長短對火焰南天竹不定芽的再生有顯著影響。不暗培養(yǎng)時不定芽再生率為0，暗培養(yǎng)時間短，不定芽再生率低，暗培養(yǎng)時間過長，不定芽再生率也會降低，最適的不定芽再生的暗培養(yǎng)時間為14 d，不定芽再生率可達82.1%（表3）。

2.4葉片放置方式對火焰南天竹不定芽再生的影響

葉片以正放、反放2種不同接種方式下的不定芽再生率

沒有顯著差異，說明葉片不同的放置方式對火焰南天竹不定芽的再生沒有影響（表4）。

2.5不同生長調(diào)節(jié)劑對火焰南天竹離體新梢生根的影響

離體新梢生根試驗表明，生長調(diào)節(jié)劑能明顯促進莖段不

表4葉片不同放置方式對火焰南天竹不定芽再生的影響

葉片放置方式不定芽再生率

（%）平均每外植體再生芽數(shù)

（個）正放85.4a3.2a反放86.8a3.3a

定根的形成。火焰南天竹在添加0.4 mg/L NAA的培養(yǎng)基中生根最早，接種后 20 d基部開始形成不定根；在添加 IBA 的培養(yǎng)基中根部形成大量愈傷，不易生根，說明NAA比IBA更適合火焰南天竹誘導(dǎo)不定根；基本培養(yǎng)基對生根也有明顯的影響，表5結(jié)果表明，1/2MS培養(yǎng)基有利于火焰南天竹生根。因此，適合火焰南天竹離體新梢生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L NAA。

3結(jié)論與討論

目前關(guān)于火焰南天竹離體葉片再生的研究很少，由于火焰南天竹的再生受基因型、環(huán)境條件的限制，因此其再生率很難達到很高的水平[6]。在現(xiàn)有的報道中，大多數(shù)仍然集中于研究火焰南天竹的快繁，很少有再生研究的相關(guān)內(nèi)容。本研究表明，影響火焰南天竹葉片再生的因素很多，包括植物生長調(diào)節(jié)劑、暗培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)等，這些條件對火焰南天竹離體器官的再生都起著決定性的作用，任何一個條件發(fā)生變化，都可能造成火焰南天竹再生率的下降或者完全不再生。

在添加1.5 mg/L TDZ、0.2 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上，火焰南天竹再生率可達到80.6%，每塊葉片外植體再生芽數(shù)達到3.1個，而且玻璃化現(xiàn)象較少。植物再生過程中，不但要選擇合適的植物生長調(diào)節(jié)劑，而且濃度比例也非常重要，一般植物再生中的細胞分裂素、生長素的濃度比例需要控制在一個合理范圍[7]。本研究也選取了多種細胞分裂素、生長素，對其濃度比例進行了多次嘗試，最終確定TDZ與2，4-D的濃度比例為12.5 ∶1時再生率最高。

暗培養(yǎng)是影響不定芽分化的一個重要因素。一些研究表明暗培養(yǎng)可能促進不定芽的再生[7]。本試驗結(jié)果表明，火焰南天竹必須暗培養(yǎng)14 d才能獲得較高的再生率。

營養(yǎng)元素對火焰南天竹不定芽再生有顯著影響，以硫酸銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基可以用來繼代草莓、葡萄，在這個條件下的組培苗均能正常生長[8]。而在本試驗中，硫酸銨代替硝酸銨對火焰南天竹的再生有極大影響，原因有待于進一步研究。葉片接種方式對再生不定芽的影響因植物種類和品種的不同而異，有些植物的再生不受葉片放置方式的影響，而有些則影響較大[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)火焰南天竹葉片接種方式對葉片再生無顯著影響。

本試驗獲得的火焰南天竹再生率高達97.6%，在目前能夠查到的火焰南天竹再生的報道中最高。這說明，盡管火焰南天竹葉片不定芽分化再生困難，但只要有合適的培養(yǎng)條件，可以進一步提高葉片不定芽的再生率，克服火焰南天竹離體再生困難的問題。

參考文獻：

[1]李慧. 彩葉樹種火焰南天竹的離體快繁研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：74-76.

[2]杜永芹，倪林娟，王玉勤. 耐寒彩葉樹種火焰南天竹的快繁技術(shù)研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，20（4）：1-4.

[3]周南镚，黃一青，王青華. 火焰南天竹的組織培養(yǎng)[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2002（11）：17.

[4]王蒂. 植物組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：301.

[5]張麗麗，張明明. 木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)在林業(yè)科研與生產(chǎn)中的應(yīng)用與局限[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2015，30（9）：74-74，75.

[6]曹昆，李霞. 木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)研究進展[J]. 江蘇林業(yè)科技，2008，35（5）：43-48.

[7]韓小嬌，楊洪強，由淑貞，等. 平邑甜茶葉片不定芽再生及NO的效應(yīng)[J]. 園藝學(xué)報，2008，35（3）：419-422.

[8]魏國芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，26（2）：103-108.

[9]王媛花，齊娟紅，范艷珍，等. 硫酸銨或尿素代替硝酸銨的MS培養(yǎng)基對蘋果、草莓和葡萄組培苗繼代的效應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)通訊，2009，45（7）：702-704.張振霞，葉靜鵬，鄭莉，等. 廣山藥組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：76-80.