發(fā)光細(xì)菌及其在環(huán)境、食品和飼料檢測(cè)中的應(yīng)用

廖德豐

(譜尼測(cè)試集團(tuán)上海有限公司 200030)

1 發(fā)光菌發(fā)光機(jī)理、發(fā)光特性、影響因素和發(fā)光基因

1.1 發(fā)光機(jī)理 發(fā)光菌能夠以長(zhǎng)鏈脂肪醛(LE)、分子氧和還原型黃素單核苷酸(FMNH2)為底物，在熒光素酶的催化作用下，產(chǎn)生波長(zhǎng)約為450～490 nm藍(lán)綠光。反應(yīng)過(guò)程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCHO→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE·FMN+H2O+RCOOH+光，其中三步反應(yīng)產(chǎn)生的三種中間產(chǎn)物的壽命極短，很難分離出來(lái)。發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光是一種化學(xué)發(fā)光,是化學(xué)能以光輻射的方式的釋放。發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)含有熒光素和熒光素酶,熒光素受到熒光素酶的催化作用而吸收能量,變成氧化型激發(fā)態(tài)熒光素，隨即退激發(fā)射光子而發(fā)光。熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類(lèi)酶，細(xì)菌熒光素酶是含α、β兩個(gè)多肽亞基的單加氧酶，只有兩個(gè)亞基共存時(shí)才有活性。從不同海洋細(xì)菌中提取的熒光素酶的分子量差別不大。

1.2 發(fā)光特性 不同種類(lèi)的發(fā)光菌有不同的熒光素酶,發(fā)光特性也不同。以最大發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)說(shuō),弧菌屬為482～485 nm,發(fā)光桿菌屬則在474～480 nm。其中費(fèi)氏弧菌最大發(fā)射波長(zhǎng)為482 nm，東方弧菌最大發(fā)射波長(zhǎng)為(484±1) nm,半峰全寬為(92±1) nm，青海弧菌最大發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm，明亮發(fā)光桿菌最大發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm左右。朱文杰等從東方弧菌的細(xì)胞裂解液中分離到一種組分,僅需長(zhǎng)鏈脂肪醛就可以啟動(dòng)發(fā)光,其最大發(fā)射峰在480～490 nm。提取物的吸收光譜顯示在414 nm處有一最大吸收峰,在380 nm和485 nm處各有一個(gè)弱吸收峰;提取物與醛反應(yīng)后，吸收光譜除380 nm峰消失外,其余不變。汪杰等[1]檢測(cè)了明亮發(fā)光桿菌、鰏魚(yú)發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌和青海弧菌生物發(fā)光的一階和二階微分光譜。結(jié)果表明，不同種的發(fā)光細(xì)菌的微分光譜有顯著差異，同一種菌的不同菌株無(wú)顯著差異，提示生物發(fā)光光譜可作為發(fā)光細(xì)菌菌種分類(lèi)的特征。

1.3 影響因素 發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞的代謝活性直接相關(guān)，環(huán)境因素會(huì)影響發(fā)光菌的生長(zhǎng)和發(fā)光。杜宗軍等從青島近海海洋沉積物中分離出一株海洋發(fā)光菌——弧菌屬的哈維氏發(fā)光弧菌，該菌在pH7. 5、溫度30℃、氯化鈉濃度3.0%時(shí),發(fā)光強(qiáng)度最高;正常發(fā)光的溫度在20℃～40℃、pH6.0～8.0; 液體培養(yǎng)4 h后開(kāi)始發(fā)光, 6 h后發(fā)光達(dá)到峰值,持續(xù)發(fā)光時(shí)間可達(dá)19 h。水體的pH、溫度、鹽度和營(yíng)養(yǎng)成分等環(huán)境條件的變化將引起熒光素酶的改變,從而改變細(xì)菌的發(fā)光特性。方宏達(dá)等分離到一株海洋發(fā)光弧菌，它在35℃、pH7.0、氯化鈉濃度2.0%時(shí)生長(zhǎng)最好，在20℃、pH5～6、氯化鈉濃度3.0%、細(xì)菌密度OD600達(dá)0.08時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最高。當(dāng)發(fā)光弧菌的密度OD600達(dá)到0.08時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度有一個(gè)突發(fā)式的增強(qiáng)過(guò)程，這個(gè)現(xiàn)象表明這些菌的發(fā)光可能受到細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。密度感應(yīng)是細(xì)菌感受種群密度的變化而控制特定基因表達(dá)的一種機(jī)制。自由生活的哈維氏弧菌可以利用密度感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)控制發(fā)光。

青?；【纳L(zhǎng)受甘油影響最大，發(fā)光受氮源影響最大，其生長(zhǎng)和發(fā)光不同步，發(fā)光強(qiáng)度到對(duì)數(shù)中期才迅速增加，并在對(duì)數(shù)后期達(dá)到頂峰，然后很快下降。由此看來(lái)，青?；【鸁晒饷傅暮铣蓪儆谡T導(dǎo)型。甘油和少量氯化鈉有利于青?；【纳L(zhǎng)和發(fā)光。在許多方面環(huán)境因子對(duì)青?；【纳L(zhǎng)和發(fā)光的影響與海洋發(fā)光菌中誘導(dǎo)型發(fā)光型相似，可能的原因是它們的受影響機(jī)制相似，但在鹽度、溫度和pH等方面，青?；【c海洋發(fā)光菌不同，青海弧菌適宜的溫度和pH范圍比海洋發(fā)光菌寬，對(duì)氯化鈉的要求很低，可能是因?yàn)樗鼈冮L(zhǎng)期適應(yīng)于不同的環(huán)境。

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度在一定實(shí)驗(yàn)條件下是恒定的，當(dāng)發(fā)光菌接觸外來(lái)物質(zhì)時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度改變。有毒物質(zhì)會(huì)使發(fā)光菌細(xì)胞的代謝活性下降，發(fā)光強(qiáng)度下降，因此發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的變化能夠準(zhǔn)確、快速地反映外來(lái)物質(zhì)的毒性。

1.4 發(fā)光基因 目前對(duì)發(fā)光菌的研究已經(jīng)達(dá)到基因水平，細(xì)菌發(fā)光是其發(fā)光基因及其操縱子表達(dá)調(diào)控的結(jié)果。發(fā)光細(xì)菌發(fā)光離不開(kāi)熒光素酶，研究發(fā)現(xiàn),編碼熒光素酶的基因是luxA和luxB。發(fā)光基因包括結(jié)構(gòu)基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE(為在操縱子上的排列順序)和調(diào)節(jié)基因luxI和luxR等，luxC和luxD位于luxA和luxB基因的上游一側(cè)，luxE基因位于luxA和luxB基因的下游一側(cè)。luxC、luxD、luxA、luxB和luxE這5個(gè)結(jié)構(gòu)基因存在于已知的所有發(fā)光細(xì)菌中。在lux操縱子中，luxA和luxB是緊密相連的。例如，哈維氏弧菌的luxA基因中含有1065個(gè)堿基對(duì)(bp)，編碼的熒光酶α亞基是355個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為40 kD；luxB基因中含有972 bp，編碼的熒光酶β亞基是324個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為36 kD，由α、β兩亞基組成的熒光酶的分子量為76 kD。luxC和luxD分別編碼脂肪酸還原酶和多肽轉(zhuǎn)移酶，luxE編碼合成酶。luxC含有1431 bp，編碼含有477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為55 kD；luxD編碼分子量為33 kD的蛋白質(zhì)；luxE編碼分子量為42 kD的蛋白質(zhì)。發(fā)光細(xì)菌發(fā)光基因的種類(lèi)和數(shù)量因發(fā)光細(xì)菌的種類(lèi)而異。例如，luxF僅發(fā)現(xiàn)于明亮發(fā)光桿菌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌有3個(gè)平行密度感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)控制熒光素酶的結(jié)構(gòu)操縱子的密度依賴(lài)性表達(dá)，每個(gè)系統(tǒng)都由傳感器和相應(yīng)的自誘導(dǎo)分子組成。

王妍穩(wěn)等[2]將luxA和luxB克隆到表達(dá)載體PHSG396中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)。羅愛(ài)紅等[3]將青海弧菌Q67熒光素酶基因luxA和luxB和結(jié)構(gòu)基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE分別在大腸桿菌中表達(dá)，在相同培養(yǎng)條件下,luxA和luxB重組菌比luxA、luxB、luxC、luxD、luxE重組菌獲得更大的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度,說(shuō)明luxA和luxB重組菌表達(dá)效果更好。重金屬Cd2+、Hg2+和Cr6+對(duì)重組菌的毒性影響檢測(cè)表明,luxA和luxB重組菌得到了更低的半有效濃度(EC50)。魏永濤通過(guò)三親本雜交的方法將標(biāo)記基因luxA和luxB接合轉(zhuǎn)移進(jìn)熒光假單胞CP1108菌株，所得的標(biāo)記菌株CP1108L具有發(fā)光活性，轉(zhuǎn)移頻率為(4.65±0.01)×105。將標(biāo)記菌株連續(xù)進(jìn)行20 次傳代，各代菌株均可檢測(cè)到發(fā)光現(xiàn)象。

luxI編碼發(fā)光細(xì)菌自誘導(dǎo)物因子合成酶，luxR編碼發(fā)光系統(tǒng)的調(diào)節(jié)蛋白。luxI和luxR基因的表達(dá)產(chǎn)物都是lux系統(tǒng)完整表達(dá)并產(chǎn)生發(fā)光的調(diào)節(jié)物質(zhì)，任何一個(gè)基因的有效突變都會(huì)改變lux系統(tǒng)的表達(dá)水平，甚至使發(fā)光細(xì)菌變?yōu)榘底兎N。

2 發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境、食品和飼料檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 環(huán)境檢測(cè) 利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度作為指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的有毒物質(zhì)，在國(guó)內(nèi)外越來(lái)越受到重視，發(fā)光細(xì)菌法已經(jīng)廣泛用于環(huán)境中的重金屬、抗生素、農(nóng)藥等檢測(cè)，可分析空氣、土壤和水等樣品。汽車(chē)尾氣、香煙煙霧和氨氣等對(duì)細(xì)菌發(fā)光有不同程度的抑制作用，時(shí)間和劑量效應(yīng)明顯。吳淑杭等[4]以明亮發(fā)光桿菌T3變種作為測(cè)試菌，發(fā)現(xiàn)單一重金屬Hg2+、Cd2+與 Cr6+對(duì)明亮發(fā)光桿菌的毒性有顯著的正效應(yīng),毒性從大至小依次為Hg2+、Cd2+和Cr6+,對(duì)明亮發(fā)光桿菌的EC50分別為0.044 mg/L、6.05 mg/L和30.65 mg/L，總體上, Hg2+與Cd2+以及Cd2+與Cr6+之間為加和作用,而Hg2+與Cr6+之間以拮抗作用為主。研究發(fā)現(xiàn)，明亮發(fā)光桿菌T3的相對(duì)發(fā)光率與硝酸鹽、氟化物和敵百蟲(chóng)的濃度呈負(fù)相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為-0.90～-0.99。硝酸鹽、氟化物和敵百蟲(chóng)作用15 min時(shí)使發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生50%光損失時(shí)的濃度(EC5015 min值)分別為2210.00 mg/L、245.2 mg/L和8880.28 mg/L。

抗生素和農(nóng)藥廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，污染問(wèn)題引起廣泛的關(guān)注。朱祥偉等[5]以毒物對(duì)青?；【鶴67發(fā)光抑制為毒性指標(biāo)，測(cè)定了吡蟲(chóng)啉(IMI)、抗蚜威(PIR)、啶蟲(chóng)脒(ACE)及敵百蟲(chóng)(DIP) 4種殺蟲(chóng)劑和氯霉素(CHL)、鹽酸四環(huán)素(TET)、硫酸鏈霉素(STR)及硫酸巴龍霉素(PAR) 4種抗生素的短期(15 min)毒性和長(zhǎng)期(12 h)毒性。采用短期毒性與長(zhǎng)期毒性EC50之比為指標(biāo)，表征同一物質(zhì)的毒性差異。結(jié)果表明：3種殺蟲(chóng)劑(IMI、ACE和PIR)的短期毒性與長(zhǎng)期毒性差異不大；殺蟲(chóng)劑DIP和抗生素CHL及TET的短期毒性與長(zhǎng)期毒性差異明顯；抗生素STR和PAR只有較強(qiáng)的長(zhǎng)期毒性。楊潔等[6]采用青海弧菌Q67 作為測(cè)試菌劑,作用時(shí)間為15 min。結(jié)果表明，5種可溶農(nóng)藥對(duì)青海弧菌Q67的毒性從高到低依次為敵敵畏、敵百蟲(chóng)、殺蟲(chóng)單、樂(lè)果、乙酰甲胺磷；6種難溶于水農(nóng)藥的毒性從高到低依次為甲氨基阿維菌素、甲胺磷、莎稗磷、高效氯氰菊酯、惡霜靈、氰戊菊酯。中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所研制出GXY-2型生物毒性測(cè)定儀，已經(jīng)有學(xué)者將此儀器和明亮發(fā)光桿菌用于評(píng)價(jià)工業(yè)廢水和重金屬污染土壤的毒性。

在水質(zhì)分析中,應(yīng)用浮游生物、藻類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等水生生物進(jìn)行毒性檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高,而發(fā)光菌毒性檢測(cè)法具有靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快、成本低廉、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。謝海平等[7]分別利用從發(fā)光魚(yú)肉中分離得到的一株鰒發(fā)光桿菌N1株和美國(guó)Microtox急性毒性檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)珠江陸源入海排污口污水進(jìn)行了急性毒性對(duì)比測(cè)試。結(jié)果表明,利用鰒發(fā)光桿菌N1株的急性毒性測(cè)試結(jié)果和美國(guó)Microtox毒性檢測(cè)系統(tǒng)的急性毒性測(cè)試結(jié)果有較好的相關(guān)性;依據(jù)毒性大小進(jìn)行排序,珠江陸源入海排污口9個(gè)監(jiān)測(cè)站位污水的急性毒性測(cè)試數(shù)據(jù)中，有6個(gè)監(jiān)測(cè)站位的排序結(jié)果在兩種測(cè)試間相一致。

2.2 食品檢測(cè) 食品安全已成為社會(huì)普遍關(guān)注的問(wèn)題。在檢測(cè)不明毒性物質(zhì)的情況下,發(fā)光菌法檢測(cè)比化學(xué)分析或儀器法檢測(cè),在檢測(cè)速度、操作的便捷程度和綜合性評(píng)價(jià)上更具優(yōu)勢(shì)。

食品中過(guò)量食品添加劑會(huì)危害人體健康，發(fā)光菌法已經(jīng)用于檢測(cè)食品添加劑。郭柔杉等[8]將發(fā)光菌法應(yīng)用于果汁中亞硝酸鈉綜合毒性的檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強(qiáng)度抑制率與亞硝酸鈉溶液質(zhì)量濃度呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.9533～0.9573,最佳檢測(cè)平衡時(shí)間為15 min,誤差限范圍為0.6150～2.3466;發(fā)光強(qiáng)度抑制率與果汁中亞硝酸鈉質(zhì)量濃度同樣呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.9555～0.9970,最佳檢測(cè)平衡時(shí)間為15 min,誤差限范圍為0.0852～2.4483。郭柔杉等[9]利用發(fā)光費(fèi)氏弧菌評(píng)價(jià)常用色素毒性，發(fā)現(xiàn)色素溶液質(zhì)量濃度與發(fā)光抑制率呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)在0.8760～0.9873之間,EC50范圍在0.72～2.86 mg/L之間; 果汁中色素質(zhì)量濃度與發(fā)光抑制率呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)在0.9136～0.9951之間,EC50值在1.02～2.96 mg/L之間。

食品中抗生素、獸藥和農(nóng)藥殘留是食品安全關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。發(fā)光菌法測(cè)定食品中抗生素、獸藥和農(nóng)藥殘留具有快速、簡(jiǎn)單和價(jià)廉等特點(diǎn)。朱金國(guó)等[10]利用明亮發(fā)光桿菌建立了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)四環(huán)素族抗生素體系。結(jié)果表明，當(dāng)金霉素、土霉素和四環(huán)素濃度在0.00625～1 μg/mL范圍內(nèi)，發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制與這些抗生素的濃度均呈良好的線性關(guān)系；該體系對(duì)四環(huán)素族抗生素的檢測(cè)靈敏度可達(dá) 0.00625μg/mL,比傳統(tǒng)的杯碟法高5倍，具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。王亞群等[11]從青島近海分離篩選出1株對(duì)氯霉素敏感的鰒發(fā)光桿菌，發(fā)現(xiàn)氯霉素濃度與細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度抑制率呈良好的線性關(guān)系。該方法的線性范圍為0.1～1.0 ng/mL,相關(guān)系數(shù)R2為0.989,檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1 ng/mL。石穎等[15]發(fā)現(xiàn)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星濃度分別為20～2000 mg/L、100～10000 mg/L、20～200 mg/L、10～1000 mg/L和10～1000 mg/L時(shí),青?；【南鄬?duì)發(fā)光率隨這些獸藥質(zhì)量濃度的降低而增加;暴露時(shí)間為15 min時(shí),8種獸藥對(duì)青?；【募毙远拘源笮∫来螢檫秽蛲?左氧氟沙星>諾氟沙星>磺胺六甲氧嘧啶鈉>沙拉沙星>恩諾沙星>環(huán)丙沙星>磺胺間甲氧嘧啶納，毒性最強(qiáng)的呋喃唑酮的EC50值不足毒性最小的磺胺間甲氧嘧啶納的EC50值1/1000，這與農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定的禁止呋喃唑酮用于所有動(dòng)物性食品中相吻合。吳淑杭初步建立了青?；【⒚髁涟l(fā)光桿菌T3變種發(fā)光細(xì)菌法農(nóng)產(chǎn)品食用安全性快速評(píng)價(jià)體系，包括發(fā)光細(xì)菌法牛奶、鮮豬肉和牛肉食用安全性快速評(píng)價(jià)方法。另?yè)?jù)報(bào)道，GXY-2生物毒性測(cè)定儀和明亮發(fā)光桿菌已經(jīng)用于快速檢測(cè)蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。

發(fā)光菌法可以快速檢測(cè)飲用水綜合毒性。王曉媛等[13]報(bào)道采用以青?；【鶴67為檢測(cè)試劑的水質(zhì)毒性檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)汶川地震災(zāi)區(qū)居民126個(gè)飲用水源進(jìn)行急性毒性的測(cè)定，同時(shí)與當(dāng)?shù)貦z測(cè)部門(mén)的理化檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，現(xiàn)場(chǎng)急性綜合毒性快速檢測(cè)在這次突發(fā)事件中起到了樣品的毒性快速初篩的作用，在很大程度上及時(shí)保證了當(dāng)?shù)鼐用竦娘嬎踩⒋蟠鬁p輕當(dāng)?shù)丶部厝藛T工作負(fù)擔(dān)。

2.3 飼料檢測(cè) 發(fā)光菌法不但可以用于食品檢測(cè)，而且可以用于飼料檢測(cè)。陳俏梅等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)光菌對(duì)苯酚、滅害靈和Pb2+、Zn2+、Cr+金屬離子敏感。在所測(cè)定的范圍內(nèi) ,其發(fā)光強(qiáng)度隨有毒物質(zhì)濃度增加而減弱，相關(guān)系數(shù)在0.92以上；以Hg2 +為毒性對(duì)照物；對(duì)10種飼料原料和3種人用食品進(jìn)行測(cè)定，其中脫水蔬菜相對(duì)抑光率最大，為 39.74%，相當(dāng)于1.85×10-5% Hg2 +的表征毒性 ,提示該樣品可能受到農(nóng)藥和化肥等較嚴(yán)重的污染。研究結(jié)果表明鹽酸金霉素、吉他霉素、鹽霉素、黃霉素對(duì)明亮發(fā)光桿菌的急性毒性EC50分別為9.21mg/L、146.13mg/L、4.24 mg/L和134.68 mg/L；發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨著這些抗生素濃度的增加而降低,并分別在2～16 mg/L、25～200 mg/L、1～8 mg/L和25～200 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。